一种毛发状亲水聚合物杂化磁性颗粒固定化蛋白酶及其制备方法[0002]作为后基因组时代的重点研究领域，蛋白质组学研究不仅能为生命活动规律的阐明提供理论基础，也能为众多种疾病的早期诊断、药靶的发现、疗效判断和预后提供了重要依据。自2001年被“科学”杂志评为21世纪的六大热点研究领域后，蛋白质组学研究受到了科学家的广泛关注。目前，基于“鸟枪法”的蛋白质组鉴定策略是应用最为广泛和成功的复杂蛋白质组样品的定性、定量研究策略。这一策略依赖于蛋白酶对蛋白质的位点特异性酶解反应，从而将蛋白质酶解为与质谱鉴定更为兼容的多肽，通过对多肽的质谱分析，获得相应的蛋白质的定性和定量信息。因此蛋白质的酶解效率和完全性是蛋白质组研究中样品制备过程中的关键步骤，对最终鉴定结果的可靠性和准确性有着至关重要的影响。传统的溶液酶解方法为了避免蛋白酶自切，往往使用较低的蛋白酶比例(蛋白酶:底物=I: 50)，因此需要较长的孵育时间(12-20小时)，限制了样本的分析通量和酶解完全性，无法满足蛋白组学大规模、高通量定性和高准确度定量分析的要求。[0003]基于以上原因，发展快速、高效的蛋白质酶解技术，对于复杂蛋白质组样品的分析是十分必要的。固定化酶技术避免了传统溶液酶解中普遍存在的酶自切的问题，因此可使用的酶浓度获得了提高，加快了酶解反应的进程，而且具有可回收并重复使用等诸多优点。在众多的固定化酶载体材料，如聚合物膜，整体柱材料，多孔材料中(Xu，F.et al.Anal.Chem.2010,82,10045-10051.Spross, J.et al.Anal.Chem.2010,82,1434-1443.Qian, K.etal.Anal.Chem.2009，81，5749-5756.)，磁性纳米颗粒因为其较大的比表面积以及易于实现磁性分离等特性凸显优势(Lin，S.et al.J.Proteome Res.2008, 7,1297-1307.)。但目前普遍采用的在基体材料表面直接进行单层酶固定的方法，使单位质量固定化酶材料的酶固载量受到基体材料表面积的限制，因而限制了酶解效率的进一步提高。同时，常用的硅或疏水聚合物基体材料难以避免对蛋白质及其酶解产物产生非特异性吸附，导致样品损失，从而影响蛋白质鉴定的灵敏度和定量的`准确度。[0004]原子转移自由基聚合法(AtomTransfer Radical Polymerization, ATRP)是Matyjaszewki K.教授小组于1995年首次提出的一种可控自由基聚合方法。十余年以来得到了国际学术界和工业界的广泛关注。ATRP方法具有产物聚合物结构可控性好、分子量分布窄、适用单体范围广、反应条件要求适中等特点。表面引发原子转移自由基聚合法(S1-ATRP)是将ATRP引发剂固定于材料表面后原位引发聚合物生长的一种方法，现已广泛应用于材料的表面修饰与功能化。
[0005]本发明的目的是提供一种毛发状亲水聚合物杂化磁性纳米颗粒固定化酶及其制备方法。[0006]本发明所提供的毛发状亲水聚合物杂化磁性纳米颗粒固定化酶是按照包括下述步骤的方法制备得到的:[0007]I)合成一种一端为能与二氧化硅包裹磁性纳米颗粒结合的硅烷偶联剂、另一端为原子转移自由基聚合(ATRP)引发剂的表面引发原子转移自由基聚合(S1-ATRP)引发剂；
[0008]2)使所述S1-ATRP引发剂中的硅烷偶联剂与二氧化硅包裹的磁性纳米颗粒表面的硅羟基反应，从而将S1-ATRP引发剂共价连接于所述二氧化硅包裹的磁性纳米颗粒表面；
[0009]3)在单体和催化剂体系存在下，于步骤2)得到的二氧化硅包裹的磁性纳米颗粒表面引发原子转移自由基聚合反应，在其表面原位生成毛发状聚合物链；其中，所述单体为能用于原子转移自由基聚合的单体，且在所述单体中含有能与待固定化的酶反应的官能团或在所述单体中含有经化学修饰后能与待固定化的酶反应的官能团；
[0010]4)分为下述a)或b):
[0011]a)步骤3)中所述单体中含有能与待固定化的酶反应的官能团，使步骤3)中所述聚合物链上的官能团与待固定化的酶反应，将酶连接到所述聚合物链上，再将所述聚合物链上未与酶反应的官能团封闭，得到所述聚合物杂化磁性纳米颗粒固定化酶；
[0012]b)步骤3)中所述单体中含有经化学修饰后能与待固定化的酶反应的官能团，将步骤3)中所述聚合物链上的官能团进行化学修饰，使其转变为能与待固定化的酶反应的官能团，然后再与待固定化的酶反应，将酶连接到所述聚合物链上，再将所述聚合物链上未与酶反应的官能团封闭，得到所述聚合物杂化磁性纳米颗粒固定化酶。
[0013]其中，步骤I)中所述S1-ATRP引发剂具体可由3-氨基丙基三乙氧基硅烷(硅烷偶联剂)与2-溴异丁酰溴(ATRP引发剂)通过氨基与酰溴反应生成酰胺键得到。并通过S1-ATRP引发剂中的硅烷偶联剂与包裹了二氧化硅的磁性颗粒表面的硅羟基发生脱水反应生成硅氧键，从而将S1-ATRP引发剂共价键合到磁性颗粒表面。
[0014] 步骤2)中所述磁性纳米颗粒具体可为四氧化三铁磁性纳米颗粒，其粒径可为20nm,经二氧化娃包裹后粒径为57.4nm。
[0015]步骤3)中所述单体优选为亲水性单体，具体可为:甲基丙烯酰胺葡萄糖(GMA-G)、丙烯酸类单体、丁烯酸类单体或戊烯酸类单体等。所述GMA-G单体是由甲基丙烯酸缩水甘油酯被氧化生成醛基后和氨基葡萄糖上的氨基反应获得的。当采用GMA-G单体制备聚合物链时，制备完成后需将亲水聚合物侧链上的葡萄糖中的邻二醇结构氧化为醛基，然后与待固定化的酶反应(当连接的酶为胰蛋白时，是利用醛基与蛋白酶的N-端和侧链氨基反应)，将酶连接到所述聚合物链上，再将聚合物链上剩余的醛基用氨基乙醇封闭。
[0016]步骤3)中所述催化剂体系由催化剂和配体组成。所述催化剂选自下述任意一种金属的卤化物:Cu、Mo (IV)、Ru、Rh、Fe、Re、N1、Pd和pb ;优选氯化亚铜。
[0017]所述配体选自下述任意一种:1，1，4，7，7-五甲基二亚乙基三胺、联吡啶、四甲基乙二胺、1，1，4，7，10，10_六甲基三亚乙基四胺和三(N，N—二甲基氨基乙基)胺。所述单体、催化剂、配体的摩尔比可为200: (0.5-5): (0.75-7.5)。
[0018]在步骤3)中，单体加入量相对于表面连接S1-ATRP引发剂的磁性纳米颗粒是过量的。以GMA-G单体为例，GMA-G单体与磁性纳米颗粒的配比可为2mmol: 50mg。[0019]本发明中用于固定化的酶包括各种蛋白酶，如胰蛋白酶、蛋白内切酶(Glu-C)、胞内蛋白酶(Lys-c)等；及糖苷酶,如肽N-糖苷酶F(PNGase F)等。
[0020]本发明所提供的亲水聚合物杂化磁性颗粒固定化酶可用于蛋白质的快速酶解。仅需将变性的蛋白质样品与亲水聚合物杂化磁性颗粒固定化酶溶解于50mM碳酸氢铵(pH =
8.0)或磷酸盐(pH = 7.8)缓冲液中并混合均匀，37°C水浴孵育1-2分钟即可完成酶解。通常使用1-1Omg颗粒固定化酶可对100 μ g蛋白质实现有效酶解。酶解完成后，可使用磁铁将磁性颗粒固定化酶吸附在管壁上，并吸取上层清液中的酶解产物。简便、快捷的实现固定化酶与酶解产物的分离，并将固定化酶回收、重复使用。该亲水聚合物杂化磁性颗粒固定化酶一般可重复使用50次左右。每次酶解蛋白质后，使用50mM碳酸氢铵(pH = 8.0)将固定化酶清洗3次，去除残留的肽段。之后将其保存在4°C冰箱中。
[0021]本发明所提供的亲水聚合物杂化磁性颗粒固定化酶也可用于蛋白质的高效、完全酶解。以牛血清白蛋白(BSA)为样本，固定化酶酶解产物中鉴定到的肽段对BSA的序列覆盖率可达93% ;对复杂蛋白质样本酶解后，采用SDS-PAGE对酶解产物分析，无明显蛋白残
&3甶O
[0022]单一蛋白质酶解反应:以牛血清白蛋白为例。将牛血清白蛋白(BSA)，溶解于50mM碳酸氢铵(pH = 8.0)或磷酸盐缓冲液(pH = 7.8)中，浓度为0.5mg/ml。加入二硫苏糖醇(DTT, IOmM)后，再置于沸水中加热变性lOmin，待冷却后加入碘乙酰胺(IAA，50mM)，暗处放置lh。将亲水聚合物杂化磁性颗粒固定化胰蛋白酶(碳酸氢铵缓冲液)或固定化蛋白质内切酶Glu-C(磷酸盐缓冲液)加入变性的蛋白质样品溶液中并混合均匀，37°C水浴孵育I分钟后，使用磁铁将磁性颗粒固定化酶吸附在管壁上，并吸取上层清液中的酶解产物。
`[0023]复杂蛋白质样本酶解反应:以腾冲嗜热菌全蛋白为例:在腾冲嗜热菌全蛋白样本中加入DTT (IOmM)，在37°C水浴中还原4h后，冷却至室温，加入IAA (50mM)，暗处放置Ih进行烷基化。将变性的蛋白质样品与亲水聚合物杂化磁性颗粒固定化胰蛋白酶溶解于50mM碳酸氢铵(PH = 8.0)中并混合均匀，37°C水浴孵育2分钟后，使用磁铁将磁性颗粒固定化酶吸附在管壁上，并吸取上层清液中的酶解产物。
[0024]将酶解产物点于基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪靶上，加入基质进行质谱分析；或将酶解产物使用液相色谱-电喷雾质谱联用进行分析。
[0025]以GMA-G为聚合单体，制备毛发状亲水聚合物杂化磁性纳米颗粒固定化胰蛋白酶和固定化蛋白内切酶(Glu-C)为例，对本发明方法的原理进行如下说明:
[0026]如图1所示，首先将硅烷偶联剂与ATRP引发剂通过酰胺键共价偶联合成S1-ATRP引发剂。之后通过硅烷偶联剂与硅羟基反应将S1-ATRP引发剂固定到二氧化硅包裹的磁性纳米颗粒表面。之后以丙烯酸缩水甘油酯类试剂与氨基葡萄糖反应生成的亲水试剂GMA-G为单体，氯化亚铜为催化剂，1，1，4，7，7-五甲基二亚乙基三胺为配体(按照200: I: 1.5的摩尔比)，与固定了引发剂的磁性纳米颗粒混合均匀，引发S1-ATRP反应，在磁性颗粒表面原位生成大量毛发状聚甲基丙烯酰胺葡糖糖聚合物链，之后将聚合物侧链葡萄糖上的邻二羟基基团通过高碘酸钠氧化反应，转化为醛基，并利用两弗碱反应将所引入的醛基与蛋白酶的N-端或侧链氨基反应，将其固定于亲水聚合物侧链上。
[0027]使用时，直接将蛋白质与亲水聚合物杂化磁性颗粒固定酶混合均匀，在37°C水浴中孵育1-2分钟，即可完成酶解。之后取出管中的酶解产物点于基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪靶上，进行质谱分析。也可使用色谱自动进样系统，进行液相色谱-电喷雾质谱联用分析。
[0028]本发明提供的技术方案具有以下优点:
[0029]1、二氧化硅包裹的磁性纳米颗粒表面由S1-ATRP法制备的毛发状亲水聚合物链所修饰，聚合物侧链带有大量醛基官能团，而且非交联的毛发状亲水聚合物链还可支持三维立体化、多层蛋白酶固定。因此，与采用传统单层覆盖模式制备的固定化酶相比，该毛发状亲水聚合物杂化磁性颗粒固定化酶可明显提高的蛋白酶的固载量。
[0030]2、与传统固定化酶将蛋白酶固定于坚硬基体材料表面相比，此亲水聚合物杂化磁性颗粒固定化酶中的蛋白酶固定于柔软的聚合物链上，具有更大的自由度，有利于酶与蛋白质底物的充分接触，从而促进酶解的进行。
[0031]3、与传统溶液酶解需要12-20小时才能完成相比，该亲水聚合物杂化磁性颗粒固定化酶完成蛋白质酶解所需时间极短(1-2分钟)，大大加快了样品处理速度。
[0032]4、与使用常规疏水基体材料制备的固定化酶相比，该亲水聚合物基体材料显著降低了对蛋白质及其酶解产物的非特异性吸附，从而提高了样品回收率和蛋白质定量的准确度。
[0033]5、该固定化酶使用简单方便。酶解完成后，通过一步磁性分离即可将酶解产物与磁性颗粒固定化酶分离。
[0034]6、该固定化酶 具有很高的酶解效率、完全性和样品回收率，有助于提高复杂蛋白质组样本以“鸟枪法”鉴定策略进行定性和定量分析时结果的可靠性、准确性和灵敏度，因此特别适用于复杂蛋白质组样品的处理分析。
[0035]7、酶可多次重复使用。每次使用后,可通过磁性分离予以回收。经50次重复使用，酶解效率未见下降。



[0036]图1为本发明制备毛发状亲水聚合物杂化磁性纳米颗粒固定化蛋白酶的工艺流程图。
[0037]图2为荧光蛋白BSA-FITC与未经亲水聚合物修饰的二氧化硅包裹磁性颗粒混合后的荧光显微镜照片(a);用200μυΒ3(ΡΗ = 7.4)清洗5次后的荧光显微镜照片(b)；BSA-FITC与亲水聚合物杂化磁性颗粒混合后的荧光显微镜照片(c);用200 μ LPBS (PH =
7.4)清洗I次的荧光显微镜照片(d)。
[0038]图3为未经亲水聚合物修饰的磁性纳米颗粒的热重分析曲线(a);亲水聚合物杂化磁性颗粒的热重分析曲线(b)。
[0039]图4 =BSA标准蛋白质经溶液胰蛋白酶酶解12小时后鉴定到的肽段(允许I个漏切位点)对BSA的氨基酸序列覆盖率。斜体字部分为鉴定到的氨基酸序列。
[0040]图5:BSA标准蛋白质经亲水聚合物杂化磁性颗粒固定化胰蛋白酶酶解I分钟后鉴定到的肽段(允许I个漏切位点)对BSA的氨基酸序列覆盖率。粗体字部分为鉴定到的氨基酸序列。
[0041]图6 =BSA标准蛋白质经亲水聚合物杂化磁性颗粒固定化蛋白内切酶Glu-C酶解I分钟后鉴定到的肽段(允许I个漏切位点)对BSA的氨基酸序列覆盖率。粗体字部分为鉴定到的氨基酸序列。
[0042]图7为腾冲嗜热菌全蛋白提取物分别经溶液酶解和亲水聚合物杂化磁性颗粒固定化酶酶解后，使用10% SDS-PAGE(银染)考察酶解完全性。泳道I为蛋白质分子量标准(Protein marker)，泳道2为未经酶解的腾冲嗜热菌全蛋白提取物，泳道3为溶液酶解产物，泳道4为固定化酶解产物。泳道2-4中，每条泳道上样量为2 μ g。

[0043]下面通过具体实施例对本发明的方法进行说明，但本发明并不局限于此。下述实施例中所述实 验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
[0044]下述实施例中所用的二氧化硅包裹的四氧化三铁磁性纳米颗粒是按照下述方法制备得到的:将2.31g四氧化三铁磁性纳米颗粒(购自北京德科岛金科技有限公司，粒径为20nm)加入40ml乙醇中超声60min后，向该悬浮液中加入1.5ml 25% (v/v)氨水、6ml水、
1.5ml正硅酸乙酯，在40°C水浴中剧烈搅拌2h后，超声60min之后，用40ml乙醇漂洗3次，重新悬浮于40mL乙醇中，60°C回流加热12h。最后将所得二氧化硅包裹磁性纳米颗粒重新悬于60mL乙醇中室温保存备用。经二氧化硅包裹后的颗粒粒径为57.4nm, 二氧化硅厚度为18.7nm。
[0045]实施例1、制备毛发状亲水聚合物杂化磁性纳米颗粒固定化蛋白酶
[0046]按照图1所示的工艺流程进行制备。
[0047]1.1S1-ATRP引发剂的合成。使用3_氨基丙基三乙氧基硅烷与2_溴异丁酰溴反应合成一端为能与二氧化硅包裹磁性纳米颗粒表面结合的硅烷偶联剂，另一端为ATRP引发剂的S1-ATRP引发剂。具体如下:将8mmol 3-氨丙基三乙氧基硅烷与IOmmol三乙胺加入到12.5ml四氢呋喃中，混合后通入氮气除氧同时冰浴30min,之后将IOmmol 2-溴异丁酰溴缓慢滴加到混合液中并且剧烈搅拌4h (持续通氮气)，最后将溶液过滤后真空干燥至原始体积的1/3以去除四氢呋喃与三乙胺，离心后去除沉淀，氮气吹干后可得到黄色粘稠状S1-ATRP引发剂，充氮气后密闭4°C保存。
[0048]1.2S1-ATRP引发剂的固定。利用S1-ATRP引发剂上的硅烷偶联剂与包裹二氧化硅的磁性纳米颗粒表面的硅羟基发生脱水反应生成硅氧键共价连接，从而将S1-ATRP引发剂固定在磁性颗粒表面上。首先通过酸碱处理暴露二氧化硅包裹磁性颗粒表面的硅羟基，即:使用0.1M HCl溶液浸泡磁性颗粒，30分钟后将HCl溶液去除，用水清洗磁性颗粒至溶液pH为7左右，再使用0.1M NaOH溶液浸泡磁性颗粒，30分钟后将NaOH溶液去除，用水清洗磁性颗粒至溶液pH为7左右。之后将含有500 μ M S1-ATRP引发剂的乙醇溶液与处理后的磁性颗粒混合，室温下反应10小时后去除剩余引发剂，并用甲醇溶液清洗磁性颗粒，氮气吹干。
[0049]1.3甲基丙烯酰胺葡萄糖单体的合成。向674.53 μ I甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)中加入0.2Μ硫酸，放置于50°C水浴中加热4小时。再加入1.09g高碘酸钠混合，室温避光放置超过2小时。称取0.4克氢氧化钠溶解于20毫升甲醇中，加入1.1克氨基葡萄糖，搅拌至溶解。将氧化的GMA逐滴加入持续搅拌的氨基葡萄糖溶液中，搅拌直至呈黄色透明溶液，并将制备好的溶液氮气挥发掉多余甲醇至产物呈膏状，密闭充氮气后放置4°C保存。
[0050]1.4引发S1-ATRP反应，在包裹二氧化硅的磁性纳米颗粒表面原位生成聚甲基丙烯酰胺葡萄糖聚合物链。所用单体为1.3中合成的一端带有双键另一端带有葡萄糖的甲基丙烯酰胺葡萄糖。将单体、催化剂(氯化亚铜)、配体(1，1，4，7，7-五甲基二亚乙基三胺)按照摩尔比200: I: 1.5加入甲醇中并超声处理使其溶解并混合均匀。将上述反应液与已固定了 S1-ATRP引发剂的磁性颗粒混合，采用冷冻-抽真空-解冻-冲氮气的方法除去体系中的氧气，如此循环3次，之后用封口膜封口，室温反应24小时。反应完成后用PBS (pH= 8.0)清洗、去除剩余反应物，得到毛发状亲水聚合物杂化磁性纳米颗粒。采用动态光散射仪对毛发状亲水聚合物杂化磁性纳米颗粒进行表征，颗粒粒径为84.4nm，毛发状亲水聚合物层厚度为13.5nm。
[0051]1.5包裹二氧化硅的磁性颗粒的表面亲水聚合物侧链葡萄糖的醛基功能化。具体方法如下:将IOmM高碘酸钠与1.4制备的亲水聚合物杂化磁性颗粒混合均匀，在室温反应2小时。
[0052]1.6在磁性颗粒表面的亲水聚合物侧链上进行蛋白酶固定。具体方法如下，将2mg胰蛋白酶或蛋白内切酶Glu-C溶解于Iml 50mM碳酸氢铵溶液(pH = 8.0)，并加入
0.1ml50mg/ml氰基硼氢化钠溶液,混合均匀后加入到0.2ml浓度为250mg/ml的醒基功能化的亲水聚合物杂化磁性颗粒溶液中，40C反应12小时后使用磁铁将亲水聚合物杂化磁性颗粒吸附于管壁，除去上清液。通过对该上清液在280nm处的紫外吸收值计算上清液中残留的酶量，从而得出胰蛋白酶或蛋白内切酶Glu-C在亲水聚合物杂化磁性颗粒上的固载量分别为247 μ g/mg或213 μ g/mg。之后使用50mM碳酸氢铵溶液清洗,去除剩余反应物。
[0053]1.7亲水聚合物侧链剩余醛基的封闭。配置含10% (V/V)氨基乙醇的磷酸盐缓冲液PBS (pH = 8.0)，将其与固定了蛋白酶的亲水聚合物杂化磁性颗粒混合，4°C下反应4小时。之后用50mM碳酸氢铵溶液反复清洗，冻干后备用。即得到毛发状亲水聚合物杂化磁性纳米颗粒固定化蛋白酶。
[0054]如图2所示，图2a为包裹二氧化硅的磁性颗粒与荧光蛋白BSA-FITC混合后的荧光显微镜照片，图2b为PBS (PH = 7.4)溶液清洗该磁性颗粒5次后荧光显微镜照片；图2c为亲水聚合物杂化磁性颗粒与BSA-FIT`C混合后的荧光显微镜照片，图2d为PBS (PH = 7.4)溶液清洗该磁性颗粒I次后的荧光显微镜照片。从图中可看出，经亲水聚合物修饰后，清洗过的颗粒上基本没有荧光蛋白残留，而包裹二氧化硅的磁性颗粒清洗后有大量荧光蛋白残
&3甶O
[0055]毛发状亲水聚合物杂化磁性纳米颗粒由可热分解从而导致质量损失的聚合物层和不可热分解的磁性颗粒核心两部分组成。分别称取500mg亲水聚合物杂化磁性纳米颗粒和未经修饰的磁性纳米颗粒，进行热重分析，结果见图3。从图3中可看出，未经聚合物修饰的磁性颗粒随热处理温度的提高无明显质量损失(曲线a)。而聚合物修饰的磁性颗粒，随热处理温度的提高，表现出明显的质量损失(约24.17% )，证明通过S1-ATRP法在磁性颗粒表面原位聚合生成甲基丙烯酰胺葡萄糖聚合物是高度有效的。
[0056]实施例2
[0057]称取适量牛血清白蛋白(BSA)标准蛋白(其序列如序列I所不)，溶解于50mM碳酸氢铵溶液中(pH = 8.0)中，终浓度为2 μ g/μ I。加入IOmM巯基乙醇(DTT)，按IAA与DTT的终浓度摩尔比例为5: 1，加入IAA溶液，暗处放置I小时将蛋白质变性。取已变性的蛋白质溶液50μ I (浓度I)与IOmg亲水聚合物杂化磁性颗粒固定化胰蛋白酶混合，置于37°C水浴中反应I分钟后使用磁铁将磁性颗粒固定化酶吸附于管壁，并将上清中的蛋白质酶解产物取出。取同样量的已变性的蛋白质溶液，按照常规酶解条件，按质量比
1: 50 (胰蛋白酶:蛋白质底物)加入胰蛋白酶，置于37°C水浴中孵育12小时后加入质量浓度为0.1% TFA(三氟乙酸)将胰蛋白酶灭活。分别取固定化酶酶解和常规溶液酶解产物点于基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪靶上并自然风干，再点上CHCA基质(5mg/ml，溶解于50%乙腈，0.1% TFA中)，待结晶后进行质谱分析。所得数据文件分别提交给在线MASCOT搜库软件进行肽质量指纹图谱分析。分析结果表明，在允许一个漏切位点的条件下，从溶液胰蛋白酶酶解产物中鉴定到的肽段仅覆盖了 BSA氨基酸序列的66% (图4)，而用固定化胰蛋白酶酶解所得BSA序列覆盖率高达93% (见图5)。采用实施例1制备的毛发状亲水聚合物杂化磁性颗粒固定化胰蛋白酶对BSA进行酶解，重复使用50次后，酶解效率仍达到90%以上。
[0058]实施例3 [0059]称取适量牛血清白蛋白(BSA)标准蛋白，溶解于50mM磷酸盐缓冲液(pH = 7.8)中，终浓度为2 μ g/μ I。加入IOmM巯基乙醇(DTT)，按IAA与DTT的终浓度摩尔比例为5: 1，加入IAA溶液，暗处放置I小时将蛋白质变性。取已变性的蛋白质溶液50μ I(浓度
2μ g/ μ I)与IOmg亲水聚合物杂化磁性颗粒固定化蛋白内切酶Glu-C混合，置于37°C水浴中反应I分钟后使用磁铁将磁性颗粒固定化酶吸附于管壁，并将上清中的蛋白质酶解产物取出。取固定化酶酶解产物点于基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪靶上并自然风干，再点上CHCA基质(5mg/ml，溶解于50 %乙腈，0.1 % TFA中)，待结晶后进行质谱分析。所得数据文件分别提交给在线MASCOT搜库软件进行肽质量指纹图谱分析。分析结果表明，在允许一个漏切位点的条件下，用固定化蛋白内切酶Glu-C酶解所得BSA序列覆盖率高达92%(见图6)。采用实施例1制备的毛发状亲水聚合物杂化磁性颗粒固定化蛋白内切酶Glu-C对BSA进行酶解，重复使用50次后，酶解效率仍达到90%以上。
[0060]实施例4
[0061]腾冲嗜热菌全蛋白提取
[0062]配置全蛋白提取液:50mMTris-HCl (pH = 8.0)，8M 尿素，2mM EDTA。向 500 μ I 提取液加入10 μ I的“鸡尾酒”式蛋白酶抑制剂(Roche德国)，混合均匀后加入到装有腾冲嗜热菌的试管中，超声破碎细胞。之后在4°C下20000g离心20分钟，去除未破碎细胞及碎片，溶液即为腾冲嗜热菌全蛋白。之后在蛋白质溶液中加入4-5倍体积的冷丙酮溶液(_20°C预冷)，_20°C放置大于2小时后4°C 12000g离心10分钟，仔细吸取上清，保留沉淀。将沉淀放置于通风橱中，使剩余丙酮充分挥发。将丙酮沉淀得到的蛋白质重新溶解在8M尿素缓冲液中并采用Bradford法测定蛋白质浓度。
[0063]腾冲嗜热菌全蛋白固定化酶酶切
[0064]配置2mg/ml腾冲嗜热菌全蛋白溶液，加入DTT，37°C水浴中还原4小时，之后加入IAA于暗处放置I小时进行烷基化。向处理好的蛋白质溶液中加入50mM碳酸氢铵溶液，混合均匀后等分为两份，一份加入实施例1制备的10 μ I亲水聚合物杂化磁性颗粒固定化胰蛋白酶，37°C水浴中孵育2分钟后，使用磁铁将磁性颗粒固定化酶吸附于管壁，吸取上清中的酶解产物。另一份按照常规溶液酶解条件，加入(质量比为1: 50的胰蛋白酶:蛋白质底物)胰蛋白酶，置于37°C水浴中孵育16小时后加入0.1 % TFA将胰蛋白酶灭活。分别取固定化酶酶解和常规溶液酶解产物使用液相色谱-电喷雾质谱联用进行鉴定，并将鉴定得到的数据使用MASCOT软件进行搜库。使用常规溶液酶解，单次液-质连用分析，从腾冲嗜热菌全蛋白提取液中共鉴定到439个蛋白质；而使用固定化酶解，在同样的鉴定条件下，共鉴定到468个蛋白质。固定化酶酶解在大幅缩短酶解所需时间的同时提高了蛋白质的鉴定数量。使用10%的SDS-PAGE对固定化酶解和溶液酶解产物中的未酶解的残留蛋白质进行考察发现:溶液酶解产物中有多条残留蛋白质对应的条带出现(图7，泳道3)，而固定化酶解的产物中基本看不到残留蛋白质对应的条带(图7，泳道4)。以上结果说明亲水聚合物杂化磁性颗粒 固定化酶可成功应用于复杂蛋白质组样本的快速、高效酶解。