一种骨形态发生蛋白活性多肽修饰的介孔硅载药体系的制备方法[0002]骨是人体中坚硬的组织器官，肩负着运动、支持和保护身体的重要职责。据估计，我国每年因交通事故和生产安全事故所致骨骼创伤、脊柱退行性疾病、肿瘤骨切除等原因造成的骨缺损或功能障碍患者有数百万之众。因此，骨缺损成为日常医疗活动中一种常见的骨组织疾病。[0003]目前，骨组织移植和人工骨修复材料是骨组织修复采用的主要治疗手段。其中，人工骨修复材料不仅可以克服自体骨移植来源有限的缺陷，还能解决异体骨移植后存在的免疫排斥反应以及潜在的病源传播等危险。而将生物活性因子与材料结合，可以赋予材料更好的生物活性和更强的骨修复能力，是调控骨修复材料生物活性的重要手段之一。已知能够促进骨生成的生物活性因子有骨形态发生蛋白(BMP-2、4、6、7和9等)、胰岛素样生长因子、血小板源性生长因子和转化生长因子以及药物分子等。在这些生物活性因子中，骨形态发生蛋白被认为是骨修复和骨再生最重要的活性因子。另外，将2种或2种以上的生物活性因子联合使用，可获得较单一因子更强的诱导成骨分化作用。[0004]然而，天然 的BMP蛋白数量有限，结构复杂，且在体内迅速被降解。BMP作为一种外源性生长因子，在体内的半衰期非常短，体内酶的作用会使其失活，限制了其广泛应用。同时，研究表明，高浓度的ΒΜΡ-2会引起椎体骨质生成、脊髓神经根炎和颈椎软组织肿胀等(Injury, 2009, 40，S32-S38)。有研究表明，BMP的核心功能区氨基酸序列同样具有诱导成骨功能。如Saito等发现来源于BMP-2中73-92的氨基酸序列具有促进小鼠成纤维细胞C3H10T1/2 成骨分化(BBA-Proteins Proteomics, 2003, 1651，60-67)。因此，将来源于生物活性因子且具有生物活性的氨基酸序列与材料结合，可制备出具有高诱导活性的骨修复材料。[0005]近年来，介孔材料用于制备骨修复材料引起了研究者的广泛兴趣。其中，硅基介孔材料在骨修复领域已经获得初步的进展，如介孔生物活性玻璃、介孔硅基干凝胶和介孔硅。[0006]如Kim等利用氨基化介孔硅传递表达BMP-2的质粒DNA，促进间充质干细胞向成骨细胞分化(J.Biomed.Mater.Res.，2013，101A, 1651-1660)。
[0007]本发明所要解决的技术问题是提供一种骨形态发生蛋白活性多肽修饰的介孔硅载药体系的制备方法，该方法易于操作，设备简单，反应条件温和，价格低廉；制备的介孔硅载药粒子分散性好，稳定性好，并具有良好的生物相容性。
[0008]本发明的一种骨形态发生蛋白活性多肽修饰的介孔硅载药体系的制备方法，包括:
[0009](I)将介孔硅纳米粒子分散于有机溶剂中，然后加入3-氨丙基三乙氧基硅烷，在40-80°C条件下，反应6-12h，离心，洗涤，得到氨基化介孔硅；然后将氨基化介孔硅加入溶剂中，分散，得到氨基化介孔硅纳米粒子溶液；介孔硅纳米粒子、3-氨丙基三乙氧基硅烷的质量比为1:0.5-1:2 ；
[0010](2)将骨形态发生蛋白活性多肽溶于溶剂中，然后加入1-乙基-3- (3- 二甲基氨丙基)-碳化二亚胺EDC和N-羟基琥珀酰亚胺NHS，室温条件下，反应10-30min ；
[0011](3)将氨基化介孔硅纳米粒子溶液加入步骤(2)中，氮气保护下，室温搅拌反应24-48h，离心，洗涤，干燥，得到多肽修饰的介孔硅纳米粒子，然后溶于溶剂中，得到多肽修饰的介孔娃纳米粒子溶液；
[0012](4)将聚乙二醇单羧酸溶于溶剂中，加入1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)_碳化二亚胺EDC和N-羟基琥珀酰亚胺NHS，室温反应10-30min ；
[0013](5)将步骤(3)中的多肽修饰的介孔硅纳米粒子溶液加入步骤(4)中，氮气保护下，室温搅拌反应24-48h，离心，洗涤，干燥，得到聚乙二醇修饰的介孔硅纳米粒子；其中氨基化介孔硅纳米粒子和骨形态发生蛋白活性多肽、聚乙二醇单羧酸的质量比为100-500:1:40 ；
[0014](6)将上述聚乙二醇修饰的介孔硅纳米粒子分散于溶剂中，然后加入药物溶液中，室温搅拌12-24h，离心，洗涤，干燥，得到载药纳米粒子。
[0015]所述步骤⑴有机溶剂为乙醇、甲醇、丙酮中的一种。
[0016]所述步骤(1)中氨基化介孔娃纳米粒子溶液的浓度为100-500mg/ml。
[0017]所述步骤(2)中骨形态发生蛋白活性多肽来源于BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7、BMP-9中的一种或几种。
[0018]所述步骤(2)中骨形态发生蛋白活性多肽、EDC、NHS的摩尔比为1_5:100:100。
[0019]所述步骤(4)中聚乙二醇单羧酸溶液的浓度为l_5mg/ml。
[0020]所述步骤(6)中药物为地塞米松、阿伦磷酸钠、维生素D、淫羊藿苷、丹参素的一种或几种。
[0021]所述步骤(6)中药物溶液的浓度为0.l_5mg/ml，药物溶液的溶剂为磷酸缓冲液或乙醇。
[0022]所述步骤⑴、⑵、(4)、(6)中的所述的溶剂为磷酸缓冲液，pH为7.0-7.4。
[0023]所述步骤(6)中所得的载药纳米粒子用于诱导间充质干细胞成骨分化作为骨缺损修复材料。
[0024]介孔硅纳米粒子的制备参照文献方法(J.Am.Chem.Soc.，2004, 126，13216-13217)，合成步骤如下:将Ig十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)加入含有480ml去离子水的烧杯中，加入3.5ml2mol/L NaOH溶液，油浴控温在80°C。待溶液澄清后加入5ml正硅酸乙酯(TEOS)，反应2小时后产生白色沉淀。利用离心(8000转/分钟)收集产物，并用去离子水和乙醇洗涤3次。模板剂CTAB通过在甲醇酸溶液(160ml甲醇和9ml盐酸)中回流24小时去除，再离心、冷冻干燥，得到不含模板剂的介孔硅纳米粒子。
[0025] 本发明利用介孔硅表面易于修饰以及强的吸附性能特性，通过在介孔硅表面共价接枝骨形态发生蛋白活性多肽和聚乙二醇，再吸附具有骨诱导活性的药物分子，制备骨形态发生蛋白活性多肽修饰的介孔硅载药体系。
[0026]有益效果
[0027](I)本发明易于操作，设备简单，反应条件温和，价格低廉；
[0028](2)本发明制备的介孔硅载药粒子分散性好，稳定性好并具有良好的生物相容性；该载药体系含有具有骨诱导的骨形态发生蛋白活性多肽和药物分子，可以用于骨修复领域。



[0029]图1为实施例1所得产物的扫描电镜TEM照片，(a)为实施例1所得的介孔硅纳米粒子TEM照片，(b)为实施例1所得的BMP-2多肽/聚乙二醇共修饰的介孔硅TEM照片；
[0030]图2为实施例所得产物的小角度X-射线衍射图，(a)为实施例1所得的介孔硅纳米粒子X-射线衍射图，(b)为实施例1所得的BMP-2多肽修饰的介孔硅纳米粒子X-射线衍射图，(c)为实施例1所得的BMP-2多肽/聚乙二醇共修饰的介孔硅纳米粒子X-射线衍射图；
[0031 ] 图3为实施例1所得产物BMP-2多肽/聚乙二醇共修饰的介孔硅纳米粒子对骨髓间充质干细胞的细胞毒性。

[0032]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
[0033]实施例1
[0034](I)介孔硅纳米粒子的制备参照文献方法(J.Am.Chem.Soc.，2004, 126，13216-13217)。合成步骤如下:将Ig十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)加入含有480ml去离子水的烧杯中，加入3.5ml2mol/L NaOH溶液，油浴控温在80°C。待溶液澄清后加入5ml正硅酸乙酯(TEOS)，反应2小时后产生白色沉淀。利用离心(8000转/分钟)收集产物，并用去离子水和乙醇洗涤3次。模板剂CTAB通过在甲醇酸溶液(160ml甲醇和9ml盐酸)中回流24小时去除，再离心、冷冻干燥，得到不含模板剂的介孔硅纳米粒子；
[0035](2)将步骤(1)所得的介孔硅纳米粒子均匀分散于乙醇中，加入3-氨丙基三乙氧基硅烷，于80°C反应6小时，离心收集，乙醇和水洗涤，得到氨基化介孔硅；
[0036](3)将2mg的BMP-2活性多肽溶解于磷酸缓冲液中，接着加入1_乙基_3_ (3_ 二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温下反应30分钟；
[0037](4)将步骤(2)制备的氨基化介孔硅加入到磷酸缓冲液(pH7.4)中，超声分散均匀，得到200mg/ml的纳米粒子溶液；
[0038](5)将步骤(4)的纳米粒子溶液加入到步骤(3)中，在氮气保护下，室温搅拌反应24小时，经离心、磷酸缓冲液洗涤、真空干燥得到BMP-2多肽修饰的介孔硅纳米粒子；
[0039](6)以磷酸缓冲液为溶剂，配制2mg/ml的聚乙二醇单羧酸溶液，接着加入EDC和NHS，室温下反应30分钟；[0040](7)将步骤(5)得到的纳米粒子分散于磷酸缓冲液，再加入到步骤(6)中，在氮气保护下，室温搅拌反应24小时，经离心、磷酸缓冲液洗涤、真空干燥得到聚乙二醇修饰的介孔娃纳米粒子；
[0041 ] (8)以磷酸缓冲液为溶剂，配制0.lmg/ml的地塞米松溶液，称取200mg步骤(7)所得产物分散到溶剂中，再加入到药物溶液中，室温搅拌24小时，经离心、水洗、真空干燥得到载药纳米粒子。
[0042]实施例2
[0043](I)介孔硅纳米粒子的制备参照文献方法(J.Am.Chem.Soc.，2004, 126，13216-13217)。合成步骤如下:将Ig十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)加入含有480ml去离子水的烧杯中，加入3.5ml2mol/L NaOH溶液，油浴控温在80°C。待溶液澄清后加入5ml正硅酸乙酯(TEOS)，反应2小时后产生白色沉淀。利用离心(8000转/分钟)收集产物，并用去离子水和乙醇洗涤3次。模板剂CTAB通过在甲醇酸溶液(160ml甲醇和9ml盐酸)中回流24小时去除，再离心、冷冻干燥，得到不含模板剂的介孔硅纳米粒子；
[0044](2)将步骤(1)所得的介孔硅纳米粒子均匀分散于乙醇中，加入3-氨丙基三乙氧基硅烷，于80°C反应6小时，离心收集，乙醇和水洗涤，得到氨基化介孔硅；
[0045](3)将2mg的BMP-9活性多肽溶解于磷酸缓冲液中，接着加入1_乙基_3_ (3_ 二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温下反应30分钟；
[0046](4)将步骤(2)制备的氨基化介孔硅加入到磷酸缓冲液(pH7.4)中，超声分散均匀，得到200mg/ml的纳米粒子溶液； [0047](5)将步骤(4)的纳米粒子溶液加入到步骤(3)中，在氮气保护下，室温搅拌反应24小时，经离心、磷酸缓冲液洗涤、真空干燥得到BMP-9多肽修饰的介孔硅纳米粒子；
[0048](6)以磷酸缓冲液为溶剂，配制2mg/ml的聚乙二醇单羧酸溶液，接着加入EDC和NHS，室温下反应30分钟；
[0049](7)将步骤(5)得到的纳米粒子分散于磷酸缓冲液，再加入到步骤(6)中，在氮气保护下，室温搅拌反应24小时，经离心、磷酸缓冲液洗涤、真空干燥得到聚乙二醇修饰的介孔娃纳米粒子；
[0050](8)以磷酸缓冲液为溶剂，配制lmg/ml的阿仑膦酸钠溶液，称取200mg步骤(7)所得产物分散到溶剂中，再加入到药物溶液中，室温搅拌24小时，经离心、水洗、真空干燥得到载药纳米粒子。
[0051]实施例3
[0052](I)介孔硅纳米粒子的制备参照文献方法(J.Am.Chem.Soc.，2004, 126，13216-13217)。合成步骤如下:将Ig十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)加入含有480ml去离子水的烧杯中，加入3.5ml2mol/L NaOH溶液，油浴控温在80°C。待溶液澄清后加入5ml正硅酸乙酯(TEOS)，反应2小时后产生白色沉淀。利用离心(8000转/分钟)收集产物，并用去离子水和乙醇洗涤3次。模板剂CTAB通过在甲醇酸溶液(160ml甲醇和9ml盐酸)中回流24小时去除，再离心、冷冻干燥，得到不含模板剂的介孔硅纳米粒子；
[0053](2)将步骤(1)所得的介孔硅纳米粒子均匀分散于乙醇中，加入3-氨丙基三乙氧基硅烷，于80°C反应6小时，离心收集，乙醇和水洗涤，得到氨基化介孔硅；
[0054](3)将4mg的BMP-2活性多肽溶解于磷酸缓冲液中，接着加入1_乙基_3_ (3_ 二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温下反应30分钟；
[0055](4)将步骤(2)制备的氨基化介孔硅加入到磷酸缓冲液(pH7.4)中，超声分散均匀，得到400mg/ml的纳米粒子溶液；
[0056](5)将步骤(4)的纳米粒子溶液加入到步骤(3)中，在氮气保护下，室温搅拌反应24小时，经离心、磷酸缓冲液洗涤、真空干燥得到BMP-2多肽修饰的介孔硅纳米粒子；
[0057](6)以磷酸缓冲液为溶剂，配制2mg/ml的聚乙二醇单羧酸溶液，接着加入EDC和NHS，室温下反应30分钟；
[0058](7)将步骤(5)得到的纳米粒子分散于磷酸缓冲液，再加入到步骤(6)中，在氮气保护下，室温搅拌反应24小时，经离心、磷酸缓冲液洗涤、真空干燥得到聚乙二醇修饰的介孔娃纳米粒子；
[0059](8)以磷酸缓冲液为溶剂，配制2mg/ml的阿仑膦酸钠溶液，称取200mg步骤(7)所得产物分散到溶剂中，再加入到药物溶液中，室温搅拌24小时，经离心、水洗、真空干燥得到载药纳米粒子。