专利名称：一种多肽链段交联的杂化涂层的制备方法牙种植术是在骨结合理论的基础上发展起来的，即种植体直接与骨组织形成化学 键合的能力，这种键合使得材料与组织产生牢固的骨性结合(Bone-binding)，而不是被纤 维组织所隔离，也就是在种植体与骨组织发生骨整合。研究表明骨整合是影响种植成功的 关键因素，排除外科操作技术和患者个体差异(种植部位骨量及其骨质的情况等)这两种因 素的影响，种植体表面形貌和化学性质对于种植体骨整合性能具有决定性的影响。人们发现具有羟基磷灰石(HA)涂层的种植体和骨组织生物固定的速度快且长期 的成功率显著高于没有HA涂层的种植体。这是由于HA可诱导骨基质的异位晶体生长，形 成化学性连接；HA微量溶解的Ca2+局部调控分化成骨细胞促进骨基质的矿化；HA特异性 的吸附胞外基质蛋白和骨基质蛋白，加快分化性成骨细胞的黏附和生长；HA的粗糙表面还 可增加纤维蛋白的附着。但是，临床上和骨组织具有良好结合的HA涂层和钛金属种植体本 体的剥离，是这种具有HA涂层的钛种植体面临的一个很严重的问题。近年来，很多学者致力于细胞外基质蛋白与细胞膜受体之间相互作用的机制研 究，从而发现了很多调控细胞黏附和生长的活性分子。RGD (Arg-Gly-Asp,精氨酸-甘氨 酸-天冬氨酸)是各种细胞外基质中最常见的基本结构，也是广泛存在于细胞识别系统中的 基本单位。RGD基团能促进成骨细胞的生长，抑制破骨细胞之间、破骨细胞与基质之间的黏 附，阻止破骨细胞的增殖、迁移和分化，从而促进成骨。研究者还发现，人工合成的RGD短肽 也具有同样的功能。于是，人们试着把RGD短肽引入到种植体表面。物理吸附法是最简单 的一种，就是直接将种植体浸泡在RGD短肽溶液中。这种方法确实也有一定的作用，促进了 种植体周围骨的形成。但是物理吸附引入的RGD分布不均、厚薄不一、效率低下、稳定性差、 重复性差以及结合力小容易在种植体植入过程中被擦掉。接着，有学者把目光转向了用化 学偶联的方法来引入RGD。就是用特殊的方法将种植体表面活化，使之产生能与RGD多肽 共价结合的功能基团，如-OH、-COOH和-NH2等。化学偶联法使RGD能与材料结合牢固、稳 定、可重复性好。然而，化学交联容易改变RGD起作用的最佳构象，损害了 RGD的活性。可 见寻找一种合适的方法，将RGD短肽均勻、稳定、牢固的结合到种植体表面而同时又不改变 种植体本来的表面形貌是很有必要的。层层自组装技术是一种有效的表面改性方法。它的原理是利用静电作用力，在固 体支持物表面依次组装带相反电荷的聚电解质，最后得到从分子尺度到亚微米尺度的多层 复合膜(PEM)。它具有操作简单，制备条件温和，方便可控，能连续生产等特点，而且无论固 体支持物形貌如何，最后均能得到物理化学性质均一的聚电复合膜。这种聚电复合膜在干 燥环境中具有很高的稳定性，研究发现具有电荷性质的聚电解质和纳米无机粒子等都可以利用LbL技术被引入到支持物表面。但是，聚电解质复合膜在生理条件下并不是很稳定(4 7天完全降解)。生物世界 是很奇妙的，很多生物大分子内都有二硫键(-S-S-)的存在，依赖二硫键来维持生物大分 子(特别是蛋白质)的三级或四级结构。研究表明，二硫键可在谷胱甘肽的作用被打断而还 原成巯基(-SH)，而巯基很容易被氧化成二硫键。这些反应条件很温和，对生物大分子的活 性损伤小。这给了我们很大的启示，故本实验本发明公开一种LbL技术制备的含有RGD的 胶原/纳米羟基磷灰石杂化涂层的制备方法，并在引入RGD的同时引入巯基，通过巯基与二 硫键的相互转化来交联杂化涂层，从而使杂化涂层更稳定同时尽量不破坏杂化涂层中RGD 本来的生物活性。
本发明的目的是提供一种多肽链段交联的杂化涂层的制备方法。该涂层通过钛基 种植体表面多肽链段(RGD)交联，能够实现硬组织与永久性植入材料之间快速骨整合，亦有 利于种植材料的长期稳定性，本发明的制备方法通过以下步骤实现(1)制备RGD接枝的聚电解质合成GRGDSPC(S-S)CPSDGRG多肽链段(由SciLight Biotechnology, LLC公司合成)，该多肽链段为水溶性多肽。首先将多肽链段和聚电解 质溶解在水溶液中，配置成混合溶液，然后加入碳化二亚胺[l-ethyl-3- (3-dimethyl ami-nopropyl) carbodiimide，EDC]/N-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide, NHS)催 化体系，室温下反应4小时，实现聚电解质的改性，然后将所得到的产物纯净水中透析1周， 在透析液中直接加入木苏糖或者谷胱甘肽溶解，常温下保持不少于4小时，然后纯净水中 透析1周，最后冻干，得到RGD接枝的聚电解质。该电解质是一种修饰了 GRGDSPC的多肽链 段，并具有自由活泼巯基的聚电解质。其中所述聚电解质选用透明质酸、碱溶明胶、聚谷氨酸、聚天冬氨酸、硫酸软骨素中的一种， 得到的产物是RGD接枝的聚阴电解质。聚阴电解质的分子量为100-5000000D。(2)配置聚电解质溶液将步骤(1)获得的任一种RGD接枝的聚阴电解质配置成溶 液，作为聚阴离子电解质溶液；将I型胶原(猪源、牛源或鼠源)配置成溶液，然后将羟基磷 灰石纳米粒子分散于胶原溶液中，作为聚阳电解质溶液；(3)制备RGD交联的聚电解质涂层利用静电自组装技术，首先在钛基种植体表面沉积 聚阳电解质，再沉积聚阴电解质层，即将钛基种植体浸入步骤(2)中的聚阳电解质溶液， 沉积一定时间后，充分水洗，然后浸入到步骤(2)配置的任一种RGD接枝的聚阴电解质溶 液，沉积一定时间后，充分水洗；以上操作记为一次沉积循环，根据需要重复以上循环操作， 最后得到需要的聚电解质复合层；然后，该聚电解质复合层在氯胺T溶液或者双氧水溶液 中浸泡一段时间，迅速取出，充分水洗，得到RGD交联的杂化涂层。步骤(1)中，聚电解质的浓度为0. l-50mg/ml，其中最佳浓度为5mg/ml ；所述的多 肽链段的量与聚电解质中羧基含量的摩尔比例为1 :10000-1 :1，其中最佳浓度比率为1 20-50 ；所述的EDC/NHS的用量为1 :1_20 :1，其中最佳浓度比例为10-5 1 ；EDC的用量与多 肽链段的用量的摩尔比例为1 :1-10 :1，其中最佳浓度比例为2-5 1 ；所用的木苏糖或者谷 胱甘肽的浓度与EDC/NHS体系中双硫键的摩尔比例为1 :1-50 :1，其中最佳摩尔浓度比例为45 :1。步骤(2)中聚电解质溶液的浓度范围为0. lmg/ml-10mg/ml，其中最佳浓度范围为 0. 5-lmg/ml，其中聚电解质溶液中NaCl浓度为0. 1-0. 2mol/L。步骤(2)中纳米羟基磷灰石的粒径为20ηπΓ 00ηπι。步骤(3)中聚电解质层所用的沉积时间为5min到20min，聚电解质复合层的沉积 循环为0. 5到50次，根据实际临床用途确定最后的沉积循环数，其中口腔用牙种植体的表 面沉积最佳循环是4-10次，最外层为RGD修饰的聚电解质层。步骤(3)中聚电解质复合层 在氯胺T中的浸泡时间为5-180秒，最佳时间为30-90秒，氯胺T的浓度为0. 5-10 mM，其中 最佳浓度为2mM，在双氧水中浸泡时间为5-60分钟，最佳时间为10-20分钟，双氧水的浓度 为1-50 mM，其中最佳浓度为10-15mM。步骤(3)中所用的种植体表面为各种永久植入型种植体表面，可以选用经氧化性 酸处理的纯钛或者钛合金表面、非氧化型酸处理的纯钛或者钛合金种植体表面、喷砂/酸 处理的表面、各种碱热法得到的纯钛或者钛合金种植体表面、电化学得到的各种表面、各种 羟基磷灰石涂层的纯钛或者钛合金种植体表面、钛或者羟基磷灰石喷浆表面的纯钛或者钛 合金种植体表面、钛喷浆/酸处理的纯钛或者钛合金表面、离子注入的各种纯钛或者钛合 金种植体表面、或激光处理的各种纯钛或者钛合金种植体表面。本发明方法所构建的RGD交联的杂化涂层，在引入RGD的同时，实现了杂化涂层的 交联，而且通过引入双硫键，使得最后的聚电解质复合膜的生物降解性能具有体内响应性， 该富含RGD的杂化涂层在适合各种体内植入的钛基种植体表面处理；该杂化涂层可以促进 成骨前体细胞的黏附增殖分化，可以促进种植体周围成骨的早期发生，可以早日实现骨整I=I ο


图1是两种涂层的降解曲线。
图2是细胞在两种涂层上的黏附和增殖能力检测。
图3是成骨细胞在两组涂层上的碱性磷酸酶ALP检测。
图4是骨钙素OC的检测。
图5是CollalmRNA在两组涂层上的表达水平。
图6是AKP-2mRNA在两组涂层上的表达水平。
图7是OsxmRNA在两组涂层上的表达水平。
图8是Rimx-2在两组涂层上的表达水平。

5取一定量的透明质酸溶解于水中，加入GRGDSPCS-SCPSDGRG溶解，最后加入EDC/NHS溶 解，反应4小时，反应产物透析1周，冻干；反应产物直接溶解于水中，加入木苏糖，反应4小 时，透析一周，冻干，得到具有自由巯基的RGD接枝的透明质酸钠。将该RGD接枝的透明质酸钠和胶原分别溶解于0. lmol/L的NaCl溶液中，二者浓 度都为lmg/ml，然后将羟基磷灰石纳米粒子分散于胶原溶液中，其中纳米羟基磷灰石的最 终浓度为0. 5mg/ml ；种植体表面经大颗粒喷砂、H2SO4和HCl混酸溶液处理1分钟，大量纯 净水洗净种植体表面，然后将该种植体浸泡于胶原羟基磷灰石溶液中lOmin，去离子水洗去 物理吸附胶原和羟基磷灰石；然后，再浸泡于RGD交联的透明质酸溶液中lOmin，去离子水 洗去物理吸附的透明质酸钠。重复以上操作，最后得到6个(胶原+羟基磷灰石)/透明质 酸聚电解质复合层。将该杂化聚电解质复合层涂层的种植体浸泡于氯胺T中30秒钟，立即 拿出，大量水洗，洗去氯胺T。得到RGD交联的(胶原+羟基磷灰石)/透明质酸杂化涂层的 种植体。实施例2 =RGD交联的(胶原+羟基磷灰石)/碱溶明胶杂化涂层的制备 方法同实施例一，区别在于将透明质酸换成碱溶明胶(猪源、牛源、鼠源)。实施例3 =RGD交联的(胶原+羟基磷灰石)/聚谷氨酸杂化涂层的制备 方法同实施例一，区别在于将透明质酸换成聚谷氨酸。实施例4 =RGD交联的(胶原+羟基磷灰石)/聚天冬氨酸杂化涂层的制备 方法同实施例一，区别在于将透明质酸换成聚天冬氨酸。实施例5 =RGD交联的(胶原+羟基磷灰石)/硫酸软骨素杂化涂层的制备 方法同实施例一，区别在于将透明质酸换成硫酸软骨素。 实施例6 体外降解试验
在PH为7. 2的PBS溶液中，分别研究(胶原+羟基磷灰石)/透明质酸杂化涂层和RGD 交联的(胶原+羟基磷灰石)/透明质酸杂化涂层(制备方法见实施例一)的稳定性，如图1所 示，不交联杂化聚电解质涂层((Col+Ha) /HA) PBS溶液中六天内降解完全，而交联的杂化聚 电解质涂层可以在14天内降解完全，交联的杂化涂层(RGD crosslinked hybrid coating) 的稳定性得到极大的提高。实施例7 体外生物学评价
使用小鼠成骨前体细胞细胞系MC3T3-E1 (中国科学院细胞库)来评测该涂层的体外生 物学性能。对照组为(胶原+羟基磷灰石)/透明质酸杂化涂层钛片组((Col+Ha) /HA)，试验 组为RGD交联的(胶原+羟基磷灰石)/透明质酸杂化涂层(制备方法见实施例一)钛片组 (RGD crosslinked hybrid coating)。a.成骨细胞在钛片上黏附(attachment)、增殖(proliferation)能力的检测，参 见图2 ；
b.成骨前体细胞在钛片上分化能力的检测 碱性磷酸酶活性的检测(ALP)参见图3 ； 细胞培养基中骨钙素含量的检测(OC)参见图4 ； c.成骨相关基因表达的检测
本实验采用实时定量RT-PCR的方法来分析成骨相关基因的表达变化。分别检测I型 胶原(Collal mRNA)(参图 5)，碱性磷酸酶(AKP-2 mRNA)(图 6)，Osx mRNA (参图 7)及Runx2 mRNA (参图8)的表达。
1)细胞总RNA的提取
本实验采用能提取高质量RNA的专用试剂盒(RNeasy Mini kit, Qiagen, German)。
该试剂盒包含以下几部分
a.RNeasy Mini Spin Columns (pink)50
b.Collection Tubes (1. 5ml)50
c.Collection Tubes (2ml)50
d.Buffer RLT45ml
e.Buffer Rffl45ml
f.Buffer RPE(5 X)Ilml
g.RNase — Free Water10ml
h.Handbook1
为了去除总RNA中残留的微量DNA，可以用试剂盒(RNase — free DNase Set)，包含 Buffer RDD 禾口 DNase I stock solution 两部分。RNA提取前的准备
1.每毫升BufferRLT使用前最好加10 μ 1巯基丙醇(β — ME)
2.1体积的Buffer RPE加4体积的无水酒精配成工作液 具体操作步骤
1.收集细胞，不超过10*7个细胞。在规定的时间点，将装有钛片的细胞培养板从培养 箱中取出，倒掉培养基，将钛片在PBS里冲洗2遍，并转移到新的细胞培养板中。接着每片钛 片表面加Buffer RLT 200 μ 1 (平行样本3片共600 μ 1)，摇床处理数分钟，收集到RNA-free EP管中(可-80度长期保存)。2.加一体积的70%乙醇(DEPC水配)，混勻，勿离心。3.取700μ 1置于柱子中，盖上，IOOOOrpm离心15s，倒掉流出液。4.取350 μ 1 Buffer RWl置于柱子中，IOOOOrpm离心15s，倒掉流出液。5. 10 μ 1 Dnase原液+70μ1 Buffer RDD共80 μ 1加在柱子中的硅胶膜上，室温 静置15min。6.取350 μ 1 Buffer RWl置于柱子中，IOOOOrpm离心15s，倒掉流出液。7.取500 μ 1 Buffer RPE置于柱子中，IOOOOrpm离心15s，倒掉流出液。8.取 500 μ 1 Buffer RPE 置于柱子中，IOOOOrpm 离心 2min，弃管。9.将柱子放置于1. 5ml RNA-free EP新管中，将30 μ 1 RNA-free水加在柱子中 的硅胶膜上，盖上，IOOOOrpm离心Imin以洗脱RNA。刚提取的总RNA马上置于冰上，接着行RNA纯度及浓度检测(用紫外分光光度计)。 当RNA的A260/A280介于1. 8 2. 0之间，说明提取的RNA质量好，可用于下一步实验。2 )总RNA逆转录成cDNA
所用试剂盒逆转录试剂盒(PrimeScriptTM RT reagent Kit, Code DRR037A, TAKARA,大连宝生物工程有限公司)。该试剂盒推荐一个反应体系为10 μ 1。具体的步骤为
5 X primescript buffer2 μ 1Primescript TR Emyne Mix I0. 5 μ 1
Random 6 mer(IOOum)0. 5 μ 1
Oligo dT prime(50um)0. 5 μ 1
Total RNA500ng
+ Rnase freeH20至 10 μ 1
37° 水浴 15min 85°水浴IOS cDNA -20° 保存 3)引物的设计和合成
Realtime RT-PCR所用引物由大连宝生Takara公司设计合成，具体见表1。
表1:目的基因的上游和下游引物
3) Realtime PCR
试剂SYBR 染料法试剂盒(SYBRR Premix Ex TaqTM, Perfect Real Time, Takara, Code: DRR041A)
仪器荧光定量 PCR 仪(C1000TM Thermal Cycler, Bio-rad, USA) 本实验采用的是20 μ 1体系，具体加样方法参见表2 : 表2: PCR反应液的制备


本发明提供一种多肽链段交联的杂化涂层的制备方法，通过钛基种植体表面多肽链段交联，实现硬组织与永久性植入材料之间快速骨整合，也有利于种植材料的长期稳定性。本发明方法在引入RGD的同时，实现了杂化涂层的交联，而且通过引入双硫键，使得最后的聚电解质复合膜的生物降解性能具有体内响应性。本发明所构建的RGD交联的杂化涂层，适合各种体内植入的钛基种植体表面处理，该杂化涂层可以促进成骨前体细胞的黏附增殖分化，可以促进种植体周围成骨的早期发生，早日实现骨整合。