专利名称：用于向哺乳动物皮肤输送多核苷酸癌症疫苗的方法和装置的制作方法为了本公开的目的，术语“脉冲间隔”意味着从一个脉冲的开始到下一脉冲的开始的时间。下面讨论以下公开物美国专利No. 6010613 ；美国专利No. 6603998 ；美国专利No. 6713291 ；"Enhancement of Cellular Immune Response to a Prostate Cancer DNAVaccine by Intradermal Electroporation”，Roos 等人，在《分子理论》中，第 13 卷， No. 2，2006年2月，320-327页(在此称为Roos等人)；以及Pucihar 等人在 Bioelectrochemistry 57 (2002)，第 167-172 页发表的论文"The Effect ofpulse repetition frequency on the uptake into electropermeabilized cells in vitro with possible applications in electrochemotherapy，，(在此禾尔为 Pucihar 等人)。在此通过参考并入的美国专利No. 6010613公开了使用诸如由Cyto Pulse公司、 8IOCromwe 11 Park Drive, Suite Τ, Glen Burnie, MD 21061 的 ΡΑ-4000 系统(在此称为 PulseAgile)提供的具有宽的间隔电波的电击。更具体地，美国专利No. 6010613公开了向材料施加一系列至少三个单个、操作员控制的、独立编程的DC电脉冲，其中，该一系列至少三个DC电脉冲具有以下特征中的一个、两个或三个(1)至少三个脉冲中的至少两个在脉冲幅度上彼此不同；( 至少三个脉冲中的至少两个在脉冲宽度上彼此不同；以及C3)至少三个脉冲中的第一组两个脉冲的第一脉冲间隔不同于该至少三个脉冲中的第二组两个脉冲的第二脉冲间隔。为了在此讨论和公开的目的，上述向物质施加具有特征(1)、(2)和(3)的一系列至少三个单个、操作员控制的、独立编程的DC电脉冲，在此被称为“PulseAgile”。在美国专利No. 6010613中公开的说明书和与PulseAgile系统相关的文档提供了 脉冲间隔等于或大于0.1秒，即100毫秒。以下，将具有等于或大于100毫秒脉冲间隔的PulseAgile生成的电波称为“宽间隔PulseAgile电波”或“慢PulseAgile电波”。在美国专利No. 6010613中，没有提出具体证据来证明，所送药的疫苗成功地从基因表达出该疫苗，或提供改进的T细胞应答，包括由于该疫苗的成功基因表达而引起的好蛋白质的分泌得到改善。在此都通过引用附于此的美国专利No. 6603998和美国专利No. 6713291都公开了使用宽间隔PulseAgile电波或慢PulseAgile电波来向生物细胞输送多核苷酸疫苗。Roos等公开了使用宽间隔PulseAgile电波或慢PulseAgile电波来将多核苷酸疫苗输送到哺乳动物皮肤细胞中。Roos等还公开了通过检测表达荧光素酶(Iuciferase)蛋白质的遗传标记来证实多核苷酸疫苗的成功的遗传表达。另外，Roos等还公开了通过使用宽间隔PulseAgile电波或慢PulseAgile电波来将多核苷酸疫苗输送到哺乳动物皮肤细胞中，存在改进的T细胞应答，包括由于多核苷酸疫苗的成功的遗传表达而引起的好的蛋白质的分泌改善。在Roos等的公开物中，T细胞应答用产生PSA特异性IFN( γ )的⑶8+T细胞来代表。除了在Roos等的公开物中公开的有益结果以外，存在通过使用慢PulseAgile电波而观察到的两个不期望的结果。第一个不期望的结果是，每个慢PulseAgile电波送药过程花费大约3. 5秒。由于使用刺到哺乳动物皮肤中的针来送药导致不舒适或疼痛，因此对于这3. 5秒的送药过程哺乳动物将不得不忍受大约3. 5秒的不舒适或疼痛。在Roos等的公开物中公开的第二个不期望的结果是，每个慢PulseAgile电波导致能感知的肌肉收缩。肌肉收缩本身也可能导致不舒适或疼痛。通常，为运送多核苷酸疫苗，将向哺乳动物施加多个脉冲波形。因此，将伴随这这种慢PulseAgile电波而发生具有多次额外的肌肉不舒适或疼痛的多次肌肉收缩。Pucihar等公开了在其2002年的
根据本发明的一个方面，一种用于将多核苷酸疫苗输送到哺乳动物皮肤的方法包括以下步骤(a.)将多核苷酸疫苗送药到送药点处的皮肤中，(b.)对送药点附近的皮肤安置针状电极，(c.)施加一系列至少三个单个、操作员控制的、独立编程的、具有少于100毫秒的脉冲间隔的窄间隔电波，以通过电击将多核苷酸疫苗输送到皮肤细胞中。该一系列至少三个波形具有以下特征中的一个、两个或三个(1)至少三个波形中的至少两个在波形幅度上彼此不同；( 至少三个波形中的至少两个在波形宽度上彼此不同；以及C3)至少三个波形中的第一组两个波形的第一波形间隔不同于该至少三个波形中的第二组两个波形的第二波形间隔。该一系列至少三个单个、操作员控制的、独立编程的、具有少于100毫秒的脉冲间隔的窄间隔电波在此被称为“快PulseAgile电波”或“窄间隔PulseAgile电波”。优选地，该窄间隔电波具有少于几毫秒的脉冲间隔。通过本发明方法的一个实施方式，顺序地进行步骤(a.)和步骤(b.)。例如，首先将DNA疫苗注入到皮肤中以形成小泡。然后，将针状电极放置到跨骑该小泡的皮肤中。在这方面，可以使用“Derma Vax”系统。通过本发明方法的另一实施方式，使用用多核苷酸疫苗预先涂覆的电极来同时进行步骤(a.)和步骤(b.)。在这方面，可以使用“Easy Vax”系统。根据本发明的另一方面，提供一种用于将多核苷酸疫苗输送到哺乳动物皮肤的装置，其包括窄间隔电波发生器，其能够施加一系列至少三个单个、操作员控制的、独立编程的、具有少于100毫秒的脉冲间隔的窄间隔电波，以及已适于接触被施加了多核苷酸疫苗的皮肤的电极。一系列至少三个波形具有以下特征中的一个、两个或三个特征(1)至少三个波形中的至少两个在波形幅度上彼此不同；( 至少三个波形中的至少两个在波形宽度上彼此不同；以及C3)至少三个波形中的第一组两个波形的第一波形间隔不同于该至少三个波形中的第二组两个波形的第二波形间隔，且电极被连接到所述窄间隔电波发生器。通过本发明装置的一个实施方式，在用电极接触皮肤之前就已经向皮肤施加了多核苷酸疫苗。这可以通过使用皮下注射针来实现。通过本发明装置的另一实施方式，将多核苷酸疫苗预先涂覆在电极上，且在电极与皮肤接触的同时施加给皮肤。提供快PulseAgile电波或窄间隔PulseAgile电波且使用任何适当的电极来向哺乳动物皮肤施加的装置由Cyto Pulse公司、810Cromwell Park Drive, Suite Τ, Glen Burnie, MD 21061 制造，且已知为名称 “Derma Vax”。在这方面，Cyto Pulse公司在互联网上公开了题为“Derma Vax ClinicalEvaluation Intra-dermal System” 的两页信息页，该信息页的网址是;http:// www, cytopulse. com/pdf/Datasheet% 20Derma% 20Vax. pdf。这两页题为 “Derma Vax Clinical Evaluation Intra-dermal System” 的信息页在此一并资作参考。提供快PulseAgile电波或窄间隔PulseAgile电波、且使用了适于哺乳动物皮肤施用的预涂覆电极的装置也由Cyto Pulse公司制造，且已知为名称“Easy Vax”。提供快RilseAgile电波或窄间隔RilseAgile电波的装置也由Cyto Pulse公司制造，且已知为名称“CCEP-40波形发生器”。如上所述，对于“CCEP-40波形发生器”的说明可参见上述题为"Derma Vax Clinical Evaluationlntra-dermal System，，的信息页。依照本发明的另一个方面，提供了一种向哺乳动物皮肤输送多核苷酸疫苗的方法，其中多核苷酸疫苗包含能表达CEA家族抗原的多核苷酸。依照本发明的另一个方面，提供了一种将多核苷酸疫苗输送至哺乳动物皮肤的方法，其中的多核苷酸疫苗包含能表达来自免疫球蛋白家族抗原中的一种抗原的多核苷酸， 该抗原选自以下抗原组，该抗原组包括多种免疫球蛋白超家族抗原，诸如Ig ；TCR ；I类和II 类主要组织相容性复合体(MHC)分子；胸腺细胞和T细胞(Thy-I)的单结构域蛋白质；髓鞘磷脂Ρ0;β2-微球蛋白；二结构域蛋白质一sprmge受体酪氨酸激酶(RTK)、海绵体粘附蛋白质(SAP)、果蝇酪氨酸激酶受体(DTKR)、爪蟾皮质-胸腺细胞受体(CTX)、人类(CTH)等等；以及结构域数目不等的一大类粘附蛋白、共同受体和Ig受体。依照本发明的另一个方面，提供了一种将多核苷酸疫苗输送至哺乳动物皮肤的方法，其中多核苷酸疫苗包含能表达来自人类PSA或者异源PSA的抗原的多核苷酸，其中PSA 是指前列腺特异性抗原。依照本发明的另一个方面，提供了一种将多核苷酸癌症疫苗输送到哺乳动物皮肤的方法，该方法包含的步骤为(a.)将多核苷酸癌症疫苗送药到送药点处的皮肤中，(b.)在送药点附近的皮肤上放置针状电极，(c.)施加一系列至少三个单个的、操作员控制的、独立编程的、具有少于100毫秒脉冲间隔的窄间隔电波，以通过电击将多核苷酸疫苗输送到皮肤细胞中，其中，该一系列至少三个波形具有以下特征中的一个、两个或三个特征(1)该至少三个波形中的至少两个在波形幅度上彼此不同；(2)该至少三个波形中的至少两个在波形宽度上彼此不同；以及C3)该至少三个波形中的第一组两个波形的第一波形间隔不同于该至少三个波形中的第二组两个波形的第二波形间隔。依照本发明的另一个方面，提供了一种将多核苷酸疫苗输送至哺乳动物皮肤的方法，其中所述多核苷酸癌症疫苗可针对那些能表达CEA的癌症，包括结直肠癌、胃癌、肺腺癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、胆囊和膀胱的癌症、子宫内膜腺癌和小细胞肺癌。上述简要描述较宽泛地阐述了本发明的更重要特征，以便可以更好地理解以下的本发明详细描述，且以便可以更好地理解对现有技术的贡献。当然，还有一些下面将予记叙、并用作所附权利要求主题的本发明附加特征。在这方面，在更详细地说明本发明的原理的一些实施方式之前，应理解本发明在其应用上不局限于该解释的的细节和在以下描述或附图中例示组件的配置。本发明能够实现且以各种方式进行其他实施方式。而且，还应理解，在此使用的短语和术语是用于描述的目的，且不应该认为是限制。如此，本领域技术人员将理解，该公开所基于的概念可以容易地被利用作为用于设计实现本发明的若干目的的其他结构、方法和系统的基础。因此，重要的是，权利要求被看作包括其不脱离本发明的精神和范围的等同解释。因此，本发明的目的是，提供用于将多核苷酸疫苗输送到哺乳动物皮肤中的新的改进的方法和装置，其用少于3. 5秒运送多核苷酸疫苗。本发明的另一目的是，提供用于将多核苷酸疫苗输送到哺乳动物皮肤中的新的改进的方法和装置，其向哺乳动物皮肤施加多个PulseAgile电波，并且这多个施加的电波仅导致一次肌肉收缩。本发明的再一目的是，提供用于将多核苷酸疫苗输送到哺乳动物皮肤中的新的改进的方法和装置，其给出所送药的多核苷酸疫苗成功进行遗传表达的证据。本发明的再一目的是，提供用于将多核苷酸疫苗输送到哺乳动物皮肤中的新的改进的方法和装置，其给出由于多核苷酸疫苗的成功遗传表达而提供所需蛋白质的证据。本发明的再一个目的是提供一种新的、改进的、多核苷酸疫苗输送方法和装置，其中所述多核苷酸疫苗可包括能表达成抗原的多核苷酸，该抗原包括癌胚抗原(CEA)和人类 CEA家族，该人类CEA族包含四个基因，其中18个基因被表达，其中7个属于CEA亚群，11 个属于妊娠特异性糖蛋白亚群。本发明的仍一个目的是提供一种新的、改进的、多核苷酸疫苗输送方法和装置， 其中所述多核苷酸疫苗可包括能表达成抗原的多核苷酸，该抗原包括免疫球蛋白超家族抗原，诸如Ig ;TCR;I级和II级主要组织相容性复合体(MHC)分子；胸腺细胞和T细胞 (Thy-I)的单结构域蛋白质；髓磷脂蛋白P0; β 2-微球蛋白；二结构域蛋白质一sprmge受体酪氨酸激酶(RTK)、海绵粘附蛋白质(SAP)、果蝇酪氨酸-激酶受体(DTKR)、爪蟾皮质胸腺细胞受体(CTX)、人类(CTH)等等；以及结构域数目不一的一大类粘附素、共同受体以及Ig 受体。本发明又一个目的是提供一种多核苷酸抗癌疫苗输送方法和装置，该癌症能表达 CEA，包括结直肠癌、胃癌、肺腺癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、胆囊和膀胱的癌症、子宫内膜腺癌和小细胞肺癌。这些目的连同本发明的再另外一些目的，连同表征本发明新颖性的各种特点，在附于并构成本公开的一部分的权利要求书中予以详细指出。为了更好理解本发明、其操作上的优点以及通过其运用达到的特定目的，须参考附图和举例说明本发明优选实施方式的叙述性内容。在所附且构成本公开的一部分的权利要求中具体地指出了本发明的这些以及其他目的、以及限定本发明的新颖性的各种特征。为了更好地理解本发明、通过其使用而获得的其操作优点和具体目的，应该必须参考附图和其中示出了本发明的优选实施方式的描述性主题。
在研究了以下详细的描述之后，将更好地理解本发明，且上述目的以及除了上述目的以外的目的将变得更清楚。这种描述参考附图进行，在附图中图1例示，用“Derma Vax”仪器电击输送荧光素酶质粒时，施加快PulseAgile电波相比于施加慢PulseAgile电波而引起的荧光素酶表达的比较。图2例示，用“Derma Vax”仪器电击输送荧光素酶质粒时，施加快PulseAgile电波相比于施加慢PulseAgile电波而引起的、对Dengue IDNA疫苗接种的T细胞应答的比较。图3例示，用“Derma Vax”仪器电击输送荧光素酶质粒时，施加快PulseAgile电波相比于施加慢PulseAgile电波而引起的荧光素酶表达的比较。图4示出并排的两幅图，举例说明h tet-wtCEA免疫后的CEA特异T细胞应答。 在相隔4周的两个时间点，在皮内经针注射+/-快脉冲输送AgileDermavax电击，BALB/ c小鼠(每组η = 7)接受40 μ g的tet-wtCEA DNA。读取⑶8-或者⑶4限制性CEA肽的 IFN-yELISpot0图5示出在用tet-wtCEA DNA结合快PulseAgile 和DermaVax 电击法进行单次免疫之后抗CEA免疫应答的诱导。更具体地说，图5中，在用tet-wtCEA DNA+电击单次免疫之后显示⑶4和⑶8T细胞应答。免疫的两周后，使用⑶8或⑶4限制性CEA肽对CEA特异性免疫应答进行IFN- y ELISpot法分析。图6示出在用tet-wtCEA DNA结合快PulseAgile 和DermaVax 电击法进行单次免疫之后抗CEA免疫应答的诱导。更具体地说，图6中，在用tet-wtCEADNA+电击进行免疫之后，显示CEA特异性抗体应答。DNA免疫的两周后，用ELISA分析CEA特异性抗体应答。

0123]用电极ID进入
0124]接种信息屏幕
0125]SKIN-测量皮肤每秒电阻并显示
0126]READY-接通高压电源
0127]START-启动脉冲(pulsing)
0128]DONE-接种完成
0129]模式2-由经过训练的IT专家建立
0130]脉冲参数
0131]下载数据文件
0132]输送电极
0133]疫苗输送量_
0134]2 个小泡 χ 25 μ 1 每 IDA-4-6
0135]2 个小泡 χ 50 μ 1 每 IDA-6-6
0136]输送目标-皮肤/真皮
0137]电极
0138]把手(handle)-用酒精清洁后可反复使用
0139]tip-
0140]无菌
0141]单独包装
0142]一次性
IDA-4-4
行间茬巨 4 mm 针/行4
针间距 1.5 mm 针直径 0.3 mm 针长度 2 mm V/d 最大 2500 v/cmCCEP-40波形发生器脉冲皮肤电阻脉冲-每秒5伏特4 μ s脉冲规程参数在一组中的参数脉冲宽度50 μ s到Ims 50到1000伏特50 μ s 至Ij IOms 50 至Ij 300 伏特
脉冲电流行程(trip) 26amps负荷范围15 到 1500ohms脉冲数量1到10
IDA-4-6 4 mm 6
1.5 mm 0.3 mm 3 mm 2500 v/cm
IDA-6-6 6 mm 6
1.5 mm 0.3 mm 3 mm 1667 v/cm
最大占空因数 50%间隔200 U s |IJ 1秒(脉冲开始到脉冲开始)组数量3脉冲测量内部数字化器(digitizer)7jC平12 比特采样脉冲宽度/8最小100 U s内部存储数据及存储在外部USB盘(USB key)上的数据数据类型原始数据DV<日期> xml日志数据DV〈日期>.txtCSV 数据 DV< 日期 > csv所有数据自动地存储在内部存储器中，且可下载到外部USB盘存储的且可从内部 闪存获得的最大数据日志>20000前面板计算机操作系统Windows Mobile 6. 0界面触摸屏具有照明的行/主开关(Line/Mains Switch)紧急停止按钮(将计算机复位到就绪状态)触摸屏USB 端口2电极连接器费希尔系列(Fischer Series)4032后面板功率条目IEC 320以太网RJ45电气和机械方面CCEP-40A有把手的箱子宽度 32mm x 高度 20mm x 长度 40mm宽度12. 6英寸x高度7. 9英寸X长度15. 7英寸重量25 磅，11. 3kg工作温度 10到40°C主电压100 至Ij 250vac保险5A slo bio, 5mm x 20mm电源保留>断电后5分钟以下阐述使用本发明将多核苷酸疫苗输送到哺乳动物皮肤的装置来实施本发明 方法的实验。实验1目的和范围
本次实验的目的是比较(使用Cyto Pulse的“Derma Vax”系统的)快RilseAgile 电波与(使用Cyto Pulse的PA-4000系统的)慢PulseAgile电波。新的Derma Vax系统可以比PA-4000更快地输送脉冲。背景Anna-Karin Roos医生披露了至少两个在小鼠皮肤中引发良好荧光素酶表达的波形。所使用的系统是PA-4000，且使用慢PulseAgile电波。已经给使用“CCEP-40波形发生器”的Derma Vax系统装配了新能力。一个显著的不同是Derma Vax系统可以输送具有更短脉冲间隔的脉冲。也就是说，通过“DermaVax”系统，可以提供少于100毫秒的脉冲间隔。 该实验将评估使用快PulseAgile电波对活体中荧光素酶表达的效果。方法使用的质粒来自Aldeveron的gWizLuciferase，在无菌PBS中5mg/ml被稀释到 0. 5mg/ml。系统DermaVax#F2LQ2608851电极真皮内阵列(4mm间隙，每行6针，2行)平行行电极。注射用带有呼吸孔的50ml锥管来约束小鼠。将小鼠头向前插入管中。尾巴垂在我的左手食指上。用小剪刀除去尾根的一小块毛发。用27号、0.5英寸的针配结核菌素注射器，在尾根和骶骨右侧真皮内注入20微升。该部位用Siarpee笔标记。将数行针插在注射点周围，使电极间隙从左向右，由此使这些行头尾相连。启动所选的电击方案，移除针。 在骶骨左侧重复该过程。组(即笼)。所有时间以毫秒示出。


本发明提供一种输送多核苷酸癌症疫苗以增加T细胞应答并缓解因长电波形应用(long electric waveform application)及因肌肉收缩所致疼痛的方法和装置。该方法包括(a)将多核苷酸癌症疫苗送药到送药点处的皮肤中，(b)在送药点附近的皮肤上放置针状电极，(c)以电击法(by electroporation)用一系列至少三种电波形将多核苷酸癌症疫苗输送到皮肤细胞中。所述一系列电波形具有下列各特征之一(1)各波形中至少二者的振幅不同，(2)各波形中至少二者的波宽不同，以及(3)各波形中第一组两个波形中的第一个波形间隙不同于第二组两个波形的第二波形间隙。

公开日2012年5月9日 申请日期2010年3月26日 优先权日2009年3月26日