专利名称：来自mage的免疫原性肽及其应用的制作方法图1MSR3-mel和MSR3-B37表达HLA I类分子。肿瘤细胞用mAbW6/32(抗HLA-I类)或同种型对照孵育、清洗和用偶联荧光素的羊抗鼠Ig抗体标记。在HLA-B*3701转染MSR3-mel之前和之后进行分析。图2CTLs 337识别HLA-B*3701限制的抗原。用自体黑素瘤MSR3mel及MSR3-B37，和不同效应物/靶(E/T)比的同种异体黑素瘤ETl来评估CTLs337的细胞毒活性。图3CTLs 337识别的肿瘤抗原的鉴定。单独用HLA-B*-3701或与编码MAGE-1、2、3、6和12基因的cDNA一起共转染Cos-7细胞。48小时后，加入CTLs 337并于24小时后按照“材料与方法”所述测量释放的γ干扰素。MSR3-B37作为阳性对照。图4A)CTLs 337识别肽MAGE.127-136。MSR3-EBV与从10mM开始三倍稀释的肽MAGE.127-136孵育并且在标准细胞毒性试验中用作靶细胞。E/T比固定在10∶1。最大量裂解一半需要的肽量表述为ED50。B)用竞争性试验评估肽M4.127-136和M12.1127-136对HLA-B*3701的结合。竞争肽包括M4.127-136肽KELVTKAEML和M12.1127-136肽REPFTKAEML。不能结合HLA-B*3701分子的M3.A1(也就是M3.271-279)肽用作阴性对照。没有竞争肽的裂解是52％。图5CTLs 337识别MAGE-6阳性的黑素瘤细胞系。HLAB*3701阴性系Me 14932和HLA-B*3701阳性系Me 14932-LB37用或不用16μM肽MAGE.127-136刺激，并且在按照所指明E/T比的标准细胞毒试验里用作靶细胞。材料和方法合成肽合成肽购自PRIMM(Milan，意大利)。肽是MAGE.127-136(REPVTKAEML)，由MAGE-1、2、3和6基因第127-136位密码子编码；M4.127-136(KELVTKAEML)和M12.127-136(REPFTKAEML)，分别对应于MAGE-4和MAGE-12基因编码的第127-136位氨基酸。肽在DMSO中溶解成10mM，并用0.9％NaCl进一步稀释。HLA-B*3701等位基因的亚克隆用RNeasy Total RNA Kit(QIAGEN，Hilden，德国)从MSR3 PBLs制备总RNA。用oligo-dT引物和没有RNase-H活性的莫洛尼鼠类白血病病毒来源的逆转录酶(MMLVRT RNase-H-Superscript；Gibco BRL，Gaithersburg，MD)按照生产商的建议从2μg总RNA进行单链cDNA合成。用适宜于HLA-B等位基因全长编码区特异性扩增和定向克隆的一对引物PCR扩增对应于300ng总RNA的cDNA。1.1kb的PCR-产物被亚克隆进真核表达载体pcDNA3.1(Invitrogen Corporation，Oxon，U.K.)。用诊断性限制性酶鉴定编码HLA-B*3701或B*52011(患者MSR3的HLA-B37和B5等位基因)的质粒克隆。再对该HLA-B*3701基因测序以证实与发表的DNA序列对应。这个质粒被称作pcDNA3.1/B*3701。黑素瘤细胞系的转染用磷酸钙沉淀技术用pcDNA3.1/HLA-B*3701转染黑素瘤细胞系并用G418选择。在流式细胞仪上用HLA-A、B和C特异性单克隆抗体W6/32证实在稳定的转染子中转染的HLA-B*3701分子的表达。
体外诱导细胞毒性T淋巴细胞系337(CTLs 337)按照以前他人描述的方案(Van den Eynde，等，Int.J.Cancer.，44634-640，1989)少许更改得到CTL系337。简要地说，用Ficoll梯度分离患者MSR3的PBLs，并在2ml补充了10％人血清(HS)、谷氨酰胺和抗生素的IMDM中用自体的辐射过的MSR3-B37黑素瘤细胞(0.5-1×105/孔)培养(1-2×106/孔)。培养三天后，加入10U/ml IL-2(Chiron，Milan，意大利)和5ng/ml IL-7(Genzyme Corp.)。淋巴细胞每周用0.5×105辐射过的MSR3-B37细胞再刺激，并且刺激三次后在细胞毒性试验中测定。第五次再刺激后，加入2×106LG2-EBV辐射过的LG2-EBV作为饲养层细胞并且IL-2提高到50U/ml。
细胞裂解活性和肽结合研究的试验按前述(Fleischhauer，K.，等，Cancer Res.，582969-2972，1998)铬释放试验检测细胞毒T细胞系的裂解活性。用铬释放试验检测肽51Cr-标记的靶细胞在以固定效应物/靶比值加入效应细胞前在96-孔微量培养板中与不同浓度肽室温孵育1小时。按以前描述(Herman，J.，等，Immunogenetics，43377-384，1996)用竞争性试验进行肽M4.127-136和M12.127-136对HLA-B*3701分子的结合。作为标准肽，我们用了CTLs 337识别的肽MAGE127-136(300nM)。按30∶1的E/T比使用CTLs。。
MAGE-1亚片段的产生用Bgl II和EcoRI消化MAGE-1 cDNA得到MAGE-1基因亚片段(495和1,072bp)。琼脂糖凝胶纯化后，片段被克隆进pcDNA3.1质粒(Invitrogen)。分离克隆，抽提质粒DNA并与HLA-B*3701基因一起转染Cos-7细胞。
Cos-7细胞的转染及γ-IFN释放试验用DEAE-葡聚糖-氯奎方法进行Cos-7细胞转染(Coulie，P.G.，等，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.)，916458-6463，1994)。简要地说，用100ng pcDNA3.1/B*3701质粒和100ng含基因MAGE-1、2、3、4、6和12之一的cDNA的表达载体转染1.5×104Cos-7细胞。48小时后对转染的Cos-7细胞进行γ-IFN试验检测5000个反应者CTLs在刺激后第5天加到补充了25U/ml IL-2的150μl IMDM/10％HS中。37℃下24小时后，收获100μl上清并用γ-IFN释放试剂盒(Genzyme，MA)按照生产商建议测量γ-IFN浓度。
逆转录病毒载体介导HLA-B*3701基因转移进Me14392按以前描述(Fleischhauer，K.，等，J.Immunol，1592513-2521，1997)构建了编码患者MSR3的HLA-B*3701分子的逆转录病毒载体B37-CSM。简要地说，编码HLA-B*3701分子的全长cDNAs被克隆到病毒LTR控制之下，而截短形式的人低亲和力神经生长因子受体( LNGFR)在Sv40启动子控制之下。亲嗜性的鼠成纤维细胞系GP+E86用30μg逆转录病毒结构按标准磷酸钙方法瞬时转染。在8μg/ml Polybrene存在时用转染的GP+E86细胞48小时培养上清感染双嗜性鼠包装细胞系GP+env Am 124个小时。用包被了LNGFR-特异性单克隆抗体20.4(美国典型培养物保藏中心(American Type Culture collection)，Rockville，MD)的磁珠(Dynabeads M-450，Dynal A.S.，Oslo，挪威)对感染的包装细胞进行 LNGFR表达的免疫选择。在polybrene(8μg/ml)存在时用含逆转录病毒的上清培养以转导Me 14932。进行5或6轮至少4小时的感染。用LNGFR特异性单克隆抗体20.4和HLA-Bw4-特异性单克隆抗体进行免疫荧光分析以评价感染的有效性。
RT-PCR分析通过PCR扩增检测MAGE-1、2、3、4、6、12和β2-微球蛋白(β2m)的cDNAs。反应混合物包含5μl cDNA悬液、4μl 10mM dNTPs混合物(含每种dNTP各2.5mM)、5μl 10×DNA聚合酶缓冲液(Finnzymes Oy，Espoo，芬兰)、2U DynaZyme DNA聚合酶(Finnzymes Oy)和无菌水补到50μl总反应体积。寡核苷酸引物序列和PCR扩增程序见Weynants等(Weynants，P.，等，Int.J.Cancer，56826-829，1994)(MAGE-1、2和3)，De Plaen等(De Plaen，E.，等，J.Immunol.，1592513-2521，1997)(MAGE-4、6和12)。用有义引物Beta5’(5’-AAC CAC GTG ACT TTGTCA CAG C-3’)，和反义引物Beta 3’(5’-CTG CTC AGA TAC ATC AAA CAT G-3’)扩增β2m cDNA；PCR扩增进行30个循环(94℃1分钟，56℃30秒和72℃2分钟)；β2m扩增产物的预期长度是230bp。用β-肌动蛋白特异性寡核苷酸引物进行PCR反应检测RNA完整性(De Smet，C.，等，Immnogenetics，39121-129，1994)。在溴化乙锭存在时在琼脂糖胶上看到适宜大小带的样品判定为阳性。
本发明将在下述实施例中做更详细描述。
实施例实施例1MSR3-B37诱导抗原特异性免疫反应从患者MSR3切除的皮肤转移癌建立黑素瘤细胞系MSR3。肿瘤细胞上HLA I类等位基因表达用HLA-A、B和C的特异性mAb W6/32进行免疫荧光分析来评价。
观察到的检测不出或刚刚可检测水平的表面分子(图1)似乎不足以使抗原呈递给免疫效应细胞。事实上，MSR3细胞系不能从自体的PBLs诱生细胞毒反应。MSR3-mel缺乏I类细胞表面表达不是由于损伤的β2m合成造成的，因为能够用RT-PCR检测到β2m特异性的mRNA。
为确定HLA I类抗原表达是否能够恢复，MSR3-mel细胞用编码自体HLA-B*3701分子的cDNA稳定转染。G418选择后，流式细胞仪分析表明转染的MSR3-B37细胞系被W6/32单克隆抗体所染色(图1)。
为评价MSR3-B37细胞系表面上是否存在肿瘤特异性抗原，检测了黑素瘤细胞诱生肿瘤特异性细胞毒效应细胞的能力和它们被这些CTLs裂解的易感性。按照“材料和方法”所述用MSR3-B37体外刺激患者的PBLs。刺激三轮后，多克隆细胞毒性T细胞系337(CTLs 337)特异性裂解MSR3B37细胞系，但不裂解未转染的MSR3-mel(图2)。自体的MSR3-EBV细胞和PHA-活化的T母细胞不被识别，表明这些CTLs识别的表位是黑素瘤/黑色素细胞特异的。事实上，除了自体的黑素瘤细胞外，CTLs 337也裂解HLA-B*3701阳性的黑素瘤细胞系ET1(图2)，表明识别一个或更多共有的黑素瘤抗原。
这些数据表明HLA I类表达能够通过MSR3黑素瘤细胞转染恢复，并且转染了HLA-B*3701分子的黑素瘤细胞系能够诱生肿瘤特异性的细胞毒性T细胞反应。
实施例2鉴定CTLs 337识别的抗原表位为鉴定CTLs 337识别的抗原，在转染了质粒pcDNA3.1/B*3701和编码MAGE家族6个成员(MAGE-1、2、3、4、6和12)的cDNA(某些被MSR3-mel和ET1两者表达)的Cos-7细胞存在下评价CTLs 337的γIFN释放。CTLs337特异性识别转染了MAGE-1、2、3和6的Cos-7细胞，表明CTLs 337的表位靶标在四个不同的抗原中是共同的，或者寡克隆(oligoclonal)T细胞系不同成分识别来源于四个MAGE-基因产物的肽。在MAGE-4和MAGE-12转染的Cos-7细胞存在时检测到低水平的γ-IFN(图3)。
为鉴定CTLs 337识别的编码抗原肽的序列，编码MAGE-1的cDNA用Bgl II和EcoRI消化得到2个大约是495和1,072bp的亚片段。这些片段被克隆进质粒pcDNA3.1并与HLA-B*3701分子一起转染进Cos-7细胞。分别在495和1,072bp片段的第202bp和707bp处存在符合读码框架的起始密码子，保证了转染细胞里这两个亚片段的表达。在转染了495bp片段的Cos-7细胞存在时CTLs 337释放的γ-IFN的水平可与整个MAGE-1基因转染的Cos-7细胞释放的水平相当，表明抗原肽在这个区域编码。筛选这个495bp片段编码氨基酸序列中携带HLA-B*3701结合基序的肽(Rammensee，H.G.，等，Immnogenetics，41178-228，1995)。鉴定出5个肽在位置2处是天冬氨酸或谷氨酸并在位置9/10处是异亮氨酸或亮氨酸。其中一个肽，REPVTKAEML，也存在于MAGE-2、MAGE-3和MAGE-6编码的氨基酸序列里。这个肽，命名为MAGE.127-136，在滴定实验中被用于使MSR3-EBV细胞系致敏以被CTLs 337裂解。MSR3-EBV细胞用肽REPVTKAEML刺激并再在细胞毒性实验中用作靶细胞(图4a)。90nM肽达到半数最大量裂解。没有观察到用能结合HLA-B*3701的无关肽刺激的MSR3EBV有裂解(图4b)。
CTLs 337在表达MAGE-4和MAGE-12的Cos-7细胞存在时释放低水平的γ-IFN(图3)。为证实这种释放是否能被归因于MAGE-4中127-136位密码子编码肽的识别，使用用两个肽刺激的MSR3-EBV作为靶细胞，进行肽结合研究。肽M4.127-136(KELVTKAEML)与肽REPVTKAEML有两个氨基酸不同(位置1处精氨酸换成赖氨酸，并在位置3处脯氨酸换成亮氨酸)，而肽M12.127-136(REPFTKAEML)仅有1个氨基酸不同(位置4处缬氨酸换成苯丙氨酸)。结果揭示两个肽能与HLA-B*3701结合，因为两者的量增加都能够抑制用肽REPVTKAEML而不是用无关HLA-A1-结合肽(即M3.271-279)刺激的MSR3-EBV的裂解(图4b)。然而，没有观察到用肽M4.127-136和M12.127-136刺激的EBV细胞的识别。
总之，这些数据表明CTLs 337能够识别内源性加工的MAGE-1、2、3和6肽。
实施例3CTL 337特异性识别MAGE-2和MAGE-6基因的产物迄今为止，不存在人MAGE-2和MAGE-6编码蛋白有免疫原性的证据。事实上，尽管已经鉴定出能够结合HLA I类分子形成被各种CTLs识别的抗原复合体的MAGE-1、3、4和12编码肽，但还没有鉴定出MAGE-2或MAGE-6基因编码的肽。
为了证明在黑素瘤细胞中肽REPVTKAEML能够从MAGE-2和MAGE-6基因被加工并呈递给CTLs 337，曾寻找表达MAGE-2或MAGE-6而不表达其它MAGE基因的黑素瘤细胞系。不幸的是，黑素瘤中MAGE基因的表达是严格相关的，并且大多数黑素瘤表达MAGE基因家族一个以上的成分。事实上，没有能发现选择性地表达MAGE-2的黑素瘤细胞系，而发现了一株选择性表达MAGE-6的黑素瘤细胞系，Me 14932。
用每个MAGE基因的特异性寡核苷酸引物对Me 14932黑素瘤细胞系作RT-PCR分析，证实仅MAGE-6为阳性，呈低表达水平。为确定REPVTKAEML肽是否从MAGE-6产物内源性加工并被HLA-B*3701呈递，按照“材料和方法”所述用编码HLA-B*3701分子和一个表面标记(ΔLNGFR)的逆转录病毒载体转导Me14932。转导的细胞，Me 14932-LB37，用磁珠免疫选择ΔLNGFR的表达。用HLA-Bw4-特异性mAb做的免疫荧光分析表明，在Me 14932转导细胞表面上HLA-B*3701的表达比MSR3-B37黑素瘤细胞至少低两倍。在细胞毒性实验中CTLs 337能够识别Me 14932-LB37细胞系，并且外源性(hexogenous)加入肽REPVTKAEML时裂解水平提高，而刺激的和没刺激的Me 14932细胞系不被识别(图5)。Me 14932-LB37黑素瘤的低裂解水平可能与MAGE-6基因的低表达或与HLA-B*3701表面分子的低表达有关。
为评价在肿瘤特异性免疫治疗的靶抗原名单中包括MAGE-2和MAGE-6是否能够提高可治疗患者的比例，分析了各种组织类型新鲜肿瘤样品中MAGE-1、2、3和6的表达。没有分析黑素瘤，因为不同MAGE基因的表达明确相关联(Dalerba，P.，等，Int.J.Cancer，77200-204，1998)。结果表明，12％的卵巢癌和5％的结肠癌及乳腺癌表达MAGE-2和/或MAGE-6，而缺乏MAGE-1和MAGE-3(表)。另一方面，在所有研究的膀胱癌和肺癌中这四个基因总是共表达的。
总之，本研究中报告的数据表明MAGE-2和MAGE-6能够被包括在肿瘤特异性免疫治疗可能的靶抗原名单中，提高了能从这种治疗受益的患者数量。
表新鲜肿瘤样品中MAGE基因的表达(a)组织类型 MAGE-1MAGE-3MAGE-2MAGE-6仅MAGE-2或MAGE-6肺癌(n 28)(b)35 39 32 290乳腺癌(n 20) 30 10 10 155卵巢癌(n 25) 24 20 32 2012膀胱癌(n 25) 28 28 20 240结肠癌(n 17) 0 5 5 5 5(a)逆转录-PCR分析确定的。结果表示为RT-PCR阳性肿瘤的百分数(％)(b)分析的新鲜肿瘤样品数量参考文献1.Marchand，M.，van Baren，N.，Weynants，P.，Brichard，V.，Dreno，B.，Tessier，M，-H.，Rankin，E.，Parmiani，G.，Arienti，F.，Humblet，Y.，Bourlond，A.，Vanwijck，R.，Lienard.D.，Beauduin，M.，Dietrich，P.-H.，Traversari，C.，Kerger.J，Masucci，G.，Jager，E.，DeGreve，J.，Atzopodien，J.，Brasseur，F.，Coulie，P.G.，van der Bruggen，P.，和Boon，T.，MAGE-3基因编码并由HLA-A1提呈的抗原肽治疗的转移黑素瘤患者中观察到的消退。Int.J.Cancer，80219-230.1999.
2.Jager，E.，Ringhoffer，M.，Altmannsberger，M.，Arand，M.，Karbach，J.，Jager，D.，Oesch，F.，和Knuth，A.，体内免疫选择转移黑素瘤中MHC I类独立的缺失和黑色素细胞分化抗原表达。Int.J.Cancer，71142-147，1997.
3.Van den Eynde，B.J.和van der Bruggen，P.，T细胞限制的肿瘤抗原。Curr.Opin.Immunol.，9684-693，1997.
4.van der Bruggen，P.，Traversari，C.，Chomez，P.，Lurquin，C.，DePlaen，E.，Van den Eynde，B.，Knuth，A.，和Boon，T.，一个编码能被细胞裂解性T淋巴细胞识别的人黑素瘤抗原的基因。科学(Science)，2541643-1647，1991.
5.Van den Eynde，B.，Peeters，O.，De Backer，O.，Gaugler，B.，Lucas，S.，e Boon，T.一个编码能够被自体的细胞裂解性T淋巴细胞识别的人黑素瘤抗原的新基因家族。J.Exp.Med.，182689-698，1995.
6.Boel，P.，Wildmann，C.，Sensi，M.L.，Brasseur，R.，Renauld，J.C.Coulie，P.，Boon，T.和vam der Bruggen，P.BAGE一个编码被细胞裂解性T淋巴细胞识别的人黑素瘤抗原的新基因。Immunity，2167-175，1995.
7. Coulie，P.G.，Brichard，V.，VanPel，A.，Wolfel，T.，Schneider，J.，Traversari，C.，Mattei，S.，De Plaen，E.，Lurwuin，C.，Szikora，J.P.，Renauld，J.C.和Boon，T.一个编码被与体内肿瘤排斥相关的自体细胞裂解性T淋巴细胞识别的分化抗原的新基因。美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.)，916458-6463，1994.
8.Weynants，P.，Lethe，B.，Brasseur，F.，Marchand，M.，和Boon，T.非小细胞肺癌表达MAGE基因。Int.J.Cancer，56826-829，1994.
9.Restifo，N.P.，Marincola，M.F.，Kawakami，Y.，Taubenberger，J.，Yannelli，J.R.，和Rosenberg，S.A.五个接受免疫治疗的转移性黑素瘤患者中功能性β2-微球蛋白的丢失。J.Natl.Cancer.Inst.，88100-108，1996.
10.Van den Eynde，B.，Hainaut，P.，Herin，M.和Knuth，A.人黑素瘤中存在多个被自体CTL识别的抗原。Int.J.Canver.，44634-640.1989.
11.Fleischhauer，K.，Gattinoni，L.，Dalerba，P.，Lauvau，G.Zanaria，E.，B.，D.，van Endert，P.M.，Bordignon，C.和Traversari，C.，DAM基因家族编码一组新的被人白细胞抗原A2限制的细胞毒性T淋巴细胞识别的肿瘤特异性抗原。Cancer Res.，582969-2972，1998.
12.Herman，J.，van der Bruggen，P.，Luescher，I.F.，Mandruzzao，S.，Rome-ro，P.，Thonnard，J.，Fleischhauer，K.，Boon，T.，和Coulie，P.G.人MAGE-3基因编码的肽诱生识别表达MAGE-3的肿瘤细胞的细胞裂解性T淋巴细胞。Immunogenetics，43377-384，1996.
13.Fleischhauer，K.，Tanzarella，S.，Russo，V.，Sensi，M.L.，vander Bruggen，P.，Bordignon，C.，和Traversari，C.，细胞毒性T细胞克隆呈递一MAGE-3编码肽揭示了HLA-A*02亚型的功能异质性。J.Immunol.，1592513-2521，1997.
14.De Plaen，E.，Arden，K.，Traversari，C.，呈递MAGE-3编码肽给细胞毒性T细胞克隆揭示了HLA-A*02亚型的功能异质性。J.Immuol.，1592513-2521，1997.
15.De Smet，C.，Lurquin，C.，van der Bruggen，P.，De Plaen，E.，Brasseur，F.，和Boon，T.人MAGE-2基因的序列和表达模式。Immunogenetics，39121-129，1994.
16.Rammensee，H.G.，Friede，T.，和Stefanovic，S.MHC配基和肽基元第一张清单。Immunogenetics，41178-228，1995.
17.Dalerba，P.，Ricci，A.，Russo，V.，Rigatti，D.，Nicotra，M.R.Mottolese，M.，Bordignon，C.，Natali，P.G.，和Trversari，C.人黑素瘤多个同发性转移瘤簇中MAGE、BAGE、GAGE、酪氨酸酶及Melan-A/MART-1基因表达的高度均一性暗示治疗性抗原特异性免疫策略的方案设计，Int.J.Cancer，77200-204，1998.
18.Garrido，F.，Cabrera，T.，Concha，A.，Glew，S.，Ruiz-Cabello，F.，和Stern，P.L.，肿瘤发展过程中HLA表达的自然历史。Immunol.Today，14491-499，1993.
19.Lehmann，F.，Marchand，M.，Hainaut，P.，Poullart，P.，Sastre，X.，Ikeda，H.，Boon，T.，和Coulie，P.，黑素瘤患者两例连续的转移中细胞裂解性T细胞识别的抗原不同符合免疫选择。Eur.J.Immunol.，25340-347，1995.
序列表<110>GENERA S.P.A<120>来自MAGE的免疫原性肽及其应用<130>Genera<140><141><160>3<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>10<212>PRT<213>人<400>1Arg Glu Pro Val Thr Lys Ala Glu Met Leu1 5 10<210>2<211>10<212>PRT<213>人<400>2Lys Glu Leu Val Thr Lys Ala Glu Met Leu1 5 10<210>3<211>10<212>PRT<213>人<400>3Arg Glu Pro Phe Thr Lys Ala Glu Met Leu1 5 10


本发明涉及来源于MAGE家族蛋白质的肽及其作为治疗肿瘤的免疫原的用途,含有它们的组合物,诱导针对肿瘤细胞的细胞毒反应的方法,不表达组织相容性抗原的黑素瘤细胞系以及应用。