专利名称：一种乙型肝炎病毒核酸定量检测方法与试剂盒的制作方法我国是乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus, HBV)感染和传播发病的大国，近年来在我国一直呈高发趋势，严重危害人民健康，临床上HBV核酸的荧光定量PCR检测是预防、诊断HBV感染和评价治疗效果的有效手段。HBV核酸荧光定量PCR检测首先需要进行样品核酸提取，目前国内外临床应用的核酸提取方法主要有:(I)碱裂解煮沸法，或同时先进行多聚糖浓缩沉淀HBV病毒，在沉淀中加入裂解液煮沸提取核酸；(2)硅胶膜吸附柱法，采用硅胶膜层析柱吸附、清洗、洗脱获得核酸；(3)磁珠吸附法，采用磁珠吸附、清洗、洗脱获得核酸。磁珠吸附法具有提取的核酸纯度、效率较高的优点，且相对于传统的碱裂解煮沸法更适合于自动化操作，是未来病原体核酸提取的发展方向。另一方面，在HBV荧光PCR检测中需要防止结果的假阴性和假阳性，提高检测准确性，前者可以通过引入内参照监测样本提取过程中的误操作与核酸丢失、反应中的PCR抑制物作用，从而避免检测结果假阴性；后者可以在扩增体系中使用脱氧尿嘧啶核苷酸-尿嘧啶糖基化酶系统(dUTP-UNG)，降解扩增产物引起的污染，减少检测结果假阳性。目前临床上已经有一些HBV核酸定量检测产品上市应用，采用碱裂解煮沸方法提取样品HBV DNA者居多，也有采用硅胶膜吸附柱法和磁珠法提取，但所取的样品在50 200 μ I之间、体积偏少，同时没有使用内参照，结合荧光PCR技术检测后存在结果准确性和灵敏度不足的缺点，试剂盒质量需要改进和提高。针对这些问题，本发明采用磁珠法提取大体积样品中核酸，并在荧光PCR检测时应用竞争性内参照和dUTP-UNG酶防污染系统，减少检测结果的假阴性和假阳性，提高检测的准确性和灵敏度。
本发明的目的是提供一种HBV核酸定量检测的方法与试剂盒，采用磁珠法提取400μ I Iml大体积样品中的HBV和内参照核酸，并经荧光PCR定量检测，采用的竞争性内参照和dUTP-UNG防污染系统可以减少检测结果的假阴性和假阳性，从根本上解决了现有方法存在的检测准确性差、灵敏度低的不足，适合在临床HBV核酸定量检测中应用。技术方案本发明的技术方案为:一种HBV核酸定量检测的方法与试剂盒，其特征在于，采用磁珠法提取400 μ I Iml体积样品中的HBV和内参 照核酸为模板，并基于荧光PCR技术完成HBV核酸定量检测。试剂盒包含核酸提取试剂、扩增试剂、校准品、对照品和内参照，对照品包括阴性对照和临界阳性对照。所述的HBV核酸定量检测方法与试剂盒，其中磁珠法提取和荧光PCR检测HBV核酸的步骤为:取400μ I Iml血清或血浆样品，加入等体积裂解缓冲液、5 μ I内参照、20 μ I磁珠混合保持IOmin ;磁吸Imin后弃上清，在磁珠中加入800 μ I清洗缓冲液W1，混合Imin ;磁吸Imin后在磁珠中加入800 μ I清洗缓冲液W2,混合Imin ;磁吸Imin后在磁珠中加入100 μ I洗脱缓冲液，混合5min，磁吸Imin后取洗脱的核酸20 μ I加入30 μ I PCR反应液做荧光PCR检测。所述的HBV核酸定量检测试剂盒，其核酸提取试剂部分包含裂解缓冲液、磁珠、清洗缓冲液W1、清洗缓冲液W2、洗脱缓冲液，其中裂解缓冲液含有50mMTris-HCl (pH8.0)、4 6M 盐酸胍、I 5% (w/v)SDS、10 30% (v/v) TritonX-100，清洗缓冲液 Wl 含有 IOmMTris-HCl (ρΗ8.0)、30% 乙醇，清洗缓冲液 W2 含有 IOmM Tris-HCl (ρΗ8.0)、80% 乙醇，洗脱缓冲液含有I IOmM Tris-HCl (ρΗ8.0)溶液。所述的HBV核酸定量检测的方法与试剂盒，核酸扩增试剂部分包含PCR缓冲液、HBV引物探针、Taq酶，每个测试分别取PCR缓冲液15 μ 1、HBV荧光探针10 μ 1、Taq酶5μ I以及模板20μ I共50μ I反应体系进行扩增反应，由此组成的反应体系中含有IOmMTris-HCl (pH8.3)、50mM KC1、0.2mM (1阶卩8(包括(^1 、(《^1(101(1^13等比例)、1.5 51111MgCl2、各0.2 0.5μΜ HBV引物和HBV荧光探针以及内参照荧光探针、I 5U Taq DNA聚合酶和0.01 IU UNG酶。所述的HBV核酸定量检测的方法与试剂盒，扩增试剂部分中的引物探针经过特异性设计和筛选获得，包括一对HBV特异性引物、一条HBV荧光探针和一条内参照探针，且一对引物具有SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的序列；HBV荧光探针具有SEQ ID NO:3序列且其5’端标记FAM荧光基团、3’端标记TAMRA或BHQ-1淬灭基团；内参照荧光探针具有SEQID NO:4序列且其5’端标记HEX或JOE或VIC荧光基团、3’端标记TAMRA或BHQ-1淬灭基团；引物探针序列也可以是和上述序列同源性大于85%以上的序列。上述引物探针详细核苷酸序列(5’ -> 3’ )如下:`HBV 上游引物(SEQ ID NO:1):CATAT TCCTC TTCAT CCTgC TgHBV 下游引物(SEQ ID NO:2):gACAAACggg CAACATACCHBV 荧光探针(SEQ ID NO:3) =TgCCT CATCT TCTTg TTggT TCT，5，端标记 FAM 荧光基团，3’端标记TAMRA或BHQ-1淬灭基团。内参照荧光探针(SEQID NO:4) =TTCTC CTACT CgCCTTCACC gTC，5’端标记 HEX 或JOE或VIC荧光基团，3’端标记TAMRA或BHQ-1淬灭基团。所述的HBV核酸定量检测的方法与试剂盒采用竞争性内参照，扩增模板具有和HBV扩增产物相同长度的核苷酸序列，但HBV荧光探针位置序列用内参照荧光探针序列取代，内参照模板(SEQ ID NO:5)详细序列为(5，- > 3’):CATATTCCTCTTCATCCTgCTgCTATTCTCCTACTCgCCTTCACCgTCTCTggACTATCAAggTATgTTgCCCgTTTgTC通过人工合成上述内参照模板序列，并克隆到腺病毒载体中获得含有内参照模板的假病毒，最后用HBV阴性血清稀释后制得试剂盒内参照。所述的HBV核酸定量检测的方法与试剂盒还包括定量校准品4个、对照品2个，定量校准品为含有HBV扩增片段的假病毒血清，浓度为5.0xl06IU/ml、5.0xl05IU/ml、5.0xl04IU/ml、5.0xl03IU/ml，对照品包括阴性对照和临界阳性对照，前者为HBV阴性血清，后者为HBV阳性血清且浓度在1.0 5.0xl02IU/ml。有益效果本发明根据上述设计的技术方案，所具有的技术优点和在用于HBV核酸定量检测时产生的有益效果如下:(I)灵敏:本发明采用磁珠法提取大样本提取样品中的核酸作为模板，并经特异性引物探针荧光PCR检测，HBV检测灵敏度可达到10IU/ml。(2)准确:本发明采用竞争性内参照，可以避免样品提取加样中的核酸丢失或误操作、以及可能的PCR抑制物引起的检测结果假阴性；采用dUTP-UNG酶防污染系统可以解决PCR扩增产物污染的问题，降低了交叉污染的可能性，减少检测结果假阳性，从而提高HBV检测结果的准确性。(3)自动化:本发明操作简便快速，不仅适合通常规模血液样品检测，也可以通过自动化实现大规模样品的高通量检测。试剂盒的上述特点，均为采用磁珠法提取大体积样品中核酸、并结合竞争性内参照的双波长荧光PCR检测方法实现，获得的检测结果可以用于判断HBV感染病情、预测抗病毒治疗效果、为临床病毒载量检测和治疗药物筛选提供参考依据，具有广阔的应用前景。

图1为试剂盒4个定量校准品扩增曲线，从高到低浓度分别为5.0xl06IU/ml、
5.0xl05IU/ml、5.0xl04IU/ml、5.0xl03IU/ml。图2为试剂盒HBV DNA定量标准曲线，横坐标是HBV DNA定量值的对数(Log CO)，纵坐标是PCR循环数值(Ct)。

含有IOmM Tris-HCl (pH8.0)、30% 乙醇。(3)清洗缓冲液W2含有IOmM Tris-HCl (ρΗ8.0)、80% 乙醇。(4)洗脱缓冲液为IOmM Tris-HCl (ρΗ8.0)溶液。(5)磁珠(6) PCR 缓冲液含有33.33mM Tris-HCl (ρΗ8.3)、166.67mM KCl、0.67mM dNTPs、IOmMMgCl2、
0.2-0.5 μ M HBV引物、HBV荧光探针以及内参照荧光探针。(7) HBV引物探针含有一对HBV上下游引物(SEQ ID NO:1和2)、一条HBV荧光探针(SEQID NO:3)以及一条内参照荧光探针(SEQ ID NO:4)，浓度均为1.5mM。(8) Taq 酶含有Taq DNA 聚合酶 0.4U/ μ 1、UNG 酶 0.0IU/ μ I。(9)定量校准品定量校准品共有 4个，为含有HBV扩增片段人工假病毒的稀释血清，浓度分别为
5.0X103IU/ml、5.0X104IU/ml、5.0X105IU/ml、5.0X106IU/ml。(10)临界阳性对照临界阳性对照有I个，为HBV阳性血清，浓度为1.0 X 102IU/ml。(11)阴性对照阴性对照有I个，为HBV阴性血清。(12)内参照为含有SEQ ID NO:5内参照模板序列的人工假病毒经过HBV阴性血清稀释，内参照浓度为103copy/ml。上述配制的试剂盒各组分中，核酸提取部分(I) (5)置于室温保存；核酸扩增部分(6) ⑶和定量校准品、对照品以及内参照置于_20°C保存。核酸扩增部分使用时，每个测试取PCR缓冲液15 μ 1、HBV引物探针10 μ 1、Taq酶5 μ I混于PCR反应管中共30 μ 1，并加入磁珠法处理血清提取的模板20 μ 1，反应体积共为50 μ 1，体系中含有 IOmM Tris-HCl (ρΗ8.3)、50mM KC1、0.2mMdNTPs、3mM MgCl2、各 0.3μΜHBV引物和HBV荧光探针以及内参照荧光探针、2U Taq DNA聚合酶和0.05U UNG酶。反应管置于荧光PCR仪上的扩增程序为:50°C 2min、94°C 5min后按照94°C 10sec、60°C 45sec循环45次，并在60°C时采集FAM和JOE通道荧光信号，扩增结束后用仪器软件分析定量检测结果。实施例2:试剂盒检测灵敏度的测定(I)血清样品HBV DNA提取采用中国药品生物制品检定所乙肝病毒(HBV)核酸定量标准品标定的已知浓度HBV DNA阳性血清3个稀释梯度为待测定样品(浓度各为1.0X lOhU/mlU.0X 102IU/ml、1.0X103IU/ml)，测定实施例1中配制的试剂盒检测HBV DNA的灵敏度。样品HBV DNA提取操作步骤如下:
①取上述三种浓度血清样品，与试剂盒4个定量校准品、临界阳性对照以及阴性对照一起各800 μ 1，分别加入800 μ I裂解缓冲液、20 μ I磁珠以及5 μ I内参照，置于2ml离心管均匀混合,室温放置lOmin。②将上述样品裂解混合液分别磁吸Imin后弃上清，在磁珠中分别加入800 μ I清洗缓冲液Wl,混合Imin,磁吸Imin后弃上清。③在磁珠中分别加入800 μ I清洗缓冲液W2,混合Imin ;磁吸Imin后弃上清。④在磁珠中分别加入100 μ I洗脱缓冲液，混合5min，磁吸Imin后取洗脱的核酸用于20 μ I加入30 μ I PCR反应液做荧光PCR检测。(2)荧光PCR检测取PCR缓冲液15μ lXn、HBV引物探针10μ lXn、Taq酶5 μ I Xn混于一离心管中(η为待扩增样品数)，旋涡振荡器上振荡混匀10秒，按每个反应管30 μ I分装。分别加入(I)中提取的试剂盒阴性对照、临界阳性对照、4个定量校准品、以及3个血清样品模板各20 μ I, 3个血清样品模板每个做5个重复测定。每个反应管体积为50 μ I,将上述反应管放到ΑΒΙ7500荧光PCR仪上，先在50°C反应2分钟，然后94°C保温5分钟，再按94°C 10秒—600C 45秒循环45次。60°C采集FAM和JOE荧光通道的信号，扩增结束后用仪器软件分析定量检测结果。(3)结果分析试剂盒对1.0X 102IU/ml、l.0X 103IU/ml浓度的样品分别检测5次结果均为阳性，
1.0X IO1IUAiI浓度样品检测5次中有I次阴性，因此可以确定试剂盒检测灵敏度可以达到10IU/ml。

本发明试剂盒荧光PCR检测HBV DNA定量校准品扩增曲线和标准曲线分别如附图1和2所示。 实施例3:试剂盒在血清HBV DNA提取检测中的应用(I)血清样本HBV DNA提取取5例已知浓度HBV DNA阳性血清，采用实施例1配制的本发明试剂盒进行提取检测，并选择上海克隆生物高技术有限公司的HBV核酸荧光定量PCR检测试剂盒作对照进行提取检测。本发明血清HBV DNA提取步骤同实施例2，取洗脱的核酸做荧光PCR检测。上海克隆生物高技术有限公司对照试剂盒样本核酸提取方法为:取50 μ I血清，分别加入50 μ I核酸提取液Α,振荡混勻IOsec, 13，OOOrpm离心IOmin,弃上清；分别加入50 μ I核酸提取液B至沉淀中，振荡混勻IOsec, 100°C保温IOmin, 13, OOOrpm离心2min,取上清做突光PCR检测。(2)荧光PCR检测本发明血清HBV DNA提取后进行试剂盒组分配制、加样和荧光PCR检测的步骤同实施例2。对于对照试剂盒，按照说明书配制检测试剂，取HBV PCR缓冲液30 μ I Xn、MgCl2 5 μ I Xn、突光探针5 μ I Xn、Taq酶3 μ IXn混于一离心管中，旋润振荡器上振荡混匀10SeC，按每个反应管43μl分装。分别加入试剂盒阴性对照和定量校准品、以及提取血清样品模板各7 μ I。每个反应管体积为50 μ I，将上述反应管放到ΑΒΙ7500荧光PCR仪上，反应管先在50°C反应2分钟，然后94°C保温5分钟，再按93°C 30秒一60°C 90秒循环40次。60°C采集FAM荧光通道的信号。扩增结束后按照试剂盒说明书分析判断实验结果。(3)结果分析本发明试剂盒与对照试剂盒检测5例已知浓度HBV阳性血清样本结果如表I所示，可知本发明试剂盒对5.0xl02IU/ml以下的HBV阳性血清样本能检出阳性，而对照试剂盒没有检出阳性，说明本发明的HBV核酸定量检测试剂盒灵敏度高于对照试剂盒。表I两种试剂盒荧光PCR检测HBV阳性血清结果


本发明为一种乙型肝炎病毒(HBV)核酸定量检测的方法与试剂盒，包括采用磁珠法提取样品中的HBV与内参照核酸为模板，基于荧光PCR技术完成HBV核酸定量检测，引入的内参照可以用于监测操作过程中核酸模板的丢失、误操作或存在的PCR抑制物，避免结果假阴性；采用的dUTP-UNG酶系统可以减少扩增产物交叉污染，防止结果假阳性。试剂盒包含核酸提取试剂、扩增试剂、定量校准品、对照品和内参照。本发明从根本上解决了现有方法存在的检测准确性差、灵敏度低的不足，适合在临床HBV核酸定量检测中应用。