专利名称：一种生物传感器及基因捕获系统的构建方法合成生物学是生命科学的最新分支领域之一，它通过分子生物学手段，对细胞软件(以DNA为代表的遗传物质)和硬件(以核糖体为代表的细胞器)进行系统改造，使之具备特定功能。这些活体细胞能自我复制并作为“合成エ厂”，将简单和低价的能量和物质(例如阳光与ニ氧化碳)转化为具有高附加值的药物、材料和生物能源，将化学品的浓度或毒性转变为可被测量的信号，或用于消除难降解污染物。发展合成生物学，对于解决关系国计民生相关的重大经济与技术问题有着长远的战略意义和现实的策略意义，因此，2009年英国皇家工程学会报告指出，合成生物学带来的突破和效益“必将成为国家财富的重要组成部分”。合成生物学技术的发展首先取决于具有创新功能的生命组分(基因、蛋白、细胞、群落等)的获得，以及对细胞内生命组分的运作机制的理解，而两大瓶颈制约了上述关键过程。首先，作为分子生物学研究中最易操作的研究对象与载体，微生物的生物量大约占据了全球总生物量的一半，其所提供的各种合成、代谢、调控基因和蛋白，使微生物成为合成生物学的最重要资源库。对微生物的细胞工程、基因工程改造，已经应用于エ业、农业、医药、环保等领域并产生巨大的价值。目前微生物资源获取主要依赖于细胞培养分离，然而根据估计，自然环境中超过99%的微生物为不可培养微生物，不能通过传统的培养方法分离和研究，这些不可培养微生物中蕴含着大量未知的功能基因，且可能具有比可培养微生物 更重要的功能。不可培养微生物数量巨大，Craig Venter在百慕大Sargasso海域研究中，仅在数百升海水中就发现了 148种新的微生物和大约120万个未知基因。另有研究表明，仅I克土壤中就含有超过18，000种微生物，这ー数字已经超过已知原核生物的总数(16，177种)。通过相关研究，人们逐渐认识到不可培养微生物作为ー种尚未被开发的生物资源，在生物能源、エ业生物催化、环境修复、医药等领域具有难以估量的价值。现有基因捕获技术主要依靠宏基因组学、宏转录组学和宏蛋白组学，通过直接分析环境样品中获取的DNA、RNA和蛋白质，研究其微生物功能基因与环境条件之间的关系。由于RNA稳定周期短、蛋白质纯化和扩增困难，因此宏转录组学宏基因组学的研究受到很大局限。现阶段主要采用宏基因组学，基于其分析结果获得数据庞大的宏基因组数据库。通过序列驱动筛选和功能驱动筛选两大类主要研究方法，鉴定环境微生物资源中可能具备的功能基因。序列驱动筛选主要依靠两类技术获得功能基因信息。第一类技术通过对特定环境样品的完全测序和大量生物信息学手段分析序列来获得基因数据。第二类技术使用简并引物或探针，通过链式聚合酶反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)或不同的杂交手段获得与已知功能基因序列类似的环境样品中的基因。然而序列驱动筛选所面临的主要问题是缺乏对所获取未知基因的功能解析，也不能确定相关未知基因在实际环境条件下的功能性。功能驱动筛选主要依靠将未知基因导入到合适的宿主菌中表达，通过宿主菌所获得的新表观形态或代谢功能来确定未知基因的功能性。现有宿主菌的分选方法主要依靠表观形态识别(基于颜色和形态改变)或限制性培养基(基于唯一碳源或抗生素)，限制了其分选的适用范围和可筛选基因的种类
为了解决上述问题，本发明提出了一种以现有的宏基因组学相关技术为基础而开发的基于全细胞生物传感器的微生物新型功能基因捕获系统的构建方法及其应用方法。该方法可用于已知或未知基因的捕获。本发明提供的生物传感器是以不动杆菌Acinetobacter baylyiADPl为底盘生物构建的转化体或重组体，其构建方法包括以下步骤在不动杆菌Acinetobacterbaylyi ADPl 的 salA-salR基因中构建BamHI 和 EcoRI限制性内切酶酶切位点，通过引物及引物上的BamHI酶识别位点和EcoRI酶识别位点获得不动杆菌Acinetobacter baylyi ADPl的salA-salR基因的5，部分和3，部分；将salA-salR基因的5’部分和3’部分连接，获得完整的salA_salR基因；将所述salA-salR基因与pGEM-T载体连接，获得重组表达载体pSalAR_BE，进而获得质粒 pSalAR_BE ；利用内切酶酶切所述质粒pSalAR_BE，获得线性pSalAR_BE ；将经过内切酶酶切的含有报道基因的质粒和所述线性pSalAR_BE连接，获得含有所述报道基因的表达载体；利用所述含有报道基因的表达载体筛选具有所述报道基因特性的单克隆菌株；利用所述单克隆菌株和所述Acinetobacter baylyi ADPl的感受态细胞浓缩液筛选出具有所述报道基因特性的所述生物传感器。作为优选，用于获得获得不动杆菌Acinetobacter baylyi ADPl的salA-salR基因的5’部分的引物是Pl :5，-CTCAAAGGAAATGAGTCGTGGGTA-3’P2 :5 ’ -TCAAAACACTCTGGATCCGAATTCTTAGCG-3，所述弓I物P2上具有BamHI酶识别位点；用于获得不动杆菌Acinetobacter baylyi ADPl的salA-salR基因的3’部分的引物是P3 :5’ -CGCTAAGAATTCGGATCCAGAGTGTTTTGA-3’P4:5’ -GACCTGAGTATGCCCGGTAG-3’所述引物P3上具有EcoRI酶识别位点。作为优选，所述报道基因是发光基因luxCDABE，含有所述发光基因luxCDABE的表达载体是pSalAR_lux,所述生物传感器是能够生物自发光的单克隆Acinetobacter baylyiADPWH_lux0作为优选，所述报道基因是绿色萤光蛋白基因gfp，含有所述绿色萤光蛋白基因gfp的表达载体是PSalAR_gfp，所述生物传感器是在蓝色波长范围的光线的激发下发出绿色萤光的单克隆 Acinetobacter baylyi ADPWH_gfp。作为优选，所述连接是利用T4 DNA连接酶实现的。本发明提供的基因捕获系统的构建方法，包括基因片段的捕获和对所述捕获的基因片段进行测序得到所述捕获的基因片段的序列，所述基因片段的捕获包括以下步骤从环境样品中提取总DNA，从所述总DNA中分离出被稳定同位素标记的DNA，对所述被稳定同位素标记的DNA进行预处理，得到随机外源DNA片段，即为捕获的基因;对所述捕获的基因进行测序包括以下步骤将所述随机外源DNA片段整合到载体的位点，所述外源DNA片段与所述载体形成第I种质粒，从而得到外源DNA片段的靶标库，将所述靶标库导入到所述生物传感器中，获得宿主菌菌液，从所述宿主菌菌液中筛选出能够成功导入所述第I种质粒的转化菌株，即为目标转化菌株，从所述目标转化菌株中提取第II种质粒，对所述第II种质粒进行DNA测序，得到所述第II种质粒的DNA序列，即为所述捕获的基因片段的序列。作为优选，对所述被稳定同位素标记的DNA进行预处理，得到随机外源DNA片段时，是采用超声波技术或酶切技术实现的。作为优选，将所述随机外源DNA片段整合到载体的位点时，所述质粒的位点为经过BamHI酶切处理的pWH1274质粒的BamHI位点。作为优选，所述将所述质粒库导入到所述生物传感器中，获得宿主菌菌液中的导入技术选自电击转导、自然转导、超声转导中的ー种。本发明提供的基因捕获系统的构建方法及其应用方法的有益效果在于本发明提供的基因捕获系统的构建方法提供了一种以现有的宏基因组学相关技术为基础而开发的基于全细胞的生物传感器的及从环境样品中捕获功能基因的技木。本发明提供的生物传感器是以不动杆菌Acinetobacter baylyiADPl为底盘生物构建的转化体或重组体，其构建方法包括以下步骤步骤I :在不动杆菌 Acinetobacterbaylyi ADPl 的 salA-salR 基因中构建 BamHI和EcoRI限制性内切酶酶切位点，通过引物及引物上的BamHI酶识别位点和EcoRI酶识别位点获得不动杆菌Acinetobacter baylyi ADPl的salA-salR基因的5’部分和3’部分。其中，用于获得不动杆菌Acinetobacter baylyi ADPl的salA-salR基因的5’部分的引物是Pl :5，-CTCAAAGGAAATGAGTCGTGGGTA-3’P2 :5’ -TCAAAACACTCTGGATCCGAATTCTTAGCG-3’引物P2上具有BamHI酶识别位点；用于获得获得不动杆菌Acinetobacter baylyi ADPl的salA-salR基因的3’部分的引物是P3 :5’ -CGCTAAGAATTCGGATCCAGAGTGTTTTGA-3’P4:5’ -GACCTGAGTATGCCCGGTAG-3’引物P3上具有EcoRI酶识别位点。步骤2 :将salA-salR基因 的5’部分和3’部分连接，获得完整的salA_salR基因。其中，连接可以利用T4 DNA连接酶实现。步骤3 :将salA-salR基因与pGEM_T载体连接，获得重组表达载体pSalAR_BE，进而获得质粒pSalAR_BE。其中，连接可以利用T4 DNA连接酶实现。步骤4 :利用内切酶酶切质粒pSalAR_BE，获得线性pSalAR_BE，其中，内切酶可以是EcoRI内切酶。步骤5 :将经过内切酶酶切的含有报道基因的质粒和线性pSalAR_BE连接，获得含有报道基因的表达载体，其中，内切酶可以是EcoRI内切酶。步骤6 :利用含有报道基因的表达载体筛选具有报道基因特性的单克隆菌株；步骤7 :利用单克隆菌株和Acinetobacter baylyi ADPl的感受态细胞浓缩液筛选出具有报道基因特性的生物传感器。其中，报道基因可以是发光基因luxCDABE，含有发光基因luxCDABE的表达载体是pSalAR_lux,生物传感器是能够生物自发光的单克隆Acinetobacter baylyi ADPWH_lux。或者，报道基因可以是绿色萤光蛋白基因gfp，含有绿色萤光蛋白基因gfp的表达载体是pSalAR_gfp，生物传感器是在蓝色波长范围的光线的激发下发出绿色萤光的单克隆Acinetobacter baylyi ADPWH_gfp。本发明提供的基因捕获系统的构建方法，包括基因片段的捕获和对捕获的基因片段进行测序得到捕获的基因片段的序列，其中基因片段的捕获包括以下步骤步骤I :从环境样品中提取总DNA。步骤2 :从总DNA中分离出被稳定同位素标记的DNA，其中，稳定同位素可以是13C。步骤3 :对被稳定同位素标记的DNA进行预处理，得到随机外源DNA片段，即为捕获的基因。其中，对被稳定同位素标记的DNA进行预处理，得到随机外源DNA片段可以采用超声波技术或酶切技术实现。对捕获的基因进行测序包括以下步骤步骤4 :将随机外源DNA片段整合到载体的位点，外源DNA片段与载体形成第I种质粒，从而得到外源DNA片段的靶标库。其中，将随机外源DNA片段整合到载体的位点时，质粒的位点可以为经过BamHI酶切处理的PWH1274质粒的BamHI位点。步骤5 :将靶标库导入到生物传感器中，获得宿主菌菌液。步骤6 :从宿主菌菌液中筛选出能够成功导入第I种质粒的转化菌株，即为目标转化菌株。其中，将质粒库导入到生物传感器中，获得宿主菌菌液中的导入技术选自电击转导、自然转导、超声转导中的ー种。步骤7 :从目标转化菌株中提取第II种质粒。步骤8 :对第II种质粒进行DNA测序，得到第II种质粒的DNA序列，即为捕获的基因片段的序列。 实施例本实施例提供的生物传感器以生物传感器Acinetobacter baylyi ADPWH_lux为例，其构建方法如下I)在不动杆菌 Acinetobacterbaylyi ADPl 的 salA-salR 基因中构建 BamHI 和EcoRI限制性内切酶酶切位点，通过引物及引物上的BamHI酶识别位点和EcoRI酶识别位点获得不动杆菌Acinetobacter baylyi ADPl的salA-salR基因的5，部分和3，部分。在不动杆菌Acinetobacter baylyi ADPl的salA-salR基因中构建BamHI和EcoRI限制性内切酶酶切位点，其中，Acinetobacter baylyi ADPl (Barbe et al. , 2004)染色体 DNA 已全部测序，可由NCBI Genebank数据库获得(NC_005966. I)。设计如下引物通过PCR反应获得Acinetobacter baylyi ADPl 完整的 salA-salR 基因的 5，部分和 3，部分Pl :5，-CTCAAAGGAAATGAGTCGTGGGTA-3’P2 :5’ -TCAAAACACTCTGGATCCGAATTCTTAGCG-3’P3 :5’ -CGCTAAGAATTCGGATCCAGAGTGTTTTGA-3’P4 :5’ -GACCTGAGTATGCCCGGTAG-3’其中，Pl，P2为ー对弓丨物，用以扩增salA-salR基因的5 ’部分；P3，P4为ー对弓I物，用以扩增salA-salR基因的3’部分。在引物P2和P3上分别设计EcoRI和BamHI的酶识别位点。以Acinetobacter baylyi ADPl细胞为模板，PCR的反应条件如下 第I个循环95 °C5分钟
第2-36个循环94 °CI分钟，50 0CI 分钟，
72 °C2分钟
第37个循环72 °C延伸IO分钟PCR产物进行I %的琼脂糖电泳后，使用QIAGEN公司的QIAquick gel extractionkit进行切胶纯化。分别获得salA-salR基因的5’部分和3’部分。2)将salA-salR基因的5’部分和3’部分连接，获得完整的salA_salR基因。
以步骤I)中所获得的salA-salR基因的5’部分和3’部分为模板，同时以Pl和P4为引物，进行重叠PCR反应，得到完整的salA-salR基因。PCR反应条件如下


本发明公开了一种生物传感器及基因捕获系统的构建方法，属于生物技术技术领域。该生物传感器是以不动杆菌Acinetobacter baylyiADP1为底盘生物构建的转化体或重组体。该基因捕获系统的构建方法包括基因片段的捕获和对捕获的基因片段进行测序得到捕获的基因片段的序列。该生物传感器及基因捕获系统的构建方法提供了一种以现有的宏基因组学相关技术为基础而开发的基于全细胞的生物传感器及从环境样品中捕获功能基因的技术。