果糖赖氨酸酶的制备方法及其应用制作方法_徐秀芬专利（赖氨酸,果糖,应用）-早鸽网

果糖赖氨酸酶的制备方法及其应用制作方法

专利名称

果糖赖氨酸酶的制备方法及其应用制作方法
发明者

徐秀芬, 沃燕波, 贾江花, 邹炳德, 邹继华, 陆慧贤
公开日

2012年7月11日
申请日期

2011年12月26日
优先权日

2011年12月26日
申请人

宁波美康生物科技股份有限公司
文档编号

C12Q1/28GK102559643SQ20111044089
关键字

赖氨酸果糖应用
权利要求

1.一种果糖赖氨酸酶的制备方法，其特征在于包括以下操作步骤(1)筛选菌株对多株曲霉属菌株进行发酵，收集菌丝获得含果糖赖氨酸酶的粗提液，以果糖赖氨酸和果糖基赖氨酸多肽为底物、利用醌法测定果糖赖氨酸酶的活性，筛选出产高活性果糖赖氨酸酶的曲霉菌株11-82 ；(2)培养用培养基培养11-82曲霉菌株，收集菌丝并清洗；(3)初提取已清洗的菌丝悬浮于缓冲液中，经细胞破碎、离心，收集上清液；菌丝与缓冲液的重量体积比为1 3 5;(4)硫酸铵沉淀使用硫酸铵溶液对步骤( 所得上清液进行分级沉淀，将最后收集得到的沉淀溶于buffer A中，得到粗提液；(5)疏水层析用bufferA平衡疏水层析柱，再将步骤(4)得到的粗提液上样吸附，吸附结束后，用硫酸铵溶液进行梯度洗脱，收集洗脱液；(6)亲和层析将除果糖赖氨酸以外的果糖氨基酸偶联到固相化载体上，用bufferA 平衡层析柱后，将经疏水层析柱洗脱后的洗脱液上样，进行亲和吸附，吸附后，用硫酸铵溶液进行梯度洗脱，收集洗脱液，即得果糖赖氨酸酶溶液；其中buffer A为以5 15mM、pH8 8. 5的Tris-Hcl缓冲液作为底液进行配制的 15 % 30 %的饱和硫酸铵2.根据权利要求1所述的果糖赖氨酸酶的制备方法，其特征在于所述步骤(1)中 11-82曲霉菌株为自行筛选的菌种，分类命名为黑曲霉，拉丁文学名为Aspergillus niger, 于2011年10月21日在北京的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为 CGMCC No. 53643.根据权利要求1所述的果糖赖氨酸酶的制备方法，其特征在于所述步骤O)中培养基的成分包括果糖赖氨酸5 10g/L、葡萄糖5 15g/L、磷酸氢二钾0. 5 1. 5g/L、磷酸二氢钠0. 5 1. 5g/L、硫酸镁0. 2 0. 8g/L、氯化钙0. 05 0. 2g/L、维生素混合溶液 0. 5 2%、金属离子混合溶液0. 5 2%，培养基的pH为4. 5 6. 5，其中维生素混合溶液的成分包括 Vbi -Hcl 0. 5 1. 5g/dL、核黄素 1. 5 2. 5mg/dL、泛酸钙 1 3mg/dL、VB6 -Hcl 1 3mg/dL、生物素0. 05 0. 2mg/dL、氨基苯甲酸0. 5 2mg/dL、烟碱酸1 3mg/dL、叶酸0. 05 0. 15mg/dL,金属混合溶液的成分包括硫酸镁1 3g/L、硫酸锌1. 5 3g/L、硫酸铜0. 1 lg/L、氯化钴0. 1 0. 5g/L、钼酸钠0. 2 0. 3g/L、硼酸0. 2 0. 6g/L、碘化钾 0. 01 0. 15g/L4.根据权利要求1所述的果糖赖氨酸酶的制备方法，其特征在于所述步骤(3)中缓冲液为磷酸缓冲液或Tris-Hcl缓冲液5.根据权利要求1所述的果糖赖氨酸酶的制备方法，其特征在于所述步骤(6)中固相化载体为 NHS-activated Sepharose 4 fast Flow 或 CNBr-activated Sepharose 4 fast Flow06.一种糖化白蛋白检测试剂盒，其特征在于由以下两种试剂构成，其中试剂1 缓冲液20-200mmol/L蛋白酶5-50 KU/L过氧化物酶10-50KU/L4-氨基安替比林2-20mmol/L防腐剂0.01-1%稳定剂0.01-1%试剂2 缓冲液20-200mmol/L 按照本发明方法制备的果糖赖氨酸酶 5-50 U/mLN,N-双(4-磺丁基)-3-甲基苯胺l-10mmol/L防腐剂0.01-1%稳定剂0.01-1%7.根据权利要求6所述的糖化白蛋白检测试剂盒，其特征在于所述缓冲液为三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液、乙酸-乙酸钠缓冲液、邻苯ニ甲酸-盐酸缓冲液或甘氨酸-盐酸缓冲液中的ー种8.根据权利要求6所述的糖化白蛋白检测试剂盒，其特征在于所述防腐剂为2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮或proclin300中的ー种9.根据权利要求6所
技术领域

本发明涉及医学检验技术领域，具体涉及一种在医学检验中使用的果糖赖氨酸酶的制备方法及其应用
背景技术

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权力要求
说明书
法律状态

专利名称：果糖赖氨酸酶的制备方法及其应用的制作方法糖尿病是发生在高血糖人群中的一类代谢型疾病，可导致机体多数系统受到严重的损害，尤其是神经及血管。根据世界卫生组织预计，中国糖尿病人数已居世界第二位。糖尿病将成为未来50年中国最严重的公共卫生问题。糖化白蛋白(Glycated albumin,GA)是指人血清中葡萄糖与白蛋白N末端发生非酶促糖化反应而形成的产物，其中90%与白蛋白链内的赖氨酸ε_ΝΗ2残基发生反应，其反应原理为两者首先形成不稳定的葡基胺(Glycosylamine)或khiff碱基(Schiff Base), 后者再经不可逆的葡糖胺(Amadori)重排反应形成稳定的氨基酮(酮胺)。因白蛋白的半衰期大约是20天，所以糖化白蛋白检测可被用于检测过去2-3周平均血糖水平。目前，糖化白蛋白已成为一项糖尿病患者必不可少的检测项目，与糖化血红蛋白相比，其更适合作为评估糖尿病透析患者住院治疗及死亡风险的指标。所以如何能精确地测定出人血清中的糖化白蛋白量成为临床检测糖化白蛋白的关键。目前市场主要采用酶法用于检测人血清中的糖化白蛋白。其反应原理为首先使用蛋白酶将糖化蛋白消化成低分子量的糖化多肽，随后使用果糖氨基酸酶催化糖化多肽发生氧化反应生成多肽(或氨基酸)，葡萄糖醛酮和H202。释放的H2O2通过终点反应比色法来测定，其在eoonm处的吸收值与糖化白蛋白的浓度成比例。具体反应过程如下本发明提供一种果糖赖氨酸酶的制备方法以及用该方法制备所得的果糖赖氨酸酶进行制备的糖化白蛋白检测试剂盒。该方法包括以下操作步骤筛选菌株，获得高活性果糖赖氨酸酶的曲霉菌株11-82；培养11-82曲霉菌株，收集菌丝；将菌丝悬浮于缓冲液中，经细胞破碎、离心，收集上清液；使用硫酸铵溶液对上清液进行分级沉淀，收集沉淀，得到粗提液；将粗提液进行疏水层析，收集洗脱液；将收集的洗脱液进行亲和层析，收集洗脱液，即得果糖赖氨酸酶溶液。该方法制备步骤简单，且得到的果糖赖氨酸酶纯度高、活性高、反应特异性高。

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