新型除草剂筛选模型制作方法

苏庆祥

2003年4月30日

2001年10月22日

2001年10月22日

苏庆祥

C12Q1/26GK1414111SQ01131959

除草剂 筛选 新型 模型

1.原叶绿素酸酯氧化还原酶活性测定方法2.在第1条中的原叶绿素酸酯氧化还原酶是指高等植物的原叶绿素酸酯氧化还原酶3.在第2条中指的高等植物是指双子叶植物4.在第3条中指的双子叶植物是指拟南芥5.在第2条中指的高等植物是指单子叶植物6.在第5条中指的单子叶植物是指大麦

本发明涉及酶活性的测定，它可用于新型除草剂的筛选目前尚无这类筛选模型本发明确立了一种新型的筛选模型，通过本模型可以筛选出对动物无毒性的，更有效的新型除草剂在光合作用生物体中有二类不同的叶绿素合成途径这是由原叶绿素酸酯氧化还原酶的光依赖性来区分的比较原始的一类是光不依赖的叶绿素合成途径，它分布于除被子植物以外的光合作用生物中，另一类是光依赖性的叶绿素合成途径这类途径主要分布在高等植物中在高等植物中，原叶绿素酸酯氧化还原酶是在细胞核内编码的在细胞质中合成为蛋白质，而后传送至质体中，并在质体中执行其功能原叶绿素酸酯氧化还原酶在高等植物中以三种基因形式存在一种基因A型，它在无光条件下大量表达(核糖核酸和蛋白质水平)而在有光条件下其核糖核酸和蛋白质水平快速下降至消失B型，即在无光和有关条件下均表达的基因C型只是在有光条件下表达这三种基因编译的蛋白酶在氨基酸的相似性很高(86％)，都是光依赖性的原叶绿素酸酯氧化还原酶B型和C型的基因缺失可导致拟南芥因不能进行叶绿素合成而死亡原叶绿素酸酯氧化还原酶对高等植物至关重要若能找到原叶绿素酸酯氧化还原酶抑制剂即找到杀死植物这种抑制剂也即除草剂由此确定了如下新型除草剂筛选模型原叶绿素酸酯氧化还原酶的酶活性测定原叶绿素酸酯氧化还原酶B型蛋白或C性蛋白(可从高等植物中直接分离纯化或是原叶绿素酸酯氧化还原酶B和C基因在异体高效表达并分离纯化)本测定系统组成原叶绿素酸酯氧化还原酶(10nm)还原型辅酶(1mM)原叶绿素酸酯(10mM)除垢剂(Triton X-100 5mM)硫苏糖醇(5mM)混合液在无光条件下混合并静置1分钟，而后测定荧光发射光谱，激发光液为440nm，此光谱为酶反应前的光谱当混合液照光1秒至30秒，光强40μE·m-1·sec-1后测定其荧光发射光谱(见图)图中的实线是原叶绿素酸酯的荧光发射光谱，虚线为原叶绿素酸酯还原成叶绿素酸酯的荧光发射光谱如在此反应混合液中加入某一化合物，在光照后荧光发射光谱与光照前一样，这一化合物即为潜在的除草剂本发明可筛选出原叶绿素酸酯氧化还原酶的抑制剂，从而找到新型的高等植物除草剂这类除草剂有下述优点1.无毒性因为它是叶绿素合成后期的关键酶，只存在与质体中，动物和人没有这类想似的酶2.选择性以知的来自不同植物的叶绿素酸酯氧化还原酶其氨基酸水平没相似性在60％-75％这为找到不同植物来源的原叶绿素酸酯氧化还原酶的抑制剂提供了可能性即选择性除草剂3.新型通过抑制原叶绿素酸酯氧化还原酶的活性而发明的除草剂是以前不曾有的在进行除草剂筛选时，最好选用96孔板，每个孔内加入100微升的反应混合液，而后加入1微升不同浓度和不同化合物的液体光照后测定激发光波为440nm的荧光发射出的670nm的值如670nm的值与对照值相差不大，即原叶绿素酸酯氧化还原酶的活性被抑制了，如能重复且浓度低于10μM，此化合物即为原叶绿素酸酯氧化还原酶的抑制剂