专利名称：一种利用毛细管培养法检测或筛选微生物的方法目前，国内外微生物检验过程中分离培养主要是预增菌、增菌、选择性平板分离培养的方法，上世纪七十年代，以酶底物法显色为基本原理的显色培养基的发明大大提高了致病菌分离培养的特异性和敏感性。其基本原理为选择性增菌，划线分散成单个菌体，单菌体生长为单菌落并分解显色底物显色，需要两步，且需要大量的培养基及有经验的人工划线技术，耗时36-48小时。而众所周知，在化学物质和生物大分子分离过程中，以色谱层析或电泳为基本原理的分离方法快速省时且敏感性、特异性、准确性都比较高。但由于微生物不具溶解性，无法进行分配，因此不可能利用色谱层析。而且由于微生物个体太大无法进行有效常规电泳，有些科学家摸索了高效毛细管电泳的效果，结果表明在分离致病性球菌，如葡萄球菌和链球菌以及大肠杆菌方面有一定的有效性，但受生长环境、条件和生长时期等多种因素的影响，同种微生物会表现比较大的荷质比差异性，导致重现性很低，大大限制了它的适用性。那么是否可以想一种办法间接模拟色层原理呢？就如数字模拟信号解决数字信号的问题。从文献分析，导管装入半固体琼脂，一端接种沙门氏菌，可以在毛细管另一端解离出具有鞭毛的沙门氏菌；或在一端接种某菌种，导管中若添加某化学物质，可以检测其对该物质的趋药性。因此可否设计以微生物的运动性或趋药性为基本动力(模拟色谱层析中的动力)，以选择性杂菌抑制剂为选择性基础物质(模拟色谱层析中的固相分配剂)，以半固体琼脂为载体(模拟色谱层析中液相分配剂)的基本方法，即把毛细管一端放入样品增菌液，混合菌体经过装有特异性比较强的选择性杂菌抑制剂的半固体琼脂毛细管，随着混合菌体向前生长移动会受到反复的抑制性选择，最终杂菌会被全抑制，理论上讲最后目标菌会被彻底释放到毛细管另一端，如此就类似化学成分在色谱中不断进行再分配的结果， 从而实现目标菌的快速高效分离。且从理论上分析，一大部分微生物具有鞭毛，具运动性； 其它微生物可以利用其趋药性，因此动力上能够保证；而且从目前选择性培养基，如科玛嘉类显色培养基的显色选择性来分析，对大多数致病微生物可以筛选到特异性比较强的选择性杂菌抑制物质。因此用毛细管选择性半固体培养法理论上可以分离大部分微生物。迄今为止，尚未见到有用毛细管培养法检测或筛选微生物的报道。发明内容针对上述现有技术，本发明提供了一种利用毛细管培养法检测或筛选微生物的方法，其可用于检测或筛选微生物，检测或分离时间由现有技术中的36 48小时缩短为 12 M小时，具有快速、高效、省时省力、特异性好、敏感性强等优点。本发明是通过以下技术方案实现的一种利用毛细管培养法检测、分离或鉴定微生物的方法，包括以下步骤(1)填装毛细管以毛细管为容器，装载培养基；所述培养基为半固体培养基或液体培养基或固体培养基；所述培养基中含有供目标微生物生长的营养物质；
所述培养基中含有或不含有选择性杂菌抑制剂或/和目标微生物显色剂；
(2)微生物检测将上述填装后的毛细管的一端接入待检样本或待检样本的稀释液或增菌液中，或将待检样本接入毛细管的一端，培养0 < t ^ 后，进行以下操作之
①当培养基中含有选择性杂菌抑制剂时，直接观察毛细管的另一端，判断是否有菌生长落，若有菌生长，则证明待检样本中含有目标微生物，若无，反之；
②当培养基中含有选择性杂菌抑制剂时，直接观察毛细管的另一端，判断是否有菌生长，若有菌生长，则证明待检样本中含有目标微生物，将菌接种至目标微生物的常规选择培养基上进行进一步的分离纯化或培养，若无，反之；
③当培养基中含有目标微生物显色剂时，直接观察毛细管的另一端，判断是否有特异显色反应，若有特异显色反应，则证明待检样本中含有目标微生物，若无，反之；
④当培养基中不含有目标微生物显色剂，含有或不含有选择性杂菌抑制剂时，观察毛细管另一端是否有菌生长，若有菌生长，则将毛细管的另一端接入含有目标微生物显色剂的半固体培养基或液体培养基或固体培养基中，培养后，观察是否有特异显色反应，若有特异显色反应，则证明待检样本中含有目标微生物，若无，反之；若无菌生长，则证明待检样本中不含有目标微生物；
⑤当培养基中不含有目标微生物显色剂，含有或不含有选择性杂菌抑制剂时，观察毛细管另一端是否有菌生长，若有菌生长，则将菌接种至目标微生物的常规选择培养基上进行纯化或培养；
⑥当培养基中含有或不含有选择性杂菌抑制剂或/和目标微生物显色剂时，也可将另一端接入一组液体或半固体生化鉴定培养基，对目标微生物进行鉴定，或者多根毛细管另一端分别接入一种液体或半固体生化鉴定培养基形成一组生化鉴定实验。
所述毛细管的材质为玻璃、塑料、合成树脂或硅胶中的一种；材质要求硬质不透水，透气或不透气根据目标微生物好氧情况选定，优选使用透明材质，透明材质易于观察培养基装填效果，也便于终点判定。最优选耐高压硬质无毒透明材料。
所述毛细管为管径小于0. 5cm、管长大于Icm的直管或弯管管径小于0. 5cm，管径比较小，填装量少，节约培养基且易于通过虹吸装填，而且在培养过程中切面横向扩散影响小；管长大于1cm，管的长度选取依据具体的目标微生物和选择性抑制剂对目标微生物和杂菌的分离能力通过实验验证来确定，达到既能较好的选择性分离目标微生物，又能在较短时间内分离的最佳方案；管的形状根据实验的便利性可以进行一定程度的弯曲，以不影响实验结果为前提。
所述填装毛细管采用无菌虹吸法或灌注法。
所述目标微生物为带有或不带有鞭毛的细菌。
所述供目标微生物生长的营养物质选自能支持或促进微生物生长的碳源、氮源、 生长因子和无机盐中的一种或任几种。
所述目标微生物的选择性显色剂为目标微生物的特异生化酸碱指示剂、生化鉴定试剂或/和酶底物显色剂，作用为使目标微生物特异生化反应通过颜色反应显示出来。生化鉴定培养根据目标菌生化特征选择项目，一般一种目标微生物需要一组生化反应鉴定， 因此生化鉴定培养基需要多管形成一组，有些生化底物可以几个反应在一管内完成。
所述选择性杂菌抑制剂为对目标微生物无抑制作用、对非目标微生物有抑制作用的试剂，或对目标微生物的抑制作用小于非目标微生物的抑制作用的试剂，或对目标微生物的生长促进作用相对大于对非目标微生物的生长作用的试剂；具体应用时，根据目标微生物选择合适的选择性杂菌抑制剂。
所述选择性杂菌抑制剂选自胆盐、脱氧胆酸钠、碘、碘化钾、煌绿、孔雀绿、亚硒酸盐、胱氨酸、质量浓度在以上的氯化钠溶液、吖啶黄、萘啶酮酸、月桂基硫酸盐、氯化锂、 结晶紫、中性红、伊红、美兰、万古霉素、新生霉素、两性霉素、头孢菌素、头孢哌酮、多粘菌素、磺胺嘧啶、利福平、染料和抗生素中的一种或任几种。
优选的，所述培养基为半固体培养基，比如由目标微生物的选择性显色剂、营养物质、0. 1.0% (质量分数)琼脂和水组成的半固体培养基。
所述增菌液中含有能支持或促进目标微生物生长的营养物质，添加或不添加选择性杂菌抑制剂。优先选用增菌液与待检样本体积比在10 1以上的样液，增菌液含有营养物质，添加或不添加选择性杂菌抑制剂根据目标微生物在样本中的存活情况决定，样本中目标微生物生存状况比较好，可添加选择性杂菌抑制剂，若样本中目标微生物生存状况不佳，则应不加选择性杂菌抑制剂，以营养性恢复为主。
对于接入方式，若样本为液体或半固体时可直接接入，接入方式优先选择持续插入整个培养过程，根据目标微生物和样本的情况，若污染严重或目标微生物含量比较高时， 可以将毛细管选择性半固体培养基一端点触待检样本或者待检样本的稀释液或增菌液，所谓点触，就是将毛细管接触液体，然后短时间内离开，也可间接点触，即通过棉棒、取菌环 (针)及其它有效工具先点触待检样本或者待检样本的稀释液或增菌液，然后再点触毛细管选择性半固体培养基一端。
所述培养时间为3 < t彡96h，优选12 < t彡24h0培养温度和时间根据目标微生物的生长特性选定，如沙门氏菌可选36°C或42°C，单核细胞增生李斯特菌可选30°C。培养时间一般为3 96h。在培养过程中，混合菌体经过装有特异性比较强的杂菌抑制剂的半固体琼脂，随着混合菌体向前生长或/和运动，杂菌会受到反复的抑制性选择，而目标微生物保持正常或超常的向前生长或/和运动，类似化学成分在色谱中不断进行再分配的过程，最后目标微生物会被释放到毛细管另一端，从而实现目标菌的快速高效分离。
本发明利用毛细管培养法检测或筛选微生物，大部分菌属的检测或分离时间由现有技术中的36 48小时缩短为12 M小时，具有快速、高效、省时省力、特异性好、敏感性强等优点。

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1 一种毛细管选择性半固体法检验沙门氏菌
步骤如下
1、毛细管的选取选取内径0. 5讓、1111111、2111111，长度2、5、10、20011长玻璃毛细管若干根。
2、选择性半固体培养基的制备按配方蛋白胨10. 0g、牛肉膏5. 0g、氯化钠3. 0g、 碳酸钙45. 0g、琼脂粉4. Og和蒸馏水IOOOmL加热溶解后取900mL，加入100mL50% (质量分数，下同)硫代硫酸钠溶液、20. 0mL20%碘溶液(含25%碘化钾)、2. OmLO. 5%煌绿水溶液、 50. OmLlO%牛胆盐溶液，混勻灭菌，即得。
3、液体和半固体显色培养基的制备将CHR0MAGAR沙门氏菌显色培养基(郑州博赛生物技术股份有限公司，批号1004)按照说明书比例加入去离子水配制成200mL悬液，磁力搅拌溶解15min后，静置15min后取上清液IOOmL,该上清液为目标菌显色剂和营养物质溶液，为液体显色培养基(加热灭菌后分装每管ImL备用)；取50mL液体显色培养基中加入0. 2g琼脂加热溶解灭菌，即得半固体显色培养基。
4、半固体生化鉴定培养基的制备沙门氏菌生化鉴定培养基套装产品(S005，北京陆桥技术有限责任公司)中三糖铁为半固体培养基，因此可直接不经处理备用。其余生化管为目标微生物生化反应底物、生化反应指示剂、营养物质混合液(除三糖铁外)，其余每支管ImL中添加琼脂％ig，加热溶解灭菌，即得。因三糖铁为半固体培养基，因此该套装中三糖铁琼脂可直接不经处理备用。
5、毛细管的填装将无菌毛细管插入上述步骤2 4制备的融化状态培养基，观察毛细管虹吸上缘，使毛细管整管填充后，室温静置至凝固，选择性半固体培养基装入0. 5mm、 lmm、2mm内径，5、10、20cm长毛细管若干根，半固体显色培养基和半固体生化鉴定培养基分别装入0. 5mm、lmm、2mm内径，2cm长毛细管若干根。
6、样本增菌夜的制备将约IO1CFUAiL的沙门氏菌加入到IOOmL鲜牛奶中作为样本，取检样25g加入到225mL缓冲蛋白胨水培养基(北京陆桥技术有限责任公司，以下各实施例中增菌液所用成品培养基均为该公司生产，有效期内使用)中。
7、选取步骤5制备好的毛细管选择性半固体培养基任意18根，将一头插入样本增菌液中，持续至整个培养过程。将其中15根按3根为一组，每组中另一头分别插入上述制备的毛细管半固体显色培养基、液体显色培养基、毛细管半固体生化鉴定培养基、沙门氏菌生化鉴定培养基套装产品(S005，北京陆桥技术有限责任公司)、营养肉汤中，剩余3根不插入任何培养基。
8、培养步骤7制备的毛细管选择性半固体体系放入恒温恒湿培养箱36°C，培养 24h0观察其中3根毛细管半固体显色培养基一端和3根液体显色培养基均呈现紫红色，初步判定样本中检出沙门氏菌。观察毛细管半固体生化鉴定培养基、沙门氏菌生化鉴定培养基套装产品的结果并记录，鉴定表明检出菌为沙门氏菌，结果见如表1所示
表

本发明公开了一种利用毛细管培养法检测、分离或鉴定微生物的方法，包括以下步骤(1)填装毛细管以毛细管为容器，装载培养基；(2)微生物检测将上述填装后的毛细管的一端接入待检样本或待检样本的稀释液或增菌液中，或将待检样本接入毛细管的一端，培养0＜t≤96h后，观察是否有菌生长或是否有特异性反应，然后判断是否含有目标微生物。本发明利用毛细管培养法检测或筛选微生物，大部分菌属的检测或分离时间由现有技术中的36～48小时缩短为12～24小时，具有快速、高效、省时省力、特异性好、敏感性强等优点。