专利名称：一种甲型h1n1流感疫苗及其应用的制作方法2009年4月，甲型Hmi流感在墨西哥和美国爆发，随后，疫情迅速蔓延到美洲、欧洲、亚洲多个国家，严重威胁人民健康。随着每日确诊病例的增加，WHO不断提升流感大流行警戒等级，于2009年6月11日正式将甲型Hmi流感警戒级别升至6级，即流感大流行警戒级别最高级。在人群中大规模免疫接种是预防甲型Hmi流感最有效方法之一。血清流行病学调查表明，人群普遍缺乏对甲型Hmi流感的免疫力，易感性高，尤其是高发人群青少年和儿童，几乎没有免疫力，季节性流感疫苗对甲型Hmi流感没有交叉保护，为此开发和研制安全有效的甲型Hmi流感疫苗非常重要。疫情爆发后，我国政府也迅速启动了应急预案，严防死守应对甲型Hmi疫情。经国务院批准，卫生部4月30日发布2009年第8号公告，明确将甲型Hmi流感(原称人感染猪流感)纳入传染病防治法规定管理的乙类传染病，并采取甲类传染病的预防、控制措施。世界和中国急需甲型Hmi流感疫苗用于大流行疫情的控制。北京天坛生物制品股份有限公司和北京科兴生物制品有限公司等国内疫苗企业生产的甲型Hmi流感病毒裂解疫苗先后上市。然而，用这种传统方法生产一种全新的流感疫苗通常最快也需耗时5至6个月。制备流感裂解疫苗的病毒需要在鸡胚中培养，所以制备该疫苗成本较高，生产费时，当流感来袭时很难短时间内满足大规模接种的需要，鸡胚来源的物质也容易成为人类的过敏原。传统的流感疫苗需要进一步的改进。目前流感疫苗可分为两类一类为流感病毒灭活疫苗；另一类为流感病毒减毒活疫苗。流感病毒灭活疫苗分三代，第一代为全病毒疫苗(Whole virus vaccine)为经甲醛灭活的全病毒颗粒，早期粗制的全病毒疫苗接种后局部和全身反应较强，60年代初由于超速离心机和层析色谱技术的应用，使毒粒纯化技术大大提高，制成后的全毒疫苗局部和全身反应明显减轻，但儿童使用时仍可出现不良反应，现已少用，免疫效果肯定。第二代为裂解疫苗(splitvaccine)，1968年在美国首次被批准使用。裂解疫苗即用裂解剂如乙醚，3-N-丁基磷酸盐聚山梨醇酯，脱氧胆酸钠等，使病毒裂解成为含有病毒表面抗原血凝素和神经氨酸酶、核壳以及基质蛋白的可溶性碎片，由于不含有全病毒疫苗中的各种脂类反应原，经纯化后不良反应大为减少，广泛应用于成人和儿童。第三代为病毒亚单位疫苗，1976年用于临床。制作亚单位疫苗，需先将病毒的内部蛋白剔除，只留有含高度纯化的病毒表面抗原血凝素和神经氨酸酶，不良反映显著减少，不仅适用于成人尤其适于儿童。第四代疫苗为佐剂疫苗(adjuvanted vaccine), 1997年开始应用于临床。在实践中发现，亚单位疫苗虽然不良反应减少，但其免疫原性不如全病毒颗粒，接种后特别是老年人群保护性抗体产生不理想，为此在亚单位疫苗基础研制成佐剂疫苗，从而提高了亚单位疫苗的免疫原性和预防效果。1997年苏联报告用活流感疫苗预防流感成功，美国2003年已批准临床应用，只有鼻喷雾剂型，由于是减毒活疫苗，应用后产生轻微流感症状，临床应用范围受到一定限制。目前市场广为应用的流感疫苗有两种一种为注射用灭活流感病毒裂解疫苗。另一种为鼻喷雾型减毒流感病毒活疫苗。C48/80是一种肥大细胞活化剂。
本发明的目的是提供一种甲型Hmi流感疫苗。本发明提供的一种甲型Hmi流感疫苗，其活性成分为甲型Hmi流感病毒表面抗原和化合物C48/80。所述甲型Hmi流感病毒表面抗原和所述化合物C48/80的质量比为(1-9) 10;所述甲型Hmi流感病毒表面抗原和所述化合物C48/80的质量比具体为(1、3或 9) 10。所述甲型Hmi流感病毒血凝素蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列1。toon] 所述甲型Hmi流感病毒血凝素蛋白的编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列 2。所述流感疫苗还包括浓度为0. 0067M、pH值为7. 0的PBS缓冲液。所述流感疫苗由甲型Hmi流感病毒血凝素蛋白、化合物C48/80和浓度为 0. 0067M、pH值为7. 0的PBS缓冲液组成。所述甲型Hmi流感病毒表面抗原为甲型Hmi流感病毒血凝素蛋白。上述流感疫苗在制备治疗甲型Hmi流感产品中的应用也是本发明保护的范围。所述产品为药物。化合物C48/80在制备甲型Hmi流感疫苗中的应用也是本发明保护的范围。本发明的实验证明，本发明利用化合物C48/80作为佐剂，将其与甲型Hmi流感病毒表面抗原按照质量比为(1、3或9) 10进行混合，得到不同的甲型Hmi流感疫苗，将其免疫小鼠，并与CT为佐剂的疫苗进行对比，发现质量比为9 10的疫苗免疫性好、免疫周期长，并且没有过敏反应，为大量制备治疗甲型Hmi流感产品提供了研究基础。图1为血清中HmiHA特异性抗体检测图2为血清中HmiHA特异性抗体检测 图3为中和活性抗体检测图4为攻毒实验结果图5为C48/80佐剂引发Thl/Th2平衡型免疫反应

溶液滴鼻免疫；第B组(无佐剂组)将9 μ g HmiHA蛋白溶于浓度为0. 0067M、ρΗ值为7. 0的 PBS缓冲溶液中，并用PBS缓冲溶液补至15ul，得到混合液进行滴鼻免疫；第C组(HA蛋白低剂量组)将15ul由实施例1得到的甲型Hmi流感疫苗1进行滴鼻免疫；第D组(HA蛋白中剂量组)将15ul由实施例1得到的甲型Hmi流感疫苗2进行滴鼻免疫；第E组(HA蛋白高剂量组)将15ul由实施例1得到的甲型Hmi流感疫苗3进行滴鼻免疫；第F组(CT佐剂组/阳性对照组)将9yg HmiHA蛋白、0. Iyg霍乱毒素 CT (Sigma公司，货号:C8025)与浓度为0. 0067M、ρΗ值为7. 0的PBS缓冲溶液中，并用PBS 缓冲溶液补至15ul，得到混合液进行滴鼻免疫；以上6组均在第0 (从第一次免疫开始记作第0天)，7，14天进行3次免疫；免疫体积15 μ 1/只，7.5 μ 1/鼻孔。2、检测1)血清中HmiHA特异性抗体检测将以上6组小鼠在免疫后第21天采集小鼠的血液，并分离血清。将各组小鼠的血清进行Elisa检测，用以确认小鼠血清中是否有HmiHA特异性结合抗体的存在。Elisa具体实验方法如下1，将HmiHA蛋白以1 μ g/ml的浓度包被96孔Elisa板，包被体积为100 μ 1/孔，包被时间为4°C过夜(12h)。2，包被好的Elisa板用0.05% PBSTQL PBS溶液中加入Iml 吐温，使吐温终浓度达到0. 05% )溶液洗涤3次，甩干。3，0. 05% PBST溶液中加入牛血清 (FBS，购自Gibco，货号10099141)使FBS终浓度达到10%。用含10% FBS的PBST溶液封闭Elisa板，200 μ 1每孔，37°C封闭2小时。4，重复步骤2中的洗涤。将各小鼠血清做2倍系列稀释，并ΙΟΟμΙ/孔加入洗涤后的Elisa板中，起始稀释比例为1 100，37°C孵育1小时。5，重复步骤2中的洗涤，加入1 2500稀释的辣根过氧化物酶HRP标记的羊抗鼠IgG 二抗(ftOmega，货号W402B)，100 μ 1/孔，37°C孵育1小时。6，重复步骤2中的洗涤，加入显色液TMB (100 μ 1/孔)，避光显色5分钟。7，加入IM硫酸水溶液(50 μ 1/孔)，终止显色， 0D450nm读取吸光度值。实验重复三次，结果取平均值。结果如图1所示第A (PBS)、B (HA)、C(IugHA)、D (3ugHA)、E (9ugHA)、F (CT)组的小鼠的血液 IgG 抗体几何平均滴度为 5、53、3200、6400、128000、107634 ；可以看出，第E组小鼠血清特异性IgG抗体几何平均滴度达到1观000，与阳性对照 (第F组，CT组)几何平均滴度107634相近。第E组免疫了甲型Hmi流感疫苗3的小鼠， 其血清特异性抗体几何平均滴度128000比免疫了甲型Hmi流感疫苗1 (第C组)和免疫了甲型Hmi流感疫苗2(第D组)的要高很多，后两者的特异性抗体几何平均滴度分别为 3200和6400。所以，选择免疫了甲型Hmi流感疫苗3做为疫苗最优配方，并进行后续的评价和攻毒实验。2)疫苗安全性检测由于C48/80佐剂是肥大细胞活化剂，需要对其潜在致过敏的可能性进行评价。为测试其安全性，检测了上述6组小鼠免疫21天时血清中总IgE的含量及特异性IgE的含量。血清总IgE及特异性IgE检测方法血清总IgE的检测使用的是小鼠IgE的Elisa检测试剂盒(购自BD公司，货号 555248)，具体实验步骤按说明书进行。血清特异性IgE检测方法同血清总IgE的检测方法，但包被Elisa板的蛋白为 1 μ g/ml的HmiHA蛋白，包被体积为100 μ 1。实验重复三次，结果取平均值。结果如表1所示，表1、血清中总IgE浓度
组别血清中总IgE浓度(ng/ml)PBS (第A组)37. 06±22· 25HA 9μ g (第 B 组)76. 36±43. 78HA 1 μ g + c48/80 IOug (第 C 组)78. 27±38. 9HA 3μ g + c48/80 IOug (第 D 组)104. 1±41. 45HA 9μ g + c48/80 IOug (第 E 组)83. 99±15· 02HA 9 μ g+CT 0. 1 μ g (第F组)66. 58±31· 24B组小鼠血清中总IgE含量约为76. 36ng/ml、E组小鼠血清中总IgE含量约为 83. 99ng/ml,即免疫了 HA9 μ g+c48/8010 μ g组与单独免疫了 HA蛋白组血清中总IgE含量并未见显著差异。同时，各组小鼠血清中均未检测到HmiHA特异性IgE的存在。从以上结果中可以看到，并未发现该佐剂配伍的甲流疫苗在小鼠体内具有致敏效果。二、甲型Hmi流感疫苗免疫实验21、免疫将4周龄SPF级Balb/c小鼠(每只小鼠的重量为16g左右)分为如下4组，每组 20只。免疫第21天，对各组小鼠攻毒。每组中10只小鼠用作存活率的观察，另外10只用作体重指标的监测。免疫各组的疫苗配方和剂量如下，免疫方式为滴鼻免疫第一组(PBS组/阴性对照组)将15ul浓度为0. 0067M、pH值为7. 0的PBS缓冲溶液滴鼻免疫；第二组(无佐剂组)将IOyg HmiHA蛋白溶于浓度为0.0067M、pH值为7.0的 PBS缓冲溶液中，并用PBS缓冲溶液补至15ul，得到混合液进行滴鼻免疫；第三组(HA蛋白高剂量组)将15ul由实施例1得到的甲型Hmi流感疫苗3进行滴鼻免疫；第四组(CT佐剂组/阳性对照组)将9yg HmiHA蛋白、0. Iyg霍乱毒素 CT (Sigma公司，货号:C8025)与浓度为0. 0067M、pH值为7. 0的PBS缓冲溶液中，并用PBS 缓冲溶液补至15ul，得到混合液进行滴鼻免疫；以上4组均在第0 (从第一次免疫开始记作第0天)，7，14天进行3次免疫；免疫体积15 μ 1/只，7.5 μ 1/鼻孔。2、检测1)血清及盥洗液中HmiHA特异性抗体检测将以上4组小鼠在免疫后第21天采集小鼠的血液，粪便，阴道盥洗液，肺盥洗液， 鼻腔盥洗液。将各组小鼠的血清、盥洗液及粪便进行Elisa检测(血清特异性IgG检测方法同前；粪便及盥洗液中的特异性IgA的检测方法与特异性IgG的检测方法相同，但使用的二抗为HRP标记的羊抗鼠IgA 二抗，购自Santa Cruz公司，货号sc_3791)，实验重复三次，结果取平均值。第一、二、三、四组的小鼠的血液IgG抗体几何平均滴度为4、49、90510、137187。第一、二、三、四组的小鼠的阴道盥洗液IgA抗体几何平均滴度为1、1、43、98 ；第一、二、三、四组的小鼠的新鲜粪便IgA抗体几何平均滴度为1、1、7、12 ；第一、二、三、四组的小鼠的肺盥洗液IgA抗体几何平均滴度为1、1、11、11 ；第一、二、三、四组的小鼠的鼻腔盥洗液IgA抗体几何平均滴度为1、1、11、32 ；将上述部分结果作图如图2所示其中A为第21天小鼠血清中抗HmiHA特异性 IgG抗体的几何平均滴度；B为第21天小鼠阴道盥洗液中抗HmiHA特异性IgA抗体的几何平均滴度；C为第21天小鼠粪便中抗HmiHA特异性IgA抗体的几何平均滴度；D为第21天小鼠肺盥洗液中抗HmiHA特异性IgA抗体的几何平均滴度；E为第21天小鼠鼻腔盥洗液中抗HmiHA特异性IgA抗体的几何平均滴度。PBS (第一组)、HA (第二组)X48/80 (第三组)、CT(第四组)；由A可以看出，第21天C48/80组(第三组)小鼠的血清中产生了抗HmiHA特异性IgG抗体，此结果与免疫实验1的结果相当，再次证明了该疫苗的免疫效果。同时，小鼠的粪便、阴道盥洗液及肺和鼻腔洗液中也都检测到了特异性IgA的存在(B-E)。这些结果说明，免疫21天，小鼠不但能够在血清中产生抗HmiHA特异性IgG抗体，小鼠肠道、阴道及呼吸系统粘膜表面也产生了具有能与HmiHA蛋白结合的IgA抗体。2)中和活性抗体检测将免疫实验2免疫21天收集的4组小鼠血清，进行微量中和实验，具体实验方法如下1，实验前一天，将MDCK细胞(ATCC公司，货号CRL-2935 )以1.5 X IO4/孔的密度接种96孔细胞培养板，37°C培养过夜。2，所有待测小鼠血清56°C灭活，45分。3，所有待测小鼠血清做系列2倍稀释，起始稀释浓度为1 5，将稀释好的各浓度血清ΙΟΟμΙ与ΙΟΟμΙ 100个TCID5tl的甲流活病毒A/California/04/2009株分别混合，37°C孵育2小时。4，将孵育好的血清-病毒混合液转移至准备好的长有MDCK细胞的96孔细胞培养板中。5，37°C培养3天后，观察每孔的细胞病变效应(CPE)。实验重复三次，结果取平均值。第一、二、三、四组的小鼠的血清中和抗体几何平均滴度为< 10、10、607、1062 ；作图如图3所示，PBS为第一组、HA为第二组、C48/80为第三组、CT为第四组；从图3中可以看出，免疫21天，C48/80(第三组)小鼠血清的中和抗体几何平均滴度达到了 ⑶7，接近CT组(第四组)的1062。3)攻毒实验对免疫实验2的4组免疫过的小鼠均在第21天时攻毒1 X IO6TCID50甲流活病毒 A/California/04/2009 ^ (Bao L, Xu L, Zhan L, Deng W, Zhu H, et al. (2010)Challenge and polymorphism analysis of the novel A (HlNl) influenza virus to normal animals. Virus Res 151 :60_65，公众可从中国医学科学院病原生物学研究所和清华大学获得。)，具体攻毒实验方法按照如下文章中记载的进行Xu L，Bao L，Lv Q, Deng W, MaY, et al. (2010)A single-amino-acid substitution in the HA protein changes the replication and pathogenicity of the 2009 pandemic A(HlNl) influenza viruses in vitro and in vivo. Virol J 7:325。简言之，小鼠免疫第21天时，将IxIO6TCID5q的甲流活病毒A/California/04/2009株50 μ 1，以滴鼻的方式攻击小鼠，在为期14天的时间内，检测小鼠的存活率和体重变化情况。结果如下第一、二、三、四组小鼠攻毒14天后，小鼠的存活率分别为(KOJO^UOO1^ ；第一、二、三、四组小鼠攻毒7天后，小鼠的体重分别降到了原始体重的75%、 69%,84%,89%；当攻毒14天后，第一、二组小鼠全部死亡，而第三、四小组存活下来的小鼠体重有所恢复，体重分别为原始体重的89%、94%。将上述结果作图。如图4所示，A为存活率，B为体重变化百分比，表示的是小鼠攻毒后体重占攻毒前(即免疫21天时)体重的百分率。PBS(第一组)、HA(第二组)、 C48/80(第三组)、CT (第四组)；从图中看出，攻毒后，C48/80(第三组)小鼠在第14天的存活率达90%。攻毒后 7天，小鼠体重开始恢复。4)C48/80佐剂引发Thl/Th2平衡型免疫反应血清中IgG的亚类，通常与⑶4+T细胞活化相关。IgGl与Th2类免疫反应相关， IgG2a则与Thl类免疫反应相关。血清特异性IgG亚类的Elisa检测方法同前，但使用的二抗为HRP标记的羊抗鼠 IgGl、IgG2a、IgG2b、IgG3 二抗，均购自 Santa Cruz 公司，货号分别为 sc-2060、sc-2061、 sc-2062、sc-2063。结果如图5所示，免疫21天时，小鼠血清中各IgG亚类几何平均滴度如下HA(第二组)IgGl、IgGh、IgG2b、IgG3的HmiHA特异性抗体几何平均滴度为13、 2、4、1 ；C48/80 (第三组)IgGl、IgG^i、IgG2b、IgG3的HmiHA特异性抗体几何平均滴度为为 48503、696、5572、20 ；CT(第四组)IgGl、IgG2a、IgG2b、IgG3的HmiHA特异性抗体几何平均滴度为为 36758、541、13929、184 ；表明，C48/80佐剂引发的免疫反应与CT佐剂类似，引发了 Thl/Th2平衡型免疫反应。5)脾细胞刺激实验脾细胞刺激实验的具体方法如下小鼠免疫21天时，无菌条件下取脾，分离小鼠脾淋巴细胞。用RPMI1640培养基制备脾淋巴细胞单细胞悬液(培养基中含有10%的FBQ，将悬液转移至48孔细胞培养板中，使细胞达到2. 5X IO6个/孔。随后，每孔中加入HmiHA蛋白，使每孔中蛋白终浓度达到5yg/ml。37°C培养72小时后，取每孔上清液，离心去除残余细胞，用购买自BD公司(货号560485)的小鼠Thl/Th2/thl7细胞因子检测试剂盒检测上清液中IL_2、IL_4、IL_6、IFN Y、TNF、IL-17、IL-10细胞因子的含量。结果如表2所示，产生的细胞因子IL-2与Thl类反应相关，产生的细胞因子IL_6和IL-10与Th2类反应相关。说明，C48/80组(第三组)小鼠IL_2、6、10与对照组相比均有显著升高，进一步表明该佐剂引发Thl/Th2平衡型免疫反应。表2、免疫第21天小鼠脾细胞在HA蛋白刺激下细胞因子产生情况。(n = 3只/ 组)


本发明公开了一种甲型H1N1流感疫苗及其应用。本发明提供了一种甲型H1N1流感疫苗，其活性成分为甲型H1N1流感病毒表面抗原和化合物C48/80。所述甲型H1N1流感病毒表面抗原和所述化合物C48/80的质量比为(1-9)∶10；所述甲型H1N1流感病毒表面抗原和所述化合物C48/80的质量比具体为(1、3或9)∶10。本发明的实验证明，本发明利用化合物C48/80作为佐剂，将其与甲型H1N1流感病毒表面抗原按照质量比为(1、3或9)∶10进行混合，得到甲型H1N1流感疫苗，为大量制备治疗甲型H1N1流感产品提供了研究基础。