专利名称：甲型肝炎病毒株sh及其二倍体细胞适应方法甲型肝炎，简称甲肝，是由甲型肝炎病毒引起的一种严重危害人类健康的急性传染病。甲肝主要通过“粪-口”途径传播，或个人间的传播，或因污染了甲肝病毒的水或者食物从而引起甲肝爆发。大龄儿童和成人感染甲肝后，70%以上为临床型感染，病死率为 0. 3% 0. 6% ；50岁以上患者的病死率为1. 8% ；慢性肝病者感染甲肝后，发生急性肝衰竭的危险性升高。随着生活条件的改善，成年人感染甲肝人数有增多趋势，临床型甲肝比例上升，从而甲肝成为较严重的公共卫生问题。我国是甲型肝炎高发区，每年至少有24万人患甲型肝炎，造成巨大的经济损失和社会危害，因此，研制并开发有效的预防和治疗甲型肝炎的疫苗和药物成为亟待解决的问题。目前国内生产的甲型肝炎灭活疫苗，由于各生产厂家使用的毒株、细胞基质和生产工艺不同，产品质量参差不齐。我国人口众多，甲肝疫苗远不能满足国内市场需求。
本发明的目的是提供一种新的甲型肝炎病毒SH株。本发明的另一目的是提供甲型肝炎病毒SH株在二倍体细胞上适应的方法。本发明的还一目的是提供甲型肝炎病毒SH株及其传代后的病毒在制备用于预防、治疗甲型肝炎的疫苗、药物中的应用。为了实现本发明目的，本发明的一种新的甲型肝炎病毒SH株，现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区大屯路中科院微生物研究所，保藏编号CGMCC NO. 4501，保藏日期2010年12月21日。该病毒株的分离方法包括以下步骤(a)取甲型肝炎急性感染患者粪便30 50g，加入直径为3mm玻璃珠40个和5倍体积的PBS，振荡10分钟；(b) 3000转离心20分钟，收集上清；(c)将沉淀再按上述方法处理2次，收集并合并3次的上清液；(d)向上清液中加入PEG600010g/100ml和NaCl 2. 3g/100ml，待全部溶解后4°C置数小时；(e)8000转离心30分钟，弃上清；(f)沉淀物加50ml PBS重悬，加入等体积氯仿振荡20分钟；3000转离心30分钟， 收集上层液相，加入PEG600010g/100ml和NaC12. 3g/100ml，溶解后置于4°C过夜；(g)次日以8000转30分钟离心弃上清，沉淀物加IOml PBS制成病毒悬液。透析15 18小时，更换透析液PBS3次，再加入10XMEM ；(h)过滤除菌，加1 %的P. S.。其中，所述MEM 为 0. 03% Glu,0. 08% NaHC03、0. 01 % 青霉素和 0. 01 % 链霉素；P. S.为青霉素和链霉素，其中青霉素和链霉素的摩尔比为1 1。本发明还提供甲型肝炎病毒SH株在二倍体细胞上适应的方法，包括如下步骤1)将MRC-5细胞经常规方法培养，细胞长成单层后接种甲型肝炎病毒SH悬液， 40cm2培养瓶种Iml病毒液，37°C吸附2小时，加维持液，35°C培养，每间隔7天更换病毒维持液一次，培养35天，用PBS洗细胞面3次，再用胰酶消化细胞，按0. Olml/cm2培养面积加入MEM悬浮沉淀细胞，得到病毒细胞悬液，超声破碎细胞，制备成病毒悬液；2)以步骤1)的方法，连续在MRC-5细胞上传传15 22代。其中，所述维持液为MEM加2%小牛血清。经上述细胞培养适应后的病毒在进行测试后，可作为疫苗生产备选株。本发明分离获得的新的甲型肝炎病毒SH株，该病毒抗原滴度可达 1 512-1 1024，病毒感染滴度可达7.0-8. 01gCCID5(1/ml，经免疫原性和交叉保护试验，用该毒株生产甲型肝炎灭活疫苗具有良好的免疫原性的保护效果，而且该毒株具有在MRC-5 细胞上增殖周期短、繁殖效率高的特点，适合用作大规模工业化生产的甲型肝炎灭活疫苗毒种，是生产甲型肝炎灭活疫苗的理想毒株。 按以上方法，将实施例1分离的甲型肝炎病I 代，最终获得一株MRC-5细胞适应性好的甲型肝炎病3自株SH株连续在MRC-5细胞上传15 株。本发明的甲型肝炎病毒毒株SH的特征为病毒颗粒直径27_32nm ；耐酸性在pH值3. O条件下，2_8°C作用8小时，感染滴度无明显变化；耐碱性经乙醚2-8 V作用8小时，感染滴度无明显变化；中和试验被HAV特异性抗体中和；基因序列分析与甲型肝炎病毒野毒株HM-175的基因序列同源性高达95. 92 %， 同属IB基因亚型。抗原滴度1 512-1 1024 ； 感染性滴度7. 0-8. 01gCCID50/ml ； 增值高峰期21_24天； 最适培养温度35°C -36 °C ； 增值部位细胞胞浆内； 具有甲肝病毒特性。
本发明的不同代次SH毒株抗原滴度及病毒感染滴度如表1所示t 表1 SH毒株不同代次抗原滴度及病毒感染滴度
代次
抗原滴度(EIA)
病毒感染滴度(logCCIDWml)
1-1.021:161.531:322.041:642.051:642.561:1283.071:1283.3381:2563.591:2564.0101:2565.5111:5126.33121:5127.0131:5127.5141:10248.0151:10248.0
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本发明的SH毒株15代增殖高峰期抗原滴度及病毒感染滴度试验结果如表2所表2 SH毒株15代增殖高峰期试验结果


本发明提供了一种新的甲型肝炎疫苗病毒株SH，其分离方法及MRC-5细胞适应方法。该病毒是从甲型肝炎急性感染患者粪便中分离得到的，再传至人二倍体细胞MRC-5细胞上适应培养。该SH毒株经基因测序、中和试验等方法证明是甲型肝炎病毒，适应过程中，早代次培养周期为35天，传至8代后培养周期缩短至24天。继续培养8代，抗原滴度可达1∶512-1∶1024，病毒感染滴度可达7.0-8.0lgCCID50/ml。经免疫原性和交叉保护试验表明，用该毒株生产甲型肝炎灭活疫苗具有良好的免疫原性的保护效果，适合用作大规模工业化生产的甲型肝炎灭活疫苗毒种，是生产甲型肝炎灭活疫苗的理想毒株。