专利名称：可提高水稻生殖期抗旱性的eadt1基因，编码序列和应用的制作方法水稻是我国最重要的粮食作物，同时也是农业生产中用水最多的作物。干旱严重影响了水稻的产量，如何减少水稻对水的依赖，使其具有节水抗旱的特性，对我国的粮食、 水和生态安全具有重要意义。产量的重要决定因素就是水稻在花期的结实率。水稻在不同发育时期对于干旱的耐受能力不一样(Saini & Lalonde，1998; Yang & Siang，2006)。 在营养期水分缺乏时，只要能维持最低需水量，那么在转入生殖生长期后，水分供给充足的话，往往能够开花结实，不一定会导致严重减产。生产实践也表明，水稻营养期完全可以在半湿润的土地上生长；但到了生殖生长期(花期)，田间则需要维持一定水层，因为此时水稻需水量最大。如果遭到水分胁迫，花粉粒育性往往会受到影响，导致结实率严重下降(Saini & Lalonde，1998)。在水稻的减数分裂期，短时间4天左右的干旱，都会导致产量严重下降 80% (Sheoran & Saini，1996)。因此，提高干旱胁迫下的水稻育性和结实率，对于提高逆境下的水稻产量有着十分重要的意义。利用分子生物学和基因工程技术进行分子育种，将抗旱相关基因转入优良的水稻品种中，改良其抗旱性，培育即抗旱又高产优质的农作物新品种是抗旱育种的有效途径之一。本研究通过水稻基因芯片的方法筛选到了一个在花期受干旱诱导的基因拟々/7，通过转基因技术提高这个基因在体内的表达水平，可以改变水稻花期的抗旱能力，提高结实率。EADTl (.Enhance Anthesis Drought Tolerance 7 )基因编码一个脂质转移蛋白 (Lipid Transfer Protein, LTP)，LTP是一类具有在膜间转运脂类分子活性的小分子蛋白质(Kader，1975)。它的分子内通常有8个保守的半胱氨酸残基，形成4个稳定的二硫键，根据不同的二硫键排布方式可以分为LTPl和LTP2家族，通常LTPl分子量稍大一些，在9_14 kDa之间，本发明中的拟々77基因就属于LTPl家族。而LTP2的分子量通常在7 Da左右 (Carvalho & Gomes，2007)；还有一类LTP-like的蛋白质，尽管在一级结构及二硫键排布方式上与LTP具有相似性，但分子内存在过多的带电氨基酸，体外没有转移脂质的活性，目前只在洋葱种子中发现(Cammue et al, 1995)。ZTP基因的5’端一般存在编码信号肽的顺序，在成熟蛋白中这段信号肽被剪去，故一般认为LTP存在于细胞壁中。水稻中有一个庞大的脂质转移蛋白家族，由52个基因编码(Boutrot et al, 2008)，但这个家族中的成员，可能具有不同的生理功能(Carvalho & Gomes，2007)。在不同物种中，LTP的功能分化非常多样，具体报道包括参与细胞角质层和蜡质的合成(Kim et al, 2008; Lee et al, 2009)； 信号传导和信号识别(Park et al, 2000; Blein et al, 2002);系统获得性抗性信号的传递(Maldonado et al, 2002)；花粉粒发育过程(Li et al, 2006; Zhang et al, 2010)； 抵御病原菌感染(Ge et al, 2003; Lee et al, 2009; Sarowar et al, 2009)等。因此，该基因可能主要参与了植物体内一些涉及脂质转运的生理过程，但这些过程可能各有不同的生理意义。本发明中的拟々/7基因参与了调节干旱胁迫下的雄配子发育过程。
本发明的目的在于提供一种受干旱诱导的脂质转移蛋白基因拟々77及其编码序列，并且利用该基因对宿主植物进行遗传上的改造，提高作物的抗逆性及缺水时的结实率。为了实现以上目的，本发明的一方面提供了一个新的水稻脂质转移蛋白的核苷酸顺序，它编码一个受干旱诱导的脂质转移蛋白基因拟々/7，体外功能是负责脂质的转运，体内功能是增加水稻生殖期的抗旱性，提高产量。水稻拟々/7基因全长U87bp，开放阅读框 934bp,内含子353bp ；cDNA编码区序列长!348bp。EADTl基因顺序和cDNA顺序分别如SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示；编码115个氨基酸，如SEQ ID NO. 3所示。本发明还提供从水稻mRNA中通过反转录PCR克隆此脂质转移蛋白基因拟々77的引物序歹Ij SEQID NO. 4和SEQID NO. 5，顺序如下SEQID NO. 4 (EADTl-F) ATGTCTCAGCTCAAGTCTTCTAG SEQID NO. 5 (EADTl-R) TCAGTGTGGCCAATCAAGTG本发明还提供含有上述水稻拟々/7基因载体的宿主。优选地，所述宿主为真核细胞。更优选地，所述宿主为水稻。本发明还提供一种利用转基因技术将拟々77的核苷酸序列转化到水稻中，提高它在水稻中的表达，以增强其生殖期抗旱性和结实率的方法，具体步骤如下(1)将水稻拟々/7基因的编码区连接于植物表达载体，形成含有水稻拟々/7基因的植物过表达载体；所用的表达载体可以为商业化或者实验室构造的载体，例如PCAMBIA1301U ；(2)将步骤(1)中的植物过表达载体转入农杆菌EHA105中，将含有表达载体的农杆菌侵染水稻愈伤，(在经过共培养、除菌、抗生素筛选和分化(大约4个月的时间)，获得 7YMEADTl基因的过表达转基因植株。这mkEADTl基因的转基因水稻能够提高水稻的生殖期的抗旱性和结实率。本发明还提供了一种用于检测转基因水稻中表达量的方法，主要利用荧光定量 PCR的方法。具体步骤为取转基因水稻的叶片，用TRIzoI法抽提水稻RNA，并用DNaseI消化DNA，然后反转录形成cDNA，以其为模板进行荧光定量PCR进行分析。荧光定量PCR引物核苷酸序列为SEQID N0. 6和SEQID N0. 7，如下SEQID NO. 6 (qEADTl-F) CTGCACTGCTGATCTTCCTCCTG SEQID NO. 7 (qEADTl-R) :AGCTTCGGCCCGTCCTTCTC
本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体以及由此改造而来的其他载体，MEADTi基因编码序列可操作地连接在表达调控序列之后，从而形成拟々77的转基因载体。本发明中，可用荧光定量PCR技术分析^基因的表达，即分析水稻拟々77的 RNA转录物在细胞中的存在与否和表达量。本发明至少具有下列优点及有益效果
(1)本发明提供的水稻基因及其编码蛋白在改善植物抗逆性方面具有明显的作用，能够明显提高水稻在干旱及高盐条件下的生长量，具有很大的应用价值。
(2)利用转基因技术得到改良的含有拟々77基因的转化植物在干旱条件下，生长、 生存状况及结实率明显优于野生型植物，表明了水稻拟々/7基因能够明显提高作物在干旱胁迫下的产量。(3)本发明提供的水稻拟々77基因编码的蛋白具有在膜间转移脂质的活性，具有潜在的的应用价值。本发明中，术语“拟々77的开放阅读框”指编码完整的水稻EADTl蛋白的核苷酸序列，如SEQ NO. 1中的核苷酸及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO. 2的核苷酸序列中，有一个或者多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO. 2的核苷酸序列的同源性低至约85%的简并序列也能编码出SEQ ID NO. 3所述的序列。该术语还包括与SEQID NO. 1中核苷酸序列的同源性至少85%，更佳的90%，最佳的95%的核苷酸序列。术语还包括能编码具有与天然水稻拟々/7基因相同功能的蛋白质的SEQ ID NO. 1 中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但不限于):若干个(通常为1-90个，最佳的1-10个)核苷酸的缺失、插入或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，最佳的为5个以内)核苷酸。


图1干旱胁迫条件下基因芯片及qRT-PCR鉴定水稻拟々77的表达变化。图2水稻拟々77序列与其它物种中的同源序列的进化分析(AT 拟南芥；OS 水稻)。图3转基因植株DNA水平的鉴定。其中，编号1，2为不同的过表达水稻1#，12#植株；
Rl, R2为RNA干扰植株r40，R853-1。此图仅说明载体已转入宿主植物中。图4水稻苗在不同胁迫处理(脱落酸、氯化钠、甘露醇)下在培养基上的生长情况。图5水稻苗在不同胁迫处理(氯化钠、甘露醇)下在培养基上的相对生长速率。其中A 为在含甘露醇培养基中的生长速率；B为在含氯化钠培养基中的相对生长速率。图6水稻苗期^过表达及^表达干扰(RNAi)株系在干旱胁迫下的表型。图7水稻苗期^边魏及EADTl表达干扰(RNAi )株系在干旱胁迫下的存活率。
A为两个过表达株系在干旱胁迫下的存活率；B为两个RNA干扰株系在干旱胁迫下的存活率，与野生型相比，变化趋势相反。图8生殖期干旱胁迫下野生型及过表达转基因株系12#的表型对比。图9生殖期干旱胁迫下野生型及过表达转基因株系12#花粉粒育性碘染分析。图10生殖期干旱胁迫下野生型及过表达转基因株系12#花粉粒育性百分比统计分析。图11生殖期干旱胁迫后野生型及过表达株系12#的结实情况分析。图12生殖期干旱胁迫后野生型及过表达株系12#的结实率比较。图13 EADTl蛋白的亚细胞定位。

1.胁迫处理
水稻日本晴种子催芽后，移到盆栽土中培养，在孕穗期停止浇水，进行干旱处理，待土壤水分降低到30%左右时，维持一个礼拜，取不同大小(2 3mm，3^4mm, 4^5mm, 5^7mm)的水稻花，分别收集并编号，以正常生长条件下的水稻作为对照，做三次重复。2.基因芯片及荧光定量PCR分析干旱条件下基因的表达
利用安捷伦公司的水稻芯片分析干旱条件下水稻基因的表达。比较干旱与正常情况下不同花发育时期拟々/7基因在水稻品种日本晴花的表达。结果显示拟々77基因在干旱胁迫条件下减数分裂时期(3 4mm，Γ5πιπι)的花中上调。利用荧光定量PCR进行表达水平验证， 得到的结果与基因芯片结果的变化趋势是一致的(图1所示)。实施例2水稻EADTl基因cDNA片段的克隆
1. RNA的提取取干旱处理的水稻花，在研钵中用液氮冷冻后研磨成粉状，加入盛有1 ml TRIzol试剂(Promega)的EP管，充分振荡后，室温放置5分钟，于4°C，12000 rpm离心 IOmin后，上清液移至新的EP管中，加上200μ1氯仿混成乳状，室温静置5分钟，12000 rpm 离心lOmin，上清液移至新的EP管中，加入两倍体积异丙醇沉淀RNA，离心，沉淀干燥后溶解于水，然后在分光光度计上测定RNA含量。2.反转录按照TaKaRa公司的PrimeScript Reverse Transcriptase说明书进行操作离心管中加入水稻总 RNA 5 μ (5 μδ), Oligo (dT)15 Primer (50 Mmol/L) 1 μ ， dNTP (10 mmol/L) 1 μ ，并用双蒸水加至10 μ ；瞬时离心使液体集中于管底，65°C保温5 min，迅速在冰上冷却2 min以上。在上述混合物中加入5XPrimeScript Buffer 4 μ ， RNase 抑制剂(40 U/μΙ) 0. 5 μ , PrimeScript Reverse Transcriptase (200 U/μΙ) 0. 5 μ ，双蒸水加至20 μ ，离心使液体集中于管底，42°C保温1 h，70°C灭活15 min，冰上冷却， 得到水稻cDNA第一链。3. EADTl cDNA 的克隆
根据GenBank中水稻数据库信息中提供的序列信息，设计引物(SEQ ID N0. 4)，利用上述反转录产物为模板，采用PCR方法进行cDNA序列扩增。通过RT-PCR得到一个包含有完整开放读框的编码区，长度为348bp ；回收，连接到 PMD19-T载体上，并进行测序。测序结果在NCBI网站上进行BLAST分析，结果显示其与水稻注释基因0sl0g0148000完全匹配。同时，其核苷酸序列与已知禾本科植物普通小麦的 AK331192. 1有81%同源性，和二穗短柄草的基因XM_003573684. 1有72%同源性，和大麦的基因AK372510. 1有76%同源性，与高粱的基因XM_002467303. 1有68%同源性。实施例3水稻EADTl的序列信息与同源性分析
拟々77基因编码区的长度为348bp，其序列如SEQ ID N0. 2所示。根据全长cDNA推导出水稻EADTl的氨基酸序列，共115个氨基酸残基，分子量为12223. 1道尔顿，等电点(pi) 为5. 67，其序列如SEQ NO. 3所示。生物信息学分析显示此蛋白为不稳定的疏水性蛋白。将此蛋白在GenBank进行BLAST比对，获得与此蛋白同源的蛋白序列，用Clustal X软件进行比对，然后用MEGA5软件根据邻近法构建进化树(图2)。实施例4 EADTl在水稻中过表达的转基因植株鉴定 1.水稻拟々77基因的表达载体构建
根据水稻基因拟々/7的全长序列，设计上下游引物，并引入限制性内切酶位点(这可视选用的载体而定)，以便构建表达载体。以实施例1中获得的扩增产物为模板，经PCR扩增后，将水稻基因拟々/7的cDNA克隆至中间载体(pMD19-T载体，TAKARA)，进一步克隆到过表达载体PCAMBIA1301U上，测序，在保证阅读框架正确的前提下再将该过表达载体转入农杆菌中，并转化水稻日本晴。2.农杆菌介导法来进行水稻转基因 A.诱导愈伤组织
1)选取成熟饱满的种子，去掉内外颖壳，用纯净水洗3-4次，再用70%乙醇浸泡2min， 用纯净水洗7-8次，用0. 1%的升汞处理15min，lOOrpm。2)在超净台中弃去升汞，用无菌水洗数次，在无菌干净滤纸上吸干水分，置于N6D 培养基上，胚朝下或接触培养基，28°C，暗培养21天。12-15粒/组培瓶。B.继代培养
将愈伤周围的胚根、胚芽剥除干净，愈伤在干净滤纸上晾一下，转移至N6D继代培养基上，28 °C，暗培养7-10天。C.前培养
将继代的愈伤组织转移至前培养基上，28 0C，暗培养3-4天。D.农杆菌EHA105的培养
将上一部分实验中得到的正确克隆的农杆菌菌液涂布于YEB三抗平板(链霉素、利福平和卡那霉素抗性)上，28°C，暗培养约36小时。E.侵染与共培养
1)将前培养的愈伤在无菌滤纸上晾一下，并集中转移至平皿中。2)取灭菌小勺刮取农杆菌4-6勺于感染用的液体培养基中，搅拌至悬浮均勻(无大的菌块存在)。3)将愈伤转至离心管中，轻轻翻转混勻，静置15 20min，期间间隔5min混勻一次。4)将菌液倒出，愈伤置于无菌滤纸上吹干约1.5小时以上，保证菌液吸干，接至共培养培养基上，20 0C，暗培养2-3天。F.除菌
1)将共培养的愈伤转移至50mL的离心管，用无菌水清洗3次以上，直至液体比较清亮。2)倒出无菌水，用含有500mg/L头孢霉素的N6D液体培养基清洗，每次lOOrpm， 15 20min，3 4 次。3)将愈伤倒在干净灭菌滤纸上，吸干吹干2小时以上，保证吸干。4)将干燥的愈伤转至除菌培养基上，28°C，暗培养，7 10天。
G.筛选
将没有被农杆菌污染的愈伤转移至筛选培养基(N6D+50mg/L潮霉素B+250mg/L头孢霉素)上，28°C，暗培养。每15 20天可以更换一次培养基，筛选时间不得少于45天。H.分化
将经过筛选新长出来的愈伤转移至分化培养基(MS+ang/L 6-BA+O. 2mg/L NAA+2mg/L KT+0. 2mg/L IAA+ 50mg/L潮霉素+250mg/L头孢霉素，16小时光培养。在进行分化培养前，可以先将愈伤暗培养几天以作为预分化。也需要定期的更换培养基。I.生根
将分化出来的转基因苗Olcm高)，剥除多余的愈伤组织，并剪去根(留约0. 5cm)，移至 1/2MS培养基中生根。28°C, 16小时光培养。J.炼苗与移栽
生根结束后，可以除去生根培养基后，将苗泡于水中数日进行炼苗，然后移栽入土中生长。3.转基因植株的鉴定
剪取转基因水稻叶片，用CTAB法提取DNA，通过检测潮霉素基因的方法鉴定转基因情况(图3)。并用TRIzoI法抽取叶片RNA，反转录成cDNA (方法同实例2)，根据基因序列设计引物进行荧光定量PCR分析转基因水稻中拟々77基因的表达情况，具体操作按照TAKARA公司试剂盒说明操作，荧光定量PCR仪为ABI Steponeplus .实施例5 EADTl过表达转基因植株的抗逆性鉴定
基因芯片分析表明，EADTl基因在干旱胁迫后的花中表达明显提高。对苗期和孕穗期 EADTl的过表达转基因株系(日本晴)分别进行干旱和盐胁迫等实验，观察转基因水稻的抗逆性，与野生型对比。1.苗期抗旱处理
把日本晴水稻种子和转基因水稻种子，剥去外壳后，用50%次氯酸钠溶液消毒20分钟后，播种在含有1/2MS以及分别含有ABA (4uM)、NaCl (150mM)、甘露醇(200mM)的1/2MS培养基中，观察水稻在ABA、NaCl和甘露醇(作为干旱胁迫的模拟物)胁迫条件下的萌发及生长情况。光照培养(16小时光照/8小时黑暗)12天后，测定水稻的生长高度，以及在甘露醇中生长的单株水稻的重量。水稻相对生长速率等于不同处理条件下水稻的高度或长度/正常条件下生长水稻的高度或长度。结果显示，过表达拟々/7基因的转基因水稻在胁迫条件下的生长速率明显增加，特别是根的生长速率要明显的高于对照(图4，5)。把5-6棵发芽的对照或者转基因植株(日本晴和转基因水稻)种在每个盆中(黑土 蛭石=7:3)，待水稻长到5叶期时停止浇水，在大棚中让其水分自然蒸发，进行干旱处理，大约干旱8天后，转基因水稻的叶片的存活程度明显较高。复水后3天，转基因水稻变绿存活率也明显比对照高。蒽酮法测定可溶性糖和酸性茚三酮法测定脯氨酸表明，在干旱条件下，转基因的水稻积累大量的可溶性糖和脯氨酸，表现出较强的抗旱性(图6，7)。2.开花前干旱处理
待水稻长到减数分裂期时，实行水分自然干旱法。水稻种植在含水稻土的方形盆中，待水分蒸发至含水率15%左右，保持该含水率15天，以后恢复浇水，过表达植株存活的植株远远多于对照组(图8)，结果表明，过表达拟々77能有效的提高水稻的抗旱性。3.开花期抗旱处理
孕穗期水稻实行水分自然干旱法。水稻生长于方形盆的泥土中，转入生殖生长后，停止浇水，待土壤含水率降至15%左右后保持此含水率3天，测定剑叶的脯氨酸含量，并用 I2-KI进行染色观察水稻花粉的活性取颖壳刚刚打开，但花药还未开裂的花，采集水稻成熟花药，将花药于载玻片上，加1滴蒸馏水，用镊子将花药捣碎，使花粉粒释放。晾干，大约 IOmin ；加1 2滴I2-KI溶液，盖上盖玻片，5min ；在显微镜下观察2 3个玻片，每片取 3-5个视野，统计花粉的染色率，其中深紫色的花粉为可育花粉，红色或者黄色的为不育花粉，花粉粒育性为可育花粉数除以可育和不育花粉粒的总数所得到的百分数。结果显示，转拟々77基因的水稻在干旱条件下花粉粒的育性要明显高于对照组的水稻(图9，10)。花期干旱胁迫后恢复浇水，待种子成熟后统计结实率，结果表明，过表达转基因水稻能够改善水稻的结实率，转基因水稻结实率高于照组(图11，12)。实施例6烟草中分析水稻EADTl蛋白的亚细胞定位
把拟々77基因连接到瞬时表达载体p35S::EYFP上，转化农杆菌，用微型注射器沿着烟草叶脉把含有表达质粒的农杆菌注射到烟草叶片中，培养3天后，切取注射位置的叶片在共聚焦显微镜下观察并拍照片，结果显示此蛋白定位于细胞膜和核膜周围(图13)。


本发明属于分子生物学、基因工程技术领域，具体为一种可提高水稻生殖期抗旱性的EADT1基因，编码序列和应用。本发明涉及在水稻中表达的植物脂质转移蛋白基因EADT1的编码序列，其主要作用是能够增强水稻生殖期抗旱性(包括但不仅仅限于生殖期)，提高水稻结实率。本发明还包含此基因序列的重组载体，及应用此载体转化的转基因植物。应用本发明所涉及的基因在植物中转化表达，可以提高转基因水稻在干旱胁迫下的结实率，减少农作物在干旱等逆境条件下的产量损失。