专利名称：一种提高水稻种子γ-氨基丁酸含量的方法Y-氨基丁酸(Y-amino butyric acid，GABA)是广泛分布于动植物中的一种非蛋 白质氨基酸，是生物体内的天然活性成分。Y-氨基丁酸在动物体内是一种抑制性神经传递 物质，能介导中枢神经系统的抑制性神经传导，系统地对脑血管进行调节。除脑和脊髓外， 已在多种哺乳动物的近30种外周组织中发现Y-氨基丁酸(GABA)的存在。现有技术表明 Y _氨基丁酸(GABA)是生物体内的生理活性成分，具有降血压、抗焦虑、改善脑机能、增强 长期记忆力的功能。所以Y-氨基丁酸(GABA)是一种很好的医疗药物及保健品的原料。高 血压是危害人类健康的常见疾病，近十几年来发病率逐步升高。现有技术治疗高血压药物， 效果都不理想。Y“氨基丁酸对于治疗和预防高血压疾病具有独特的效果和巨大的应用潜 力。水稻是农业生产中的重要粮食作物，也是人类赖以生存的主要食品。水稻种子中 含有数量有限的Y-氨基丁酸，不能满足人类的保健要求。发明提供一种有效提高水稻 种子中Y-氨基丁酸含量的方法，是非常有意义的。利用这种方法生产的产品，做为种子 使用，具有遗传功能，可以提高F1代稻谷中的Y -氨基丁酸含量；做为食物，可以充分利用 Y-氨基丁酸(GABA)对人类的降血压、抗焦虑、改善脑机能、增强长期记忆能力的药理功 效，促进人类健康，减轻心血管疾病的危害，延长人类寿命。Y -氨基丁酸合成酶(GABA synthase )，也称为谷氨酸脱羧酶(glutamate decarboxylase，GAD)，是合成氨基丁酸的关键酶。水稻中有多种基因，似似是其 中的一种。日本学者Kazuhito Akama研究发现，在水稻中过量表达AsG^MC 0sGAD2末端 30个氨基酸缺失后，GABA的含量提高了 100倍；证明了氨基酸序列C末端的30个氨基酸会 抑制其自身的活性。这种方法在的缺点是虽然在一定程度上提高了水稻中Y-氨基丁酸 含量，但提高的是其在整个水稻植株中的含量；而且后代会出现矮化，白化，卷叶，不育等严 重表型缺陷现象。RT-PCR分析结果，和水稻植株的其它组织相比，GAD2在成熟的种子中表 达量低。本发明利用基因工程方法，将5. 3kbGtl启动子序列和GAD2A C30序列共同转化水 稻植株，不仅会使GAD2A C30特异地在水稻种子中表达；而且水稻种子中的Y _氨基丁酸 (GABA)含量明显提高；其后代表型正常。经广泛查阅国内外出版物，检索国内外专利文献，未发现与本发明主题和技术方 案完全相同专利和技术文献的报道。
本发明的目的在于提供一种提高水稻种子Y-氨基丁酸含量的方法。本发明涉及水稻种子特异性表达启动子的克隆、关键酶基因序列GAD2A C30的克隆、载体构建、遗传转 化、PCR及Western Blot分子检测、Y -氨基丁酸提取及含量测定，发明了提高水稻种子中 Y “氨基丁酸GABA含量的方法，为Y -氨基丁酸大规模生产奠定了基础。本发明是通过以下技术方案实现的提高水稻种子Y-氨基丁酸含量的方法，包括以下步骤(1)从越光水稻中克隆5.3kbGtl启动子序列和GAD2A C30序列；(2)把5.3kbGtl启动子序列和GAD2A C30序列连于表达调控序列，形成含有5. 3kbGtl 启动子序列和GAD2A C30序列的植物表达载体；(3)将含5.3kbGtl启动子序列和GAD2A C30序列的植物表达载体转化到根癌农杆菌， 获得含有5. 3kbGtl启动子序列和GAD2A C30序列植物表达载体的根癌农杆菌菌株；(4)将步骤(3)根癌农杆菌遗传转化水稻，获得PCR及WesternBlot检测阳性的转基 因水稻植株；
(5)对步骤(4)获得的转基因水稻水稻种子中Y-氨基丁酸含量进行HPLC检测，γ-氨 基丁酸含量显著提高，后代表型正常。步骤(1)从越光水稻中克隆的GAD2A C30序列是在GAD2基因的cDNA末端缺失 90bp，终止密码子TAG上游90bp的一段cDNA序列，编码氨基酸序列为缺失C末端30个氨 基酸的序列。步骤(2)中5. 3kbGtl启动子序列末端序列，距最末端一个碱基600bp处设计一条 上游特异性引物及一条GAD2A C30序列的下游特异性引物，PCR方法对所述转基因水稻进 行分子检测结果扩增出2013bp大小的特异DNA片段的阳性转基因水稻植株。步骤(5)所述的HPLC法测定水稻种子中γ-氨基丁酸含量的方法为
(1)色谱柱为Hypersil ODS C18 柱 125mm X 4. Omm , 5ym ；
(2)流动相A醋酸钠缓冲液的制备方法取醋酸钠2.72g，三乙胺0.2mL，加水溶解， 冰醋酸调节PH至7. 3，加水至IOOOmL ；
(3)流动相B的制备方法pH值7.2的1. 35%醋酸钠、乙腈、甲醇重量比为 100 175 225 ；
(4)梯度洗脱0 4min,流动相B的比例从0.5%增加至26%，维持6min后，增加至 100%,维持 7min ；
(5)流速为ImL · rnirT1 ；
(6)检测波长338nm，柱温40°C。本发明的要点在于
从日本优质水稻品种越光中克隆5. 3kbGtl启动子序列和GAD2A C30序列，构建含上 述DNA分子的植物表达载体，用根癌农杆菌介导，将5. 3kbGtl启动子序列和GAD2A C30序 列同时导入越光水稻细胞并再生出水稻植株。PCR检测目的基因5. 3kbGtl启动子序列和 GAD2Δ C30序列的整合情况；Western Blot检测转基因水稻种子中GAD2 Δ C30蛋白的表达 情况，高效液相色谱测定转基因水稻中GABA的含量。本发明包括如下具体步骤
(1)根据已有序列设计特异引物克隆越光水稻中5 1力位7启动子序列和G^iMOO序
列；
4(2)把5.3kbGtl启动子序列和GAD2A C30序列可操作性地连于表达调控序列，形成含 有5. 3kbGtl启动子序列和GAD2A C30序列的植物表达载体；
(3)将含5.3kbGtl启动子序列和GAD2A C30序列的植物表达载体转化到根癌农杆菌， 获得含有5. 3kbGtl启动子序列和GAD2A C30序列植物表达载体的根癌农杆菌菌株；
(4)利用所构建的根癌农杆菌遗传转化水稻，获得经PCR及WesternBlot检测为阳性 的转基因水稻植株；
(5)对获得的转基因水稻植株种子中GABA含量进行HPLC检测，获得GABA含量显著提 高，且后代表型正常的转基因水稻植株。所述的PCR检测中，根据5. 3kbGtl启动子序列末端序列，距最末端一个碱基600bp 处，设计一条上游特异性引物，下游特异性引物则位于GAD2A C30序列上，PCR方法对所述 转基因水稻进行分子检测，结果扩增出2013bp大小的特异DNA片段的为阳性转基因水稻植株。上述高效液相色谱测定GABA含量的方法如下色谱柱为Hypersil ODS C18柱 125mmX4. Omm，5 μ m。流动相A为醋酸钠缓冲液，制备方法是取醋酸钠2. 72g，三乙胺 0. 2mL,加水至适量使其溶解，用冰醋酸调节pH至7. 3后，加水至1000mL。流动相B为pH7. 2 的1.35 %醋酸钠乙腈甲醇=100 175 225，均勻混合。梯度洗脱0 4min，流动 相B的比例从0. 5%增加至26%,维持6min后，增加至100%,维持7min ；流速为ImL .mirT1 ； 检测波长338nm，柱温40°C。本发明的5. 3kbGtl启动子序列和GAD2A C30序列共转化策略提高水稻种子GABA 含量的方法，采用基因工程方法，将5 3kbGtl启动子序列和似似」序列导入水稻中，获 得了 GABA高产的转基因水稻植株。GABA高产的转基因水稻植株的获得，可以显著增加水稻 种子中Y-氨基丁酸的含量，水稻种子中Y-氨基丁酸的含量是非转化对照水稻种子的8. 3 倍。本发明对提高水稻种子中Y-氨基丁酸含量，低具有重要意义。对于通过食用水稻种 子，增加人体内的Y-氨基丁酸，治疗和预防高血压疾病具有独特的效果和促进作用。本发明的优点是
1、水稻种子中Y-氨基丁酸的含量增加显著；
2、本发明水稻种子Y-氨基丁酸的高含量性状，具有遗传功能，可以使F1代仍然具有 Y-氨基丁酸的高含量性状；
3、本发明水稻种子产品对治疗和预防人类高血压疾病有促进作用；
4、方法可靠，便于实施，实用性强。

实施例1
水稻5. 3kbGtl启动子序列和GAD2A C30序列的克隆。1.组织分离(Isolation)
将水稻种子剥去外壳，用75%乙醇浸泡1. 5 min，倒掉酒精，再用0. HgCl2灭菌 10 min,无菌水冲洗5—6次，用无菌吸水纸吸干表面水分，接种于无激素的MS (Murashige and Skoog, 1962)固体培养基中，25°C、12h / 12h光照培养，即可获得水稻无菌苗，两周后， 切取叶片和茎段用于RNA提取。2. RNA 的分离(RNA isolation)
称取0. 8 g所述的水稻无菌试管苗，用液氮速冻后，迅速用研钵研碎，加入盛有1 mL TRIzol (TRIzol Reagents,GIBCO BRL,USA)的 1.5 mL Eppendorf 管中，充分振荡后，于 室温下放置5 min，加200ul氯仿，用力振荡20sec，室温放置5 min后，于4°C、12，OOOg离 心15 min。将约500ul上清液吸入干净的1. 5 mL Eppendorf管中，加入等体积的异丙醇， 颠倒混勻，室温下放置IOmin后，于4°C、12，OOOg离心10 min ；弃上清，加IOOOul 75%乙 醇清洗，充分振荡后，于4°C、8，OOOg离心5min ；室温干燥20min后溶于40ul RNAase-free 水中。用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。3.基因克隆(Cloning of the genes) 3. 1 5. 3kbGtl启动子序列的克隆
根据5激力位7启动子的序列(SEQ ID NO. 1)设计上下游引物，并在上游和下游上分 别引入限制性内切酶位点，以便构建表达载体。以越光水稻基因组DNA为模板，利用PCR扩 增出5. 3kbGtl启动子的序列后进行测序。DNA序列测定由上海生工生物工程技术有限公 司采用3730自动测序仪完成。测序结果表明，所克隆的序列与GENBANK中所报道的水稻 5. 3kbGtl启动子的序列(SEQ ID NO. 1) 一致； 3. 2似似」CJO序列的克隆 3. 2. 1第一链cDNA的合成 3.2.2水稻GAD2A C30序列编码区的PCR扩增
根据所述水稻似似基因的编码序列(SEQ ID N0. 2)分别设计扩增出其cDNA末 端缺失90bp (终止密码子TAG上游90bp)的编码框的上下游引物，并在上游和下游引物上 分别引入限制性内切酶位点，以便构建表达载体。以所述的第一链cDNA为模板，经PCR扩 增后进行测序。DNA序列测定由上海生工生物工程技术有限公司采用3730自动测序仪完 成。测序结果表明，所克隆的序列与GENBANK中所报道的水稻似似(SEQ ID N0. 2)编码 序列去除cDNA末端90bp —致。本实施例采用基因克隆方法从水稻中获得序列正确的水稻5. 3kbGtl启动子序列 和G^iMOO序列，通过基因与种子特异性表达启动子序列融合构建植物，表达载体遗传 转化植物体代谢工程策略，提高水稻种子GABA含量提供了一个在水稻种子中特异性表达 的启动子序列和一个缺失cDNA末端90bp的关键酶基因。实施例2
含5. 3kbGtl启动子序列和GAD2A C30序列的植物表达载体的构建。1.植物表达载体PCAMBIA1304+-5激力兌7的构建
以pBI121和pCAMBIA1304为材料，构建植物表达载体pCAMBIA1304+。具体地，HindIII / EcoRI 双酶切 pBI121 和 pCAMBIA1304 ；回收 pBI121_GUS 表达盒及 pCAMBIA1304 大片段；连接转化，挑取单克隆菌落抽提质粒酶切验证。结果表明，植物表达载体 PCAMBIA1304+构建成功。以pCAMBIA1304+为表达载体，将实施例1中5. 3kbGtl启动子连 于其上。将 Hind III / Xba I 双酶切 pMD18T_5 3kbGtl 和 pCAMBIA1304+ 回收 5 3kbGtl 和 PCAMBIA1304+大片段，连接转化，挑取单克隆，提取质粒做PCR检测和酶切验证。2.植物表达载体 pCAMBIA1304+-5 3kbGtl~GAD2A C30 的构建
以上述PCAMBIA1304+-5激力位7为基础，用实施例1中的GAD2Δ C30替 换pCAMBIA1304+-5激力位7上的基因。具体地将BamH I / Sac I双酶切 PCAMBIA1304+-5 3kbGtl 和 pMD18T_似似」C30,回收 pCAMBIA1304+_5 3kbGtl 大片段和 GAD2A OO序列小片段，连接转化，挑取单克隆，提取质粒做PCR检测和酶切验证。从而获得 含 5. 3kbGtl 和 GAD2A C30 的植物表达载体 pCAMBIA1304+_5 3kbGtl~GAD2A C30o本实施例将水稻种子中特异表达的启动子序列5. 3kbGtl及GABA生物合成途径关 键酶基因的修饰基因似似」可操作性地连于表达调控序列，形成含5 3kbGtl启动子序 列和GAD2A C30序列的植物表达载体，该表达载体可用于通过代谢工程策略来提高水稻种 子GABA含量。实施例3
根癌农杆菌介导5. 3kbGtl启动子序列和GAD2A C30序列遗传转化水稻获得转基 因水稻植株。 1.含5 3kbGtl启动子序列和GAD2A C30序列植物表达载体根癌农杆菌工程菌 的获得
将实施例2中含5. 3kbGtl启动子序列和GAD2A C30序列的植物表达载体转入根 癌农杆菌EHA105，并进行PCR验证。结果表明，含5. 3kbGtl启动子序列和GAD2Δ C30序列 植物表达载体己成功构建到根癌农杆菌菌株。 2.根癌农杆菌介导5. 3kbGtl启动子序列和GAD2Δ C30序列转化水稻 2. 1.水稻愈伤组织的诱导 将水稻种子剥去外壳，用75%乙醇浸泡1. 5 min，倒掉酒精，再用0. 1% HgCl2灭 菌10 min，无菌水冲洗5— 6次，用无菌吸水纸吸干表面水分，接种于MS (Murashige and Skoog,1962)+3mg/L 2，4D固体培养基中，25°C暗培养。10天后，从水稻种子胚的周围生长 出米黄色的愈伤组织；
2. 2.农杆菌与水稻愈伤组织的共培养
将上述的米黄色的水稻愈伤组织，放入含活化好的根癌农杆菌工程菌的MS悬液 中浸泡15 min，轻轻摇动使愈伤组织与菌液充分接触；倒出悬液，用无菌吸水纸吸干表面余 菌，转到共培养培养基(MS+ ASlOOymol / L)中，暗培养3d。以浸泡在不带有根癌农杆菌 的MS液体培养基中的愈伤组织为对照；
2. 3.抗性愈伤组织的筛选和植株再生
将所述的共培养3 d的水稻愈伤组织用无菌水冲洗10次后转入至IOOml含500mg / L Cef的去离子水中，25°C，120rpm振荡2hr，弃去水，吸去愈伤组织表面过多的水分。转移愈 伤组织至选择培养基MS+3mg/L 2, 4D+250mg / L Cef中，经过4周的选择培养，转移正常成 活的愈伤组织至新的选择培养基中再培养3周，以便进一步筛选抗性愈伤，另外还能够使具有抗性的愈伤组织得到增殖。经过两次选择培养后，转移那些生长旺盛的愈伤组织至预 分化培养基(MS+1. Omg/L 6-BA+2. Omg / L NAA+5. Omg / L ABA)中，25°C，暗培养 3 周。从 预分化培养基中转移愈伤组织至分化培养基MS+2.0mg/L 6-BA+l. Omg / L IAA+1. Omg / L NAA中，25°C，每天约14hr光照培养2000lux。3周后看到从愈伤组织上生长出再生苗，将这 些小苗连同其愈伤转移至生根培养基(1 / 2 MS)中，让其生根，直至小苗长到三角瓶顶部。 打开三角瓶的封口膜，让无菌苗适应外界环境1 一 2天；小心地将无菌苗从三角瓶中取出， 立即用自来水洗去根部的培养基。将每株无菌苗分开转移到含有1/2MS培养液约5cm直径 大小的塑料培养皿中，放置培养室中，90%的湿度，200C，每天14hr光照4000 Iux培养7_10 天；转移无菌苗至泥土中进行正常生长。3.转基因水稻植株的PCR检测
根据5. 3kbGtl启动子序列末端序列，距最末端一个碱基600bp处设计一条上游 特异性引物，和已有的GAD2A C30序列的下游引物配对，用PCR方法对所述转基因水稻进行 分子检测。结果表明，利用此对特异引物，扩增出2013bp大小的特异DNA片段。而以非转 化普通水稻基因组DNA为模板时，没有扩增出任何片段。这说明5 1力位7启动子序列和 GAD2Δ C30序列已经整合到水稻基因组中。本实施例将所述的植物表达载体转化根癌农杆菌，获得用于转化水稻的含 5. 3kbGtl启动子序列和GAD2A C30序列的植物表达载体的根癌农杆菌菌株，利用所构建的 根癌农杆菌菌株转化水稻细胞，获得经PCR检测的转基因水稻。实施例4
利用Western blot检测GAD2 Δ C30蛋白在转基因水稻植株中的表达。1.蛋白的提取
1.1 取 KH2PO4 0.2 g/L, Na2HPO4 1. 15 g/L, KCl 0.2 g/L, NaCl 8 g/L 混合均勻，配 制1*PBS溶液；取50 mg新鲜转基因水稻叶片，加入IOOul 1*PBS，放入1.5ml Eppendorf 管中研磨；
1. 2 13000rpm, 4° C 离心 20 分钟；
1.3将上清液收集于一新管中，备用；以上过程在冰上进行。2.蛋白定量参考Bradford法(Bradford，1976)。取2ul蛋白样品，加入Iml Bradford试剂，混勻后，分光光度计测OD595 ；蛋白含量计算1 OD595= 28. 57mg。3. SDS-PAGE分离蛋白SDS_PAGE的制备参考《分子克隆》(Sambrook等，1989); 3. 1加样前，将样品置于含50mmol/L DTT的加样缓冲液(2*加样缓冲液甘油2. 4g,
IM Tris-HCl pH6. 8 Iml ；溴酚兰0. 01%, H2O定容至20ml)，煮沸10分钟放置冰上，冷却后 上样；
3.2室温100V电压下聚丙烯酰胺凝胶电泳，直到指示剂溴酚兰前沿达到凝胶底部。4.蛋白质向硝酸纤维膜上转移
4.1 转移之前，用转移缓冲液(39 mmol 甘氨酸，48 mmol Tris Base,0. 037% SDS, 20% 甲醇)平衡凝胶和硝酸纤维膜30分钟；
4. 2室温下用半干式电转仪转移lh，凝胶两侧各垫3层Whatman滤纸。5.硝酸纤维膜上蛋白的检测
5.1将硝酸纤维膜浸在封闭液中，37° C缓慢摇动、封闭60分钟(封闭液取5g脱脂奶粉溶于100ml 1*PBS (含0. 5g叠氮钠)；
5. 2再将滤膜浸泡在洗涤缓冲液中，37° C洗涤两次，每次15分钟； 5. 3加入第一抗体抗水稻GAD2的抗体，37° C温育30分钟； 5.4同步骤5. 2，洗涤三次；
5. 5加入第二抗体抗兔IgG，37° C温育30分钟；同步骤5. 2，洗涤两次； 5. 6加入底物显色观察蛋白条带。实施例5
利用HPLC测定转基因水稻种子中GABA含量。5.1.样品制备
准确称取5 g转基因水稻种子样品于250mL三角瓶中，加入乙醇-水(体积比为 60 40)溶液30 mL于70°C水浴中回流两次(每次30 min)，合并提取液并浓缩至一定 体积，经0. 45 μ m滤膜过滤后-20°c保存。5. 2.色谱条件及系统适用性以及标准溶液的配制
色谱柱为Hypersil ODS C18柱(125_ X4. Omm，5 μ m)；流动相A为醋酸钠缓冲液 (取醋酸钠2. 72g,三乙胺0. 2mL,加水至适量使溶解，用冰醋酸调节pH至7. 3后，加水 至IOOOmL)；流动相B为1.35%醋酸钠(pH7. 2)-乙腈-甲醇(100 175 225)；梯度洗 脱0 4min，流动相B的比例从0.5 %增加至26 %，维持6min后，增加至100%，维持 7min ；流速为ImL · min—1 ；检测波长338nm,柱温40 °C ；
取GABA标准品约10. 5mg，精密称定，置25mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇 勻，作为对照品溶液；
为了使被测品可做高灵敏度荧光检测，本法采用邻苯二甲醛(OPA)柱前衍生测定的方 法，而且OPA本身不干扰分离与检测，不必除去过量试剂，色谱图基线比较平稳，其灵敏 度比茚三酮法高出10倍。按上述的色谱条件洗脱，GABA的出峰时间为6.24min，峰型良好。5.3.标准曲线的制作
将所述对照品溶液分别取lul，3ul，5ul，8ul，10ul，在上述色谱条件下进样，记录图谱 及色谱参数，分别以峰面积⑴对标准品浓度(χ)进行回归分析，制作标准曲线。5. 4.样品GABA含量的测定
将5. 1中-20°C保存的样品各取IOul加样检测，记录各组分峰面积，代入线性回归方 程，计算即得样品GABA含量。在本发明中共转5. 3kbGtl启动子序列和GAD2A C30序列显著提高水稻种子中 GABA含量。共转5 3kbGtl启动子序列和似似」序列的水稻种子中GABA平均含量是非 转化普通种子的8. 3倍，且后代表型正常。本实施例采用HPLC法测定了转基因水稻种子中GABA含量。采用共转化5. 3kbGtl 启动子序列和GAD2A C30序列的代谢工程策略获得了 GABA高产的水稻植株，为提高水稻种 子中GABA含量提供了一种理想方法。上述实施例仅为本发明的优选例，并不用来限制本发明，凡在本发明的原则之内， 所做的任何修改和变化，均在本发明的保护范围之内。本发明涉及的序列及记号分列如下 SEQ ID NO. 1的信息
9<110>上海师范大学
<120> 一种提高水稻种子Y-氨基丁酸含量的方法 <160> 1
<170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 5391 <212> DNA
<213> 水稻(Oryza sativa) <400> 1
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本发明涉及基因工程技术，一种提高水稻种子γ-氨基丁酸含量的方法。天然的水稻种子中γ-氨基丁酸含量很低，无法满足人类治疗和预防高血压疾病的保健要求。本发明包括以下步骤从水稻中克隆出5.3kbGt1启动子序列和谷氨酸脱羧酶GAD2ΔC30序列，构建含5.3kbGt1启动子序列和GAD2ΔC30序列的植物表达载体，遗传转化水稻获得转基因水稻植株，PCR检测目的基因5.3kbGt1启动子序列和GAD2ΔC30序列的整合，RT-PCR分析检测转基因水稻种子中GAD2ΔC30蛋白的表达，测定水稻种子中γ-氨基丁酸含量。本发明方法可显著提高水稻种子中γ-氨基丁酸含量，具有遗传功能，有利于保护人民的健康。