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一株具有高产γ-氨基丁酸能力的菌株制作方法

  • 专利名称
    一株具有高产γ-氨基丁酸能力的菌株制作方法
  • 发明者
    单艺, 周艳秋, 姜毓君, 张光辉, 杨士芹, 满朝新, 王今雨, 董鑫悦, 薛玉清, 迟涛, 郎友, 郭颖
  • 公开日
    2012年4月25日
  • 申请日期
    2011年12月23日
  • 优先权日
    2011年12月23日
  • 申请人
    黑龙江省乳品工业技术开发中心
  • 文档编号
    C12R1/25GK102424807SQ20111043969
  • 关键字
  • 权利要求
    1. 一株具有高产Y-氨基丁酸能力的菌株,其特征在于它为植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)NDC 75017,属于乳杆菌属(Lactobacillus),已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏,保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号, 保藏编号为CGMCC NO 5448,保藏日期为2011年11月08日
  • 技术领域
    本发明涉及一株具有产Y-氨基丁酸能力的菌株
  • 背景技术
  • 专利详情
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  • 权力要求
  • 说明书
  • 法律状态
专利名称:一株具有高产γ-氨基丁酸能力的菌株的制作方法乳酸菌指发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称。 绝大部分乳酸菌都是人体内必不可少的且具有重要生理功能的菌群,其广泛存在于人体的肠道中。目前已被国内外生物学家所证实,肠内乳酸菌与健康长寿有着非常密切的直接关系。植物乳杆菌是乳酸菌的一种,属于乳杆菌属,有很强的发酵碳水化合物的能力,较耐盐,与其它乳酸菌有协同作用,具有免疫调节、拮抗致病菌、抗突变和防癌等益生性质,其代谢产生的有机酸、过氧化氢、双乙酰、细菌素等物质能够抑制病原菌的生长和粘附,调节宿主肠道、阴道、尿道的微生态平衡、预防和治疗由于微生态失衡而造成的腹泻、感染;植物乳杆菌是厌氧细菌(兼性好氧),能够降低血清胆固醇。在繁殖过程中能产出特有的乳酸杆菌素,乳酸杆菌素是一种生物型的防腐剂。
本发明提供了一株具有高产Y-氨基丁酸(GABA)能力的菌株。一株具有高产Y-氨基丁酸能力的菌株,它为植物乳杆菌(LactcAacillus ρlantarum)NDC 75017,属于乳杆菌属(LactcAacillus),已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏,保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号,保藏编号为 CGMCC NO :5448,保藏日期为2011年11月08日;它为革兰氏阳性菌,呈短杆状、两端呈圆形,长为1. 0 μ m 1. 7 μ m,宽为0. 4 μ m 0. 9 μ m,无芽孢,无鞭毛;在MRS培养基上形成白色的圆形菌落、直径为0. 5 2mm、菌落边缘整齐、细致有光泽、中央有凸起。本发明中一株具有高产Y-氨基丁酸能力的菌株,它为植物乳杆菌 (Lactobacillus ρ lantarum) NDC 75017,该菌株能够利用核糖、半乳糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、甘露醇、α -甲基-D-甘露糖甙、N-乙酰-葡糖胺、苦杏仁甙、熊果甙、七叶灵、柳醇、纤维二糖、麦芽糖、乳糖、蜜二糖、蔗糖、海藻糖、松叁糖、棉子糖、拢牛儿糖、D-阿拉伯糖醇和葡萄糖酸盐发酵产酸;该菌株不能利用甘油、赤癣醇、D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、 L-木糖、阿东醇、β -甲基-D-木糖甙半乳糖、山梨糖、鼠李糖、卫茅醇、肌醇、山梨醇、α -甲基-D-甘露糖甙、菊糖、淀粉、糖原、木糖醇、D-来苏糖、D-塔格糖、D-岩糖、L-岩糖、L-阿拉伯糖醇、2-酮基-葡萄糖酸盐和5-酮基-葡萄糖酸盐发酵产酸;该菌株过氧化氢酶实验呈阴性、明胶液化实验呈阴性、硝酸盐还原实验呈阴性、硫化氢实验呈阴性、吲哚实验呈阴性、 动力实验为不运动;该菌株的最适生长温度为30 35°C,10°C能生长,45°C不生长,生长ρΗ 为4. 5 9. 5,最适合生长ρΗ为5. 8。本发明中一株具有高产Y-氨基丁酸能力的菌株,它为植物乳杆菌 (Lactobacillus ρ lantarum) NDC 75017,经 16S rDNA 序列测序,结果在 NCBI 上进行同源个生比罾,Iiftt NDC 75017 % Lactobacillus ρlantarum JDMU Lactobacillus ρlantarum subsp. plantarum ST-II I、Lactobacillus ρ lantarum WCFSl 的亲缘关系最近,同源性达 99.8%。经IGS(intergenic spacer)序列测序,将IGS测序结果的785个碱基在NCBI 上进行同源性比较,菌株 NDC75017 与 Lactobacillus plantarum WCFSU Lactobacillus plantarum subsp. plantarum ST-III 的亲缘关系最近,同源性达 99. 5%。本发明中一株具有高产Y-氨基丁酸能力的菌株,它为植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)NDC 75017,属于乳杆菌属(Lactobacillus),已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏,保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号, 保藏编号为CGMCC NO :5448,保藏日期为2011年11月08日。本发明中一株具有高产Y-氨基丁酸能力的菌株,它为植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)NDC 75017,该菌具有高产Y -氨基丁酸的能力,经高效液相色谱检测其产量高达138mg/L ; γ -氨基丁酸是一种重要的抑制性神经递质,它参与多种代谢活动,具有很高的生理活性,已报道的生理活性有调节血压、促使精神安定、促进脑部血流、增进脑活力、营养神经细胞、增加生长激素分泌、健肝利肾、预防肥胖、促进乙醇代谢 (醒酒)、改善更年期综合症等多种功效,也可与各种各样的食品组合,制造成各种各样富含Y-氨基丁酸的功能食品。图1为一中植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)NDC 个菌的电镜图;图2为一中植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)NDC 个菌的电镜图;图3为
一中植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)NDC 16SrDNA的系统发育树;图4为
一中植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)NDC IGS的系统发育树。

一本实施方式一株具有高产Y-氨基丁酸能力的菌株,它为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) NDC 75017,属于乳杆菌属(Lactobacillus),已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏,保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号,保藏编号为CGMCC N0:5448,保藏日期为2011年11月08日;它为革兰氏阳性菌, 呈短杆状、两端呈圆形,长为1. 0 μ m 1. 7 μ m,宽为0. 4 μ m 0. 9 μ m,无芽孢,无鞭毛;在 MRS培养基上形成白色的圆形菌落、直径为0. 5 2mm、菌落边缘整齐、细致有光泽、中央有凸起。本实施方式中植物乳杆菌(LactcAacillus plantarum)NDC 75017的最适生长温度为30 35°C,10°C能生长,45°C不生长,生长pH为4. 5 9. 5,最适合生长pH为5. 8。本实施方式一株具有高产Y -氨基丁酸能力的菌株,它从内蒙古传统发酵乳制品中分离得到,筛选方法按以下步骤实现
75017 单 75017 多 75017 的 75017 的
4
一、样品的采集采集样品时双手戴上无菌的一次性乳胶手套,用一次性无菌注射器吸取内蒙古通辽地区牧民家庭中自制的传统酸奶样品,放入事先已经灭菌的器皿中,用记号笔在器皿上标注样品编号并封好放入冰盒内,将冰盒放入含有冰袋的保温箱;测定采集样品的PH值与温度,并记录采集地点到调查采样表中,同时用相机采集样品的图片资料;采集后的样品带回实验室于4°C冰箱中保存备用。二、乳酸菌的分离与纯化用灭菌移液器取ImL酸奶样品,接种于灭菌的生理盐水中,进行梯度稀释;在灭菌培养皿中倒入灭菌、冷却至50°C的含有0. 75% CaCO3的MRS固体培养基,冷却至凝固后,将稀释的样品接入MRS固体培养基中,放入恒温厌氧培养箱,37°C培养48 72h。观察并记录菌落特征。从平板上长出的菌落中挑选出周围形成透明圈的单个菌落,进行革兰氏染色,将 G+菌株继续划线于MRS固体培养基,直至确定为纯菌;将纯化的菌株再进行革兰氏染色并做H2A酶试验,凡革兰氏染色阳性、H2O2酶试验阴性的菌株可初步确定为乳酸菌;三、乳酸菌分离株的保存将纯化菌株接种到MRS斜面培养基中,经培养后置4°C冰箱中保存备用,同时将分离菌株的纯培养物接种于MRS液体培养基中,37°C厌氧培养16h,连续传代培养3次,将培养液与30%灭菌甘油以1 1的比例混合均勻,置于-80°C冰箱冷冻保存;其中所述MRS固体培养基(IOOOmL)由5g的蛋白胨、5g的牛肉膏、5g的酵母粉和 IOg的胰蛋白胨、1. OmL的Tween-80、20g的葡萄糖、各10毫升的5种盐溶液和余量的蒸馏水组成,调PH至5. 8,121°C高压灭菌15min ;其中5种盐溶液:20g K2HPO4 · 3H20+IOOmL蒸馏水,20g柠檬酸氢二铵+IOOmL蒸馏水,50g乙酸钠+IOOmL蒸馏水,5. 8gMgS04 ·7Η20+IOOmL 蒸馏水,2. 5g MnSO4 · H2O+IOOmL 蒸馏水。本实施方式筛选所得菌的电镜图见图1和2。对筛选所得菌进行生理生化试验依据《伯杰氏细菌学鉴定手册》(第八版)和《常见细菌系统鉴定手册》对其进行常规生理生化鉴定,实验结果为该菌株能够利用核糖、半乳糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、甘露醇、α -甲基-D-甘露糖甙、N-乙酰-葡糖胺、苦杏仁甙、熊果甙、七叶灵、柳醇、纤维二糖、麦芽糖、乳糖、蜜二糖、蔗糖、海藻糖、松叁糖、棉子糖、拢牛儿糖、D-阿拉伯糖醇和葡萄糖酸盐发酵产酸;该菌株不能利用甘油、赤癣醇、D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、L-木糖、阿东醇、β -甲基-D-木糖甙半乳糖、山梨糖、鼠李糖、卫茅醇、肌醇、山梨醇、α -甲基-D-甘露糖甙、菊糖、淀粉、糖原、木糖醇、D-来苏糖、D-塔格糖、D-岩糖、L-岩糖、L-阿拉伯糖醇、2-酮基-葡萄糖酸盐和5-酮基-葡萄糖酸盐发酵产酸;该菌株过氧化氢酶实验呈阴性、明胶液化实验呈阴性、硝酸盐还原实验呈阴性、硫化氢实验呈阴性、吲哚实验呈阴性、动力实验为不运动。分子生物学鉴定对筛选所得菌经16S rDNA序列测序,结果在NCBI上进行同源性比较,菌 ^ NDC75017 与 Lactobacillus ρlantarum JDM1> Lactobacillus ρlantarum subsp. ρ lantarum ST-III, Lactobacillus ρ lantarum WCFSl 的亲缘关系最近,同源性达 99. 8%
5(如图3所示)。经IGS(intergenic spacer)序列测序,将IGS测序结果的785个碱基在 NCBI 上进行同源性比较,菌株 NDC 75017 与 Lactobacillus ρlantarum WCFSU Lactobacillus ρ lantarum subsp. plantarum ST-III 的亲缘关系最近,同源性达 99. 5 % (如图4所示)。结合菌株NDC 75017形态学观察、生理生化试验鉴定结果,确定菌株NDC 75017为乳杆菌属(Lactobacillus)的一个新菌株,命名为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)NDC 75017。 本实施方式筛选所得植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)NDC 75017,通过高效液相色谱检测对其进行产Y-氨基丁酸的能力的测试,结果为138mg/L。


一株具有高产γ-氨基丁酸能力的菌株,它涉及具有产γ-氨基丁酸能力的菌株。它为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)NDC 75017,属于乳杆菌属,已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏,保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号,保藏编号为CGMCC NO5448,保藏日期为2011年11月08日。本发明中菌株NDC 75017具有高产γ-氨基丁酸的能力,经高效液相色谱检测其产量高达138mg/L;γ-氨基丁酸是一种重要的抑制性神经递质,具有很高的生理活性,有调节血压、促使精神安定、促进脑部血流、营养神经细胞、增加生长激素分泌、改善更年期综合症等多种功效。



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