专利名称：一种发酵生产γ-氨基丁酸的方法及其发酵培养基的制作方法Y-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid, GABA)属于非蛋白质氨基酸，极易溶于水中，但不溶于醇、醚及苯，分子量103. 12，化学式为NH2 (CH2)3COOH或(C4H9NO2)，属于耐高温型，不易受热破坏。GABA为抑制中枢神经系统的传递物质，具有许多生理功能，例如有降血压功能、增进脑机能代谢作用、增强记忆力、有效抑制焦虑与失眠可达镇静效果，预防帕金森氏症、改善更年期障碍、预防动脉硬化、活化肾机能、促进酒精代谢、防止肥胖等诸多功能 (引用文献3、5和6)。米糠(麸皮)为稻谷碾制后的副产品，一般多废弃或仅作为饲料用途，利用率颇低。米糠虽然仅占谷粒的5-8%，却含有重要的营养成分及生理活性物质，美国农业部研究报告显示，稻米中约64%的营养素都存在米糠中，内含丰富的油脂、植物性活性物质，包括维生素B群、生育酚(a-tocopherol)、生育三烯酚CTocotrienols)、植物甾醇(Phytosterols)、谷维醇(Y-oryzanol)、植酸(Phytic acid)、肌醇六磷酸 Gnositol hexaphosphate)等(引用文献1)。米糠中另含有GABA，但其含量仅约28. lmg/100g。在植物体中GABA的含量很低，必须经过化学合成或生物法处理才得以提高 GABA含量(引用文献7、9和10)。化学合成法是利用邻苯二甲酰亚胺钾(Phthalimide Potassium)和4_氯丁腈(4-Chlorobutyronitrile)在强烈条件下反应，再以浓硫酸(Sulfuric Acid)水解后得到产物，或是利用吡咯烷酮(Pyrrolidone)经氢氧化钙 (Calcium Hydroxide)、碳酸氢铵(Ammonium AcidCarbonate)水解、开环制得 GABA。化学法虽反应较快速、产率高，但是制备过程中除去有毒物质较为复杂，安全性较差且所耗成本较高(引用文献4和8)；生物合成法主要利用酶催化将氨基丁酸前体转换合成，由谷氨酸脱羧酶直接且不可逆的脱去谷氨酸的α -羧基来合成GABA，或者利用GABA转氨酶和琥珀半醛酸脱氢酶将GABA转换为琥珀酸而消耗GABA(引用文献2和8)。另外研究发现，乳酸菌(Lactic acid bacteria)具有谷氨酸脱羧酶的活性，可以通过发酵过程产生GABA ；此夕卜大肠杆菌(Escherichia coli)、红曲霄(Monascus)、米曲菌(Aspergillus oryzae)禾口根霉(lihizopus spp.)亦有生产GABA的功能；然而考虑安全性较高的微生物，多使用具有保健功效的益生菌如乳酸菌来进行发酵，如台湾专利第20081U88号、日本专利特开第 2000-210075号、日本专利第3似6157号、日本专利第2704493号。这些专利的发酵方法有的使用酪蛋白(casein)、消化蛋白质(peptone)等高价成分，若考虑到成本则生产性欠佳； 或有的使用12. 5-18%的盐，对于现今社会低盐饮食的趋势，并不利于推广。引用文献1. Raghuram TC 禾口 Rukminic，Nutritional significance of rice bran oil. (1995)Indian Jouranal of Medical Research. ，102 :241-244.2. Shelp B. J. , Bown A. W.，禾口 Mclean Μ. D. (1999). Metabolism and functions ofgamma-aminobutyric acid. Trends Plant Sci.4 (11) :446-452.3.冈田忠司，2001。GABA富化二 f 胚芽生理机能，36 (6) :7_9。4.林少琴、吴若红、邹开煌、程开，2004。米胚芽中Y-氨基丁酸的分离提取及鉴定。食品科学，25(1) :76-78。5.茅原纮、杉浦友美，2001。近年們GABA生理机能研究(脑机能改善作用、高血压作用全中心(二 ),36(6) 4-6ο6.许建军、江波、许时婴，2003。γ-氨基丁酸(gaba) —种新型的功能食品因子。 食品科技，24(1) :40-42。7.陈怡伶，2003。发芽糙米对糖尿病症患者血糖值及血清胆固醇浓度的影响。静宜大学食品营养所。8.陈海军、林亲彔、李丽辉，2006。食品原料中GABA的富集研究进展。现代食品科技，22(1) :196-198。9.萧凤岐，2004。积极开发GABA食品。中国酿造，12 :22_24。10.白松、林向阳、阮榕生、郑丹丹、刘玉环、何承云，2005。Y-氨基丁酸的分布与制备。现代食品科技。21 (2) :202-205。
鉴于目前生产GABA技术的缺点，因此本发明解决的首要问题是，降低GABA生产中的高成本、高盐分及复杂的制备过程。本发明要解决的另一问题是，提高米糠的GABA的含量，以便提高米糠的利用价值。为解决上述问题，本发明提供一种GABA的生产方法，即发酵处理米糠以生产GABA 的方法，其包括步骤制备培养基将米糠、谷氨酸及奶粉按比例混合，其余以水补足，并调节pH值；将乳酸菌液接种至冷却后的培养基；将均勻混合的乳酸菌液与培养基在30-42°C下发酵4小时以上。经如上方法所得到的米糠发酵产物的GABA含量最高可达2501mg/100g以上，远高于米糠原料的GABA含量lmg/100g)；而本发明最终发酵产物再经过真空冷冻干燥处理，可保留其营养价值，其亦有具保健功能性的膳食纤维、多酚类化合物及肌醇六磷酸等抗癌及抗氧化物质，可以直接作为食品添加物。本发明如上述的GABA生产方法，由于仅使用碾米后副产物的米糠为原料，且培养基中的其它成分及乳酸菌粉亦是为商业所大量应用，故其成本很低。再者，整个步骤中并未使用任何盐分，对于作为成品应用于食品时，亦有低盐分的保证。最后，本发明在原料前处理及整个发酵过程中，其操作简单不繁杂，亦可提高其产率。本发明如上述的GABA生产方法，其中米糠添加比例为培养基总体积的0. 1-15% ； 谷氨酸(glutamic acid)添加比例为培养基总体积的0. 1-0. 5% ；奶粉添加比例为培养基总体积的0. 1-5%。乳酸菌液由嗜热链球菌(Sti^ptococcusthermophilus)和保加利亚乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus)调配而成，乳酸菌液的接种量为培养基总体积的1-5% (ν/ν)；即本发明如上述的GABA生产方法中所应用的培养基包括培养基总体积0. 1-15%的米糠、0. 1-0. 5%的谷氨酸、0. 1-5%的奶粉及的乳酸菌液，其余为水。本发明如上述的GABA生产方法，其中培养基的ρΗ值调节至6. 5，而优选食品级的 PH调节剂如碳酸钾或柠檬酸来进行调节。本发明如上述的GABA生产方法，其中米糠优选为稳定米糠；谷氨酸优选为食品级；奶粉优选为脱脂奶粉。本发明如上述的GABA生产方法，其中为减少发酵产物的营养流失，且保有其中的乳酸菌活性；还可以在发酵完成后进行真空冷冻干燥的步骤。以下以优选的实施例详细说明本发明的进一步技术特征，而非限制本发明的范围。(3)标准品的配制(GABA标准品)精确秤量GABA标准药品0. 05g置于烧杯，用 0. 02N盐酸溶解转并移至50mL定量瓶中再进行定容，则为所需浓度1000mg/L。(4)标准操作液取标准原液1、2、3及4mL于20mL定量瓶，用0. 02N盐酸进行定容，即为 50、100、150 及 200mg/L。(5)测量样品的配制取20 μ L上层澄清液样品与980 μ L 0. 02Ν HCl混合均勻成ImL后，由此再取出 10 μ L混合液于试管中加入70 μ L Vial 1 (AccQ Fluor硼酸盐)缓冲溶液，再加入20 μ L Vial 2Α (将AccQ Fluor衍生试剂粉末加入到ImL的IOmM AccQFluor中)试剂，震荡10秒， 室温静置1分钟，再置于55°C水浴10分钟，水浴后用流水冷却至室温。再将配制的测量样品以0. 20 μ m样品过滤膜过滤至样品瓶，进行HPLC分析。(6) HPLC 分析条件A.层析柱3.9X 150mm Nova-pak C18(Part No. WAT086344，Waters)。B.保护柱Nova-pak C18(Part No. WAT044380，Waters)。C.标准品GABA标准品，购自s i gma。D.流动相比例A液为醋酸钠缓冲溶液(取WAT052890 AccQ Tag洗脱液A IOOmL, 加去离子水定量至IOOOmL)，B液为60%乙腈(取乙腈600mL，加去离子水定量至IOOOmL)。A液与B液的比例
本发明涉及一种发酵生产γ-氨基丁酸的方法，其包括步骤将米糠、谷氨酸及奶粉按比例混合，其余以水补足，以制作培养基；然后，将乳酸菌液接种至冷却后的培养基，并于均匀混合后，在30-42℃下发酵4小时以上。由此方法及其培养基所得到的发酵物的γ-氨基丁酸含量远高于米糠原料，可以直接作为食品添加物。