专利名称：一种拟南芥转录因子在培育抗旱性水稻中的用途的制作方法干旱问题是影响当今世界农业生产与生态环境的主要的逆境因子，对世界粮食生产造成巨大的损失。如何高效地利用有限的淡水资源进行最大限度的农业生产，这是国际和国内生物科学技术迫切需要解决的重大课题之一。水稻是世界农业生产中用水最多的作物，其节水抗旱性对我国乃至全世界的粮食、水、以及生态安全具有重要的意义。培育抗旱品种是利用旱地的一种经济而有效的方法，传统的方法培育耐旱品种受到育种时间和优良性状选育的限制，利用转基因技术提高作物的抗旱能力具有重要的理论与经济意义。随着植物抗旱分子机制研究的不断深入和转基因技术的日趋完善，为培育高效抗旱作物新品种开辟了一条崭新的途径。转基因技术是指将外源基因通过生物、物理或化学手段导入其它生物基因组，以获得外源基因稳定遗传和表达的遗传改良体。基因转化的方法可分为两类一是由载体介导的转化，主要的方法为农杆菌介导法；另ー类是直接的基因转化，包括基因枪法、电击法、PEG法、脂质体转化法和花粉管通道法等。近年来，应用较多的为农杆菌介导法和基因枪法。但是，基困枪法具有价格昂贵、转化效率偏低、导入的外源基因拷贝数高、在后代中容易丢失或基因沉默、对片段大的基因难以导入且嵌合体不易排除等缺点，需要进一歩改进；农杆菌介导法在水稻转基因种基因型依赖性小，可以很大程度上減少上述不足。目前已发表的抗旱相关的基因及其蛋白越来越多，反式转录调节因子包括所有的具有调节基因转录功能的蛋白分子，它们在植物生长发育和抗逆性方面发挥着巨大的作用。利用拟南芥抗旱相关转录因子及转基因技术可以高效的培育出抗旱的高品质水稻等农作物。
为了解决培育耐旱水稻品种受到育种时间和优良性状选育的限制问题，本发明提供一种拟南芥转录因子在培育抗旱性水稻中的用途。本发明的目的是针对高效培育抗旱水稻品种的不足，利用农杆菌介导法转基因技木，提供了分离克隆ー个包含有抗逆转录因子AT5G17460的完整编码区段的DNA片段、编码蛋白、以水稻Actinl为启动子构建的AT5G17460表达载体及宿主，所述宿主为水稻。本发明所述拟南芥转录因子来源于NCBI (http://www. ncbi. nih. gov/)在NCBI中Gene ID:831612，在拟南芥资源中心，其位点为AT5G17460以及序列信息以以下网站为准(http://www. arabidopsis. org/servlets/TairObject id=132381&type=locus),分离克隆所用的DNA模板是cDNA，按照其位点信息AT5G17460，将其简写为A460。本发明从拟南芥的幼苗及根中分离得到ー种包含AT5G17460的DNA片段，通过转化该片段赋予植物干旱等逆境条件下，增强耐受能力。其中，所述AT5G17460是下列核苷酸序列之一 1)序列表SEQID NO. I中第929-1858位所示DNA序列，或与SEQ ID NO. I中第929-1858位所示的高度同源DNA序列； 2)其它能编码与序列表SEQID NO. 2中的蛋白质相同的DNA序列； 3)其功能相当于SEQID NO. I中第929-1858位所示DNA序列或与SEQ ID NO. I中第929-1858位所示的高度同源DNA序列所包含的亚片段。可以采用已经克隆的AT5G17460作为探针，从cDNA或基因组文库中筛选得到本发明的基因或同源基因，也可以采用PCR(Ploymerase Chain Reaction)技术，从基因组DNA、mRNA和cDNA中扩增得到本发明的AT5G17460基因以及任何感兴趣的一段DNA或其同源的一段 DNA。采用上述技术，可以分离得到包含AT5G17460的序列，将这ー序列与任何ー种可以引导外源基因在植物中表达的表达载体植株，可获得抗旱、抗盐及耐高盐胁迫的耐受性增强的转基因植株，本发明的基因在构建到植物表达载体中时，在其转录起始核苷酸前加上任何ー种强启动子或诱导型启动子，也可以使用增强子区域是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等的增强子，且与编码序列阅读框相同，以确保整个序列的翻译。本发明基因是受逆境诱导表达的，因此可将本发明的基因与任何感兴趣的逆境诱导启动子结合后连入合适的表达载体，转化植物宿主，在逆境条件下可诱导表达基因，提高植物在逆境条件下(干早)的存活率和生长速度。下面结合附图及具体实施例对本发明做进ー步详细说明。

序列表SEQ ID NO. I显示的是本发明分离克隆的包含有AT5G17460编码区和启动子区得DNA片段序列。序列表SEQ ID NO. 2显示的是本发明AT5G17460编码的蛋白质序列。图I为AT5G17460基因的PCR扩增与克隆 从拟南芥种荚中扩出AT5G17460，很浅的帯，经大量扩增后再回收克隆的，经反转录后获得cDNA，再用Pfu高保真Taq酶以这些cDNA为模板进行PCR扩增。图中M代表Marker，扩增出来的条带为8个阳性克隆，没有条带的为阴性克隆。图2为AT5G17460基因阳性克隆的筛选 将扩增出的目的片段用低熔点胶回收后，用平端连接的方法连到中间载体中。该载体中有ー个Sma I酶切位点，两端分别是AttLl和AttL2，用于重组克隆用的序列。先将载体用Sma I酶切开，形成平端，然后用碱性磷酸酶CIP进行去磷酸化处理防止自连接产生阴性克隆。由于高保真酶不能产生带有磷酸的末端，用T4 Polynucleotide Kinase在PCR产物末端加磷酸。将该片段纯化后，放到一起用T4连接酶连接，转入大肠杆菌，筛选阳性克隆。图2是AT5G17460的PCR扩增的筛选图，7个扩增出来的条带均为阳性克隆，所用引物为 A4600FP 和 A4600RP。图3为转基因所用的pCAB水稻表达载体图。图4为转基因水稻AT5G17460基因逆境胁迫诱导的荧光定量表达 转基因水稻植株分别在干旱(失水)、冷胁迫(2°C)、200mM NaCl胁迫及ΙΟΟμΜ脱落酸(ABA)中诱导后提取叶中RNA并反转录后，采用SYBR Green I染料进行荧光定量PCR分析目的基因表达情况。图5为转基因水稻的过量表达图；图中5、13、14、19号为过量表达植株。图6为T2代转基因株系的干旱胁迫表型图。图7为T2代转基因株系的干旱胁迫下的存活率 干旱胁迫下，T2代过表达转基因株系存活率比WT 植株高约50% (WT，11. 3% ；0ΕΧ-5,54. 9% ；0EX-13,75. 8% ；0ΕΧ-19,68. 2%)。图8为T1代转基因株系的干旱胁迫下的表型图。图9为T1代转基因株系的干旱胁迫下失水率 干旱胁迫下，T1代转基因植株失水率WT植株低。图10为T1代转基因株系的干旱胁迫下绿叶百分比 干旱胁迫下，T1代转基因植株绿叶百分比比WT的高出约40% (WT，23. 1% ；ACT:LWTl-6,67. 8% ；ACT:LWT1-102,65. 8% ；ACT:LWTl-78,57. 3%)。图11为甘露醇胁迫下过量表达转基因株系的表型图。图12为甘露醇胁迫下过量表达转基因株系相对茎长 IOOmM甘露醇胁迫下，过量表达转基因株系相对茎长比WT长2cm左右，200mM甘露醇胁迫下，过量表达转基因株系相对茎长比WT长Icm左右。
具体实施例以下实施例定义了本发明，并描述了分离和克隆包含有AT5G17460编码区和启动子区得到DNA片段序列，水稻表达载体的构建以及验证AT5G17460基因功能的验证方法。根据以下的描述及具体实施方法，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并在不偏离本分明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其使用于合适的物种及用途。实施例一、水稻愈伤组织诱导
O将水稻七八分成熟的种子去壳，仔细剔除有霉点籽粒，取饱满清亮籽粒先用70%乙醇浸泡(表面消毒)1-1. 5min，再用含2%的活性氯含量的NaClO溶液(加1_3滴TWeen20)，放入摇床120rpm摇45min,接着用无菌蒸懼水漂洗处理过的种子4_5次；
2)将灭菌后的种子放在30mL含有2.Omg/L 2，4_D的NBtl固体愈伤组织诱导培养基的表面(培养基成分见后);
3)将平皿用封ロ膜包好放有种子和培养基的平皿后，25±1°C暗培养；
4)暗培养10天左右，诱导出初生愈伤组织，将其剥离，再在相同的新鮮愈伤组织诱导培养基中继代培养1-2次，直到得到生长旺盛的浅黄色易碎的胚形成的愈伤组织。将上述未成熟胚诱导的愈伤组织用干与农杆菌的共培养转化。实施例ニ、分离及克隆AT5G17460
本发明所设计的序列来源于NCBI (http://www. ncbi. nih. gov/)在NCBI中Gene ID:831612，在拟南芥资源中心，其位点(AT5G17460)及序列信息以以下网站为准(http://www. arabidopsis. org/servlets/TairObject id=132381&type=locus),所用的模板是拟南芥的幼苗及根的cDNA，按照其位点信息AT5G17460，将其简写为A460 ;在进行PCR时，在50 μ L体系中加入IOng的拟南芥种子的cDNA作为为模板，上述引物各20 pmole进行反应。反应条件为94°C(I min)预变性；然后进行 94°C (30 sec)、58°C (30 sec)、72°C(I min)共35个循环；最后72°C延伸10 min,所用Taq酶为高保真的PfuTaq酶。所用引物为 A460FP AGGATGTTCGCGCGAAGACTCTCCTC,A460RP GAGCTTTTACCGCTTCTTCGCTTTCC 将扩增出的目的片段，用平端连接的方法连到中间载体PDGOl中。该中间载体是构建的ー个载体pDGOl，在pDGOl载体中有一个酶切位点(Sma I为平端酶)，两端分别是AttLl和AttL2，可用于通过Gateway系统的方法重组克隆到终载体中；将pDGOl载体用Sma I酶切开，形成平端，然后用NEB公司的小牛肠碱性磷酸酶CIP进行去磷酸化处理防止自连接产生假阳性克隆。方法是用Sma I酶切pDGOl质粒后，在反应体系中加入WL NEB的小牛肠碱性磷酸酶CIP，37°C下温浴I小时，用低熔点胶回收后备用;用丁4 Polynucleotide Kinase在PCR产物末端加磷酸=PCR产物用こ醇沉淀后，经70%こ醇洗盐后加入ddH20溶解，加入I倍反应Buffer、dATP和T4 Polynucleotide Kinase后在37°C下温浴I小时，用低熔点胶回收后备
用；将去磷酸的Sma I酶切过的pDGOl载体和加磷酸的pfu酶扩增的片段放到一起,并用T4连接酶连接，转入大肠杆菌，筛选阳性克隆获得PDGA460。经测序鉴定正确(序列表SEQ IDNO. I )，再进行下面实验。实施例三、水稻表达载体的构建及其遗传转化
得到中间质粒后，通过ー个重组的LR反应，再经PCR筛选后克隆到水稻表达载体pCAB中，该水稻载体所用的启动子为水稻的Actinl启动子。在细菌中是卡那霉素抗性，在水稻中是抗除草剂PPT即Bar抗性。具体方法如下在反应体系中加入75 ng左右pCAB载体质粒 DNA, 150ng 左右 pDGA460 中间载体质粒 DNA, I μ L invitrogen LR Clonase II,并加入TE Buffer, pH 8. O补足至5 μ 1，在25で反应I小时。反应产物用热激法转入大肠杆菌感受态细胞，通过筛选获得阳性克隆PCBA460。通过农杆菌介导的水稻遗传转化方法将上述载体pCBA460导入到水稻品种皖粳97 (由安徽省农业科学院提供)中，经愈伤组织诱导、侵染、共培养、筛选具有Bar抗性的愈伤，再分化、生根、壮苗、移栽得到转基因植株，具体方法见下面步骤。实施例四、农杆菌的培养及其与水稻愈伤组织的共培养
O挑取活化含有目的基因的单个农杆菌(AGL1)菌落，在28°C于4mL含相应抗生素(卡那霉素，50mg/mL)的LB培养基中震荡过夜，第2天按1/100 (V/V)接种量在LB液体培养基中培养，直到OD6tltl约为0. 6-0. 8 ；
2)离心回收新鲜培养的农杆菌，并重悬于约1/2-1/3体积的AAM液体培养基(加1%的100 400Mmol/l 的 As)中，至 OD6tltl 约为 0. 8-1. O ；
3)将愈伤组织切下，立即投入含农杆菌的AAM重悬液中，浸泡15-20分钟。并不时摇动；可将浸泡在农杆菌液体中的愈伤组织在真空抽滤5分钟左右；
4)将感染后的愈伤组织置于无菌滤纸上吸干多余的菌液，转入共培养基上，25±1°C暗培养2. 5-3. O天。实施例五、抗性愈伤组织的筛选及其再生
O经共培养后的愈伤组织，切去胚芽等，置无菌滤纸上吸干农杆菌菌液；
2)转入筛选培养基上于25± I °C暗培养条件下筛选培养2周；
3)新鲜长出的抗性愈伤组织或不遏化的愈伤组织转入筛选培养基上，继续筛选培养2次，每次2周；
4)将抗性愈伤组织转入分化培养基上处理2周，其中先在暗条件下培养7天，然后转入光条件下培养7天；
5)经预分化上的愈伤组织转入分化培养基上分化再生，在光下培养(光照12h/d)，约I个月左右；
6)再生的小苗在1/2MS培养基上生根壮苗，约I个月左右；移入大田种植。 上述培养基组分及其配方
(1)试剂和溶液縮写本发明中培养基所用到的植物激素及抗生素的縮写表示如下
6-BA (6-BenzyIaminoPurine, 6-节氨基腺嘌呤)
Kan (Kanamycin,卡那霉素)
Amp (Ampicillin,氨节青霉素)
KT (Kinetin,激动素)
NAA (Napthalene acetic acid,蔡こ酸)
IAA (Indole-3-acetic acid, Π引哚こ酸)
2 , 4-D (2 , 4-Dichlorophenoxyacetic acid, 2, 4 ニ氯苯氧こ酸)
AS (Acetosringone,こ酸丁香酮)
CH (CaseinEnzymatic Hydrolysate ,水解酪蛋白)
Bar (Bialaphos,除草剂)
DMSO (Dimethyl Sulfoxide, ニ 甲基亚讽)
(2)基本培养基
LB 10g/L 蛋白胨、5g/L 酵母粉、10g/L NaCl、pH7.0
N6 N6大量元素、N6微量元素、N6有机成分
NB。 N6大量元素、B5微量元素(B5-M1、B5-M2)和B5有机成分
MS MS大量元素、MS微量元素和MS有机成分
AAM AA大量元素和微量元素、MS有机成分
(3)农杆菌介导转化水稻所用培养基
愈伤诱导培养基=NBtl培养基、300mg/L水解酪蛋白、500mg/L脯氨酸、30g/L蔗糖、2. 5g/L 植物凝胶、2. O mg/L 2，4_D、pH5. 8
侵染培养基:AAM培养基、500mg/L水解酪蛋白、68. 5 g/L蔗糖、36 g/L葡萄糖、100Mmol/L こ酰丁香酮、pH5. 2
共培养培养基=N6培养基、lg/L水解酪蛋白、30g/L蔗糖、10g/L葡萄糖、2. 5g/L植物凝月交、2. O mg/L 2，4-D、ρΗ5· 8
抗性愈伤筛选培养基=NBtl培养基、300mg/L水解酪蛋白、500mg/L脯氨酸、30g/L蔗糖、
2.5g/L 植物凝胶、2. O mg/L 2，4_D、250mg/L Cef、200mg/L Amp、4mg/L Bar、pH5.8
组织分化培养基=NBtl培养基、300mg/L水解酪蛋白、500mg/L脯氨酸、30g/L蔗糖、2. 5g/L 植物凝胶、2. O mg/L 2, 4-D,2. Omg/L 6-BAU. Omg/L IAAU. Omg/L NAAU. Omg/L KT、4mg/L Bar,PH5. 8
壮苗培养基1/2MS培养基、30g/L蔗糖、2. 5g/L植物凝胶、4mg/L Bar、PH5. 8。实施例六、转基因水稻的DNA分子水平及转录水平的鉴定取抗性植株幼嫩叶片，小量叶片用CTAB法提取DNA，并用引物A460FP及A460RP进行PCR扩增鉴定，如图2所示，在IKb左右附近有条带的均为阳性植株；用Trizol法提取阳性转基因植株的RNA，使用反转录试剂盒对RNA进行反转录合成第一链cDNA，并使用同样的引物在转录水平上进行过量表达鉴定，见图5。实施例七、AT5G17460转基因过量表达T1代及T2代在干旱胁迫下的生长状况
本发明选取了 3个AT5G17460基因过量表达的T1代及T2代转基因株系实验。具体步骤如下将过量表达的转基因株系T1代种子与野生型対照的种子去壳消毒后的种子播种到1/2MS培养基上，2-3天后挑选发芽好且长势 一致的种子转移到新的1/2MS培养基上，在光照培养室生长10天后，将幼苗移入装有泥土的方形托盘中，试验用的泥土为水稻田中直接取用的泥土，等幼苗生长至减数分裂期后，对植株进行断水干旱胁迫7天，然后浇水恢复9天，拍照并调查植株的存活率。试验表明，本实施例与野生型对照相比，AT5G17460过量表达转基因T1代株系表现为干旱耐受，见图8、图9、图10 ;为了进一步验证AT5G17460过量表达转基因株系的干旱耐受功能，接下来选用AT5G17460基因过量表达转基因T2代株系做了进ー步的干旱实验验证，将过量表达的转基因株系T2代种子与野生型対照的种子去壳消毒后的种子播种到1/2MS培养基上，2-3天后挑选发芽好且长势一致的种子转移到新的1/2MS培养基上，在光照培养室生长10天后，将幼苗移入装有泥土圆形小花盆中，试验用的泥土为水稻田中直接取用的泥土，等幼苗生长至4叶期时，对植株进行断水干旱胁迫5-7天，然后浇水恢复5-7天，拍照并调查植株的存活率。试验表明，本实施例与野生型对照相比，AT5G17460基因过量表达转基因T2代株系也表现为干旱耐受；以上实验表明，本实例与野生型对照相比，表现出干旱耐受表型，见图6、图7。实施例八、甘露醇胁迫实验
本发明选取了 3个AT5G17460基因过量表达的1转基因株系进行了甘露醇胁迫实验。具体步骤如下将过量表达转基因株系种子去壳消毒后，分别与野生型对照同时播种到100mmol/L、200 mmol/L的甘露醇1/2MS培养基上，在光照培养室生长14天后观察表型和测量植株的株高及鲜重。每个家系的每种处理不少于20棵植株，实验设置3次重复。结果表明AT5G17460过量表达的转基因植株的生长在正常条件下与野生型对照无明显差异，但在逆境胁迫处理后生长要显著优于野生型对照，说明本发明的AT5G17460基因的表达可以缓解甘露醇胁迫造成的植株生长发育受阻，增强了转基因植物对非生物逆境的抗性，见图
11、图 12。序列表I SEQ ID No. I
(Nucleotide Sequence, Sequence Length (bp) :2251)
ggaaacaaga aagauauuaa aaaaacucau augauucguc ucuauaaaag auccaacucu60
cacaaaucaa acaaaucaca uuuccacucu ccuugaaucu gauuucucca caaaaaaacu 120 acaucgauca ucgauaauag aucguacuac aauacuauau ucucaaaacg augguguuuc 180 cggcgugugu acagugcgga acaagacaaa accccugucg gugcaaagug guuggaccaa 240 cuuuaggguu cguggcuuuu cugauaaccg gaaucaucga guggccaguu ggugcggugg 300 uguauaucuu uaaacacgcc aagggucguc guauaauggg ucauccggcc agaaaaguuu 360 aucccaaagu cucucgaucu auucccauuu gacuuucuug ucauuaauua uaaucaugcu 420 uuguauuugc uugacaaaua augauuccac uuuuuagaua uaugugauca cauaagguau 480


本发明涉及一种拟南芥转录因子在培育抗旱性水稻中的用途，拟南芥转录因子AT5G17460的核苷酸序列为SEQIDNO.1所示；其编码的蛋白序列为SEQIDNo.2所示；符合下列条件之一1)序列表SEQIDNO.1中第929-1858位所示DNA序列，或与SEQIDNO.1中第929-1858位所示的高度同源DNA序列；2)其它能编码与序列表SEQIDNO.2中的蛋白质相同的DNA序列；3)其功能相当于SEQIDNO.1中第929-1858位所示DNA序列或与SEQIDNO.1中第929-1858位所示的高度同源DNA序列所包含的亚片段，在培育抗旱性水稻中的应用。通过农杆菌介导的水稻遗传转化方法将载体pCBA460导入到水稻品种中，经愈伤组织诱导、侵染、共培养、筛选具有Bar抗性的愈伤，再分化、生根、壮苗、移栽得到转基因植株。