专利名称:拟南芥人工miRNA基因干涉载体快速构建方法现有的方法构建拟南芥基因沉默载体以Overlapping PCR为核心,通过PCR替换拟南芥miR319a的方法构建拟南芥基因沉默载体(Sctwab et al.,2006)。现有方法针对单个沉默载体构建需采用四条带有沉默相关序列的PCR引物,和两条公共引物配合,对 PRS300载体进行扩增,对扩增获得的3段DNA片段进行回收,再进行融合PCR,连入T载体, 酶切后再连入转化载体,最终获得转基因用的沉默载体。方法具体分为四个步骤第一步,通过针对每个不同的基因干涉设计合成4条长度为40bp的引物,合成两条公共的引物组合,用于扩增基因特异的沉默相关DNA片段;第二步,通过4条基因特异的沉默引物和两条公共引物祝贺,分别扩增获得三段长度为271bp,173bp, 299bp的DNA片段,通过电泳分离DNA片段,切割含目标大小DNA的凝胶,进行DNA片段回收;第三步,将回收得到的三段PCR产物混合,再用两条公共进行融合PCR,获得长度为6%bp的DNA片段,通过电泳分离DNA片段,切割含目标大小DNA的凝胶,进行DNA片段回收;第四步,将回收后的695bp片段连接到T载体或其他中间载体,通过连接、转化获得携带有相应载体的大肠杆菌菌落,扩增菌体后,抽取带有沉默片段的中间载体,再采用限制性内切酶进行酶切,获得有粘性末端的DNA片段,再和目标载体进行连接,通过连接、转化获得携带有转化载体的大肠杆菌菌落,测序检测正确后,用于农杆菌转化。现有方法构建载体需要四个大的步骤,且每个步骤操作的内容又相当繁琐,需要实验人员具有一定的分子生物学操作基础。本专利涉及的方法只需要两个步骤,并且每个步骤操作也非常简单,具有简单分子生物学基础的实验人员也能快速,准确的完成载体构建任务。
本发明要解决上述现有技术的缺点,提供一种拟南芥人工miRNA基因干涉载体快速构建方法,尤其涉及拟南芥快速沉默载体改造用DNA序列和该DNA序列的合成以及采用该DNA序列用于建立高效的拟南芥人工miRNA基因干涉载体。为了解决上述的存在的技术缺陷,本发明的第一个目的是提供拟南芥快速沉默载体改造用DNA序列及其合成方法,本发明的第二个目的是提供用于高效构建拟南芥基因沉默载体的载体及其制备方法,本发明的第三个目的是提供拟南芥基因沉默载体及其制备方法。本发明简化了单个沉默载体构建的方法,加速了构建过程,提高了载体构建的效率。为了实现上述的第一个目的,本发明采用了以下的技术方案 拟南芥快速沉默载体改造用DNA序列,该DNA序列如SEQ ID NO 1所示,SEQ ID NO 1所述如下caaacacacgctcggacgcatattacacatgttcatacacttaatactcgctgttttgaattgatgttt tAGGCCTagcgcTACGTAtccaattttcttgattaatctttcctgcacaaaaacatgcttgatccactaagtgacat atatgctgccttcgtatatatagttctggtaaaattaacattttgggtttatctttatttaaggcatcgccatg其中,AGGCCT部分为MuI酶切位点,TACGTA为SnaBI酶切位点。上述的拟南芥快速沉默载体改造用DNA拼接方法合成,该方法采用拟南芥 miR319a基因沉默序列作为基础,如SEQ ID NO :2所示,将此拟南芥序列分成首片段、尾片段和核心沉默片段(如图2所示),通过连接融合首片段、接头片段和尾片段,然后用于快速基因沉默载体改造。SEQ ID NO 2 所述如下caaacacacgctcggacgcatattacacatgttcatacacttaatactcgctgttttgaattgatgttt taggaatatatatgtagagagagcttccttgagtccattcacaggtcgtgatatgattaattagcttccgactcatt catccaaataccgagtcgccaaaattcaaactagactcgttaaatgaatgaatgatgcggtagacaaattggatcat tgattctctttgattggactgaagggagctccctctctcttttgtatccaattttcttgattaatctttcctgcaca aaaacatgcttgatccactaagtgacatatatgctgccttcgtatatatagttctggtaaaattaacattttgggtt tatctttatttaaggcatcgccatg tagg ; 首片段如SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 5所述如下caaacacacgctcggacgcatattacacatgttcatacacttaatactcgctgttttgaattgatgttt尾片段,SEQ ID NO 6 SEQ ID NO 6所述如下
gtatccaattttcttgattaatctttcctgcacaaaaacatgcttgatccactaagtgacatatatgct gccttcgtatatatagttctggtaaaattaacattttgggtttatctttatttaaggcatcgccatg ;接头片段,SEQ ID NO 7所述如下cctagcgctac通过序列分析和设计,使得其中首片段由AGG位点结尾,而干涉尾片段由GTA位起始。这样首片段、连接片段和尾片段拼接获正好获得一个包含MuI酶切位点和SnaBI酶切位点的沉默载体改造用DNA序列,同时首片段的前端和尾片段的尾端包含了酶切位点及相应的保护碱基,用以酶切并连接改造的目标载体。作为优选,上述的拟南芥快速沉默载体改造用DNA序列的合成方法,包括以下的步骤①引物合成合成8条引物,序列如下
本发明涉及一种拟南芥人工miRNA基因干涉载体快速构建方法,完成拟南芥沉默载体构建,主要是针对不同基因修改沉默片段,其他部分都是相同的,扩展了目标载体上不变的DNA区间,将沉默相关片段两端的不变区域事先放入转基因目标载体,再将核心沉默片段连入改造后的载体,直接完成载体构建。在首、尾片段选择时,分析了DNA序列,使得首尾片段通过桥接片段相连后可获得一个StuI酶切位点和一个SnaBI酶切位点,转化大肠杆菌后,可大量制备该载体并用StuI和SnaBI酶内切酶对其进行线性化,直接连接采用本专利方法合成的核心沉默片段,完成拟南芥沉默载体的构建。本发明有益的效果简便易行,操作方便,效益高,能够极大缩短实验时间,降低单个沉默载体的改造成本。
拟南芥人工miRNA基因干涉载体快速构建方法
- 专利详情
- 全文pdf
- 权力要求
- 说明书
- 法律状态
查看更多专利详情
下载专利文献
下载专利
同类推荐
-
王学路王学路
您可能感兴趣的专利
-
张汉周黄健, 肖华胜安德里亚斯·察赫尔
专利相关信息
-
保罗·大卫·加文保罗·大卫·加文保罗·大卫·加文入山俊介卢中明