专利名称：拟南芥At4g31910基因在改良水稻株型性状方面的应用的制作方法我国是农业大国，水稻是我国主要的粮食作物。因此提高水稻的产量，是全世界科学家努力奋斗的目标。提高水稻的产量可以通过多方面手段，包括通过转基因手段等来实现水稻经济性状的改良。水稻的转基因是根据已知的功能基因与表型性状的关系，采用组成型表达载体或组织专一性表达载体将目的基因导入目标植物，以期获得作物特定经济性状或抗逆性状优良的转基因材料。在不影响水稻育性和单株产量的基础上，植株的矮化能够使水稻更抗倒伏，从而增加单位面积上的水稻产量。油菜素留醇(BrassinosteiOid，简称BR)是植物的第六大激素，在花粉、种子和幼嫩组织中含量丰富，它调控了植物生长发育的许多过程，包括叶的发育，茎的伸长，木质部的分化，雄性育性，衰老以及对生物和非生物胁迫的抗性[Yang，CJ., Zhang, C.，Lu, YN, and Wang XL(2011)，The mechanisms of Brassinosteroid’ s Action: FromSignal Transduction to Plant Development. Molecular Plant, 4(4)， 588-600.][Shimada, Y. , Goda, H. , Nakamura, A. , Takatsuto, S. , Fujioka, S. andYoshida, S. (2003) Organ-specific Expression of brassinosteroid-biosyntheticgenes and distribution of endogenous brassinosteroids in Arabidopsis. PlantPhysiology, 131，287-297.]。在拟南芥中，乙酰辅酶A依赖的酰基转移酶At4g31910在拟南芥中过表达后，会使植株变矮小，类似BR含量减少和信号减弱的突变体。因此，寻求将矮化基因的基因转到了水稻当中，以期望改良水稻株型性状可以提高水稻的产量。
本发明目的在于提供拟南芥At4g31910基因在改良水稻株型性状方面的应用。本发明内容为采用水稻日本晴为转基因受体，用带有拟南芥基因At4g31910的载体pCAMBIA1306，构建At4g31910基因的过表达转基因植株。本发明中，带有基因At4g31910的载体pCAMBIA1306，是将拟南芥At4g31910的基因插入到PCAMBIA1306载体35S组成型启动子下游的KpnI和BamHI酶切位点之间而获得。本发明中，拟南芥基因At4g31910的克隆通过PCR以拟南芥的cDNA为模板将其扩增而获得。本发明中，拟南芥基因At4g31910的cDNA序列如SEQ. ID. NO. I所述。本发明中，拟南芥基因At4g31910的蛋白序列如SEQ. ID. NO. 2所述。本发明包括 I)拟南芥 似O表达载体的构建采用pCAMBIA1306为表达载体，将拟南芥基因 似O基因插入到pCAMBIA1306载体35S组成型启动子下游的KpnI和BamHI酶切位点之间(图I)。拟南芥编码酰基转移酶的基因余J7刃O 全长 cDNA,见 SEQ. ID. NO. I。2)带有基因的载体pCAMBIA1306转化水稻试验与结果 利用日本晴为转基因受体。将水稻种子去壳消毒后接种在脱分化植物组织培养基上诱导愈伤组织。在愈伤组织诱导2-4周后，采用侵染的方法，将含有J t4g31910基因的重组质粒导入日本晴愈伤组织细胞。在添加50mg/L潮霉素的MS培养基上连续培养3-4周摘选抗性细胞系，然后将筛选的细胞系转移到分化培养基诱导长芽和生根。最终筛选出独立的转化株系。 本发明中，用于转化水稻的A包 沒切基因序列(SEQ. ID. NO. I)及翻译的蛋白(SEQ.ID. NO. 2)，使用的PCR引物为: 4g31910-F(KpnI) lAAGGATCCCTTATACAATATGCCCATGTTAAATG 4g31910-R(BamHI) |aAGGATCCGCAATCAAGGAAATGATTTGAAAAGC 本发明利用拟南芥基因命沿似O的编码序列构建了组成型表达载体转化水稻日本晴，获得了比对照株型矮小的水稻转基因材料，改良了水稻的株型形状，提高了水稻的抗倒伏性，从而可以达到增加单位面积上的水稻产量的益处。

图I为pCAMBIA1306的多克隆位点示意图。图2为转基因Tl代8个转化子以及转空载苗中A余似O基因的表达量示意图，其中，Ni代表日本晴，1306-1和1306-2代表转空载的2个株系，Tl-I到T1-8为8个转A t4g31910基因的转化株系。图3为成苗的表型示意图，左为转1306空载的转基因植株，右为转A似O基因的植株。图4为转基因T2代2个株系不同植株以及转空载植株中A余似O基因的表达量示意图，其中，1306-1和1306-2代表T2代空转的2个株系，T2和T6是T2 WiAt4g31910基因株系中的第2和第6个株系，其中每个株系选择3棵苗，分表用1，2，3表示。图5为转基因T2代2个株系不同植株对比转空载苗中的BR标记基因的表达量变化示意图。

转基因载体的构建
先通过PCR以拟南芥Col-O的cDNA为模板扩增带有酶切位点的目标片段的cDNA序列，采用pCAMBIA1306为表达载体，将拟南芥基因插入到pCAMBIA1306载体35S组成型启动子下游KpnI和BamHI之间(图I)。
水稻转基因流程
I.诱导剥去种子的外、内颖，选成熟饱满的种子，装入50ml的离心管。无菌水30ml清洗4 5次，70%乙醇浸泡2 min，无菌水清洗3次，再用无菌水清洗4 5次，O. 15% HgCl2UOOrpm、15 20 min。在无菌超净台打开,倒出HgCl2,用无菌水清洗4 5次,倒在灭菌的平板和滤纸上吸干，约Ih左右。将之置入N6D固体培养基上(10粒/25 ml/瓶)，种胚朝上或接触培养基，28 0C，暗培养25 30d。2.继代
观察诱导的愈伤，一般长得能自行脱落的样子就可以剥下来进行继代培养。除去胚乳、胚芽，将愈伤转入新的N6D，培养7 10天。如果剥下的愈伤比较大，可以在这一步用镊子将之弄小。(I)前培养(PH=5. 6)将继代的愈伤重新转依次培养基即可，也应保证培养基吹干和愈伤干燥。一般3 4天就可以进行感染。(2)农杆菌的培养将适量农杆菌(100 μ I左右)涂布接种在LB固体培养·基上，ΕΗΑ105和LBA4404暗培养36 h即可。(3)感染和共培养
①悬浮取灭菌小勺刮取农杆菌，用勺背面将菌体贴在管壁轻轻拍散，0D_=0. 8 I. O。(一般刮5 6勺菌即可，也就是透过菌液隐约可见离心管刻度，浓度不能太大，否则就要稀释)。②感染将前培养的愈伤在无菌滤纸上晾一下，然后集中至一个平皿一次性转入菌液中，轻轻转动离心管使菌液均匀分布，静置时间约15 20 min(根据浓度不同调整，浓度大，时间就相对短)。③共培养将菌液倒出，愈伤在无菌滤纸上放约I. 5 h,保证菌液吸干，接至1/2N6D AS中，20°C、暗培养2 3天，看到愈伤与培养基接触部分有菌膜，就可以除菌了。共培养过程中不要经常开培养箱，以免温度变化太大，产生水膜。3.农杆菌的去除
将共培养的愈伤装入50 ml的离心管，用无菌水清洗3次以上，至液体比较清亮。倒出无菌水，N6D+Cn500 mg/L (或 AP500ml/L)，100 rpm, 15-20 min, 2-3 次。将愈伤倒在无菌滤纸上吸干2h左右，视情况而定。将干燥的愈伤转入N6D-AS中，不加Hn,加Cn250 mg/L,28°C，暗培养7 IOd。4.愈伤组织的筛选
挑出没被农杆菌污染的愈伤，第一次加Cn250 mg/L和Hn (50 mg/L), 15 20d。如果在这次筛选中，仍有愈伤被污染，挑出好的转平板筛选一次。第二次同上，不加Cn，加Hn，把所有的愈伤全部再转一次，15 20d。第三次选出新的愈伤，用Hn筛选，15 20d。次数部用一定按上述安排，但应保证愈伤在Hn上筛选的时间至少45 d以上，第三次挑出的新长出的愈伤最好筛选20 do5.分化
将第四次筛选的全部愈伤组织移入MS中，Hn 50 mg/L，暗培养，预分化(PH 5. 9) 12 15d。选出长势好的新鲜的愈伤(淡黄色)，移入MS (PH 6.0)中，光培养15 20 d，可看到有绿芽长出，一般15 d换一次培养基。如果愈伤分化比较好，培养基看上去也比较清新，可以不换。选长出Icm以上的绿芽，剥去周围多余的愈伤，剪去根(可留约O. 5cm长)移入试管中，1/2 MS生根培养。6.转化株系的检测
将筛选后存活的转化子通过实时定量PCR来检测候选的转化子，获得8个过表达At4g31910的转化株系。经实时定量PCR分析内源 刃O在对照日本晴以及转入pCAMBIA1306空载的苗和转入 似O基因植株中的表达量
用实时定量PCR检测发苗14天的转基因Tl代Ai At4g31910基因的表达情况，以日本晴和转空载体植株为对照，用Actin作为内参(图2)。发现 似O在转基因植株内高水平表达，上调倍数从几百到上千倍不等。·At4g31910转基因水稻Tl代表现出对照转空载植株的株型发生明显变化。转At4g31910基因的水稻表现出整体植株比空载苗的株高矮(图3)。7、T2代BR标记基因水平的检测
T2代苗通过实时定量PCR来检测BR标记基因DWARF，D2,和DWF4的表达量。选取了其中两个生长表型不同于对照的两个转基因株系，每个株系选了 3棵植株，对BR信号输出的标记基因进行转录水平的检测。首先检测了这6株植物中命沿似O的含量(图4)。进一步发现BR合成酶基因/ 和的表达在T2代转基因植物中上调(图5)，表明在这些株系中BR信号的输出减弱了，从而引起了植株的矮化。


本发明属于转基因技术领域，涉及拟南芥At4g31910基因在改良水稻株型性状方面的应用。具体为采用水稻日本晴为转基因受体，用带有拟南芥基因At4g31910的载体pCAMBIA1306，构建At4g31910基因的过表达转基因植株，本发明可以用基因At4g31910的过量表达使BR信号输出减弱，以改良水稻的株型，使其矮化，更易抗倒伏。