拟南芥jav1蛋白及其编码基因在调控植物抗病和抗虫性中的应用的制作方法[0002]植物在进化过程中会形成对害虫或病原菌危害所产生的一定程度的避害、耐害或抗生的生态适应性。根据植物抗性研究开展的植物抗性基因工程是利用分子遗传学原理，鉴定和分离抗性基因，并将抗性基因导入受体，获得抗性稳定表达并遗传的再生个体的生物技术。抗性基因多来自于天然的抗逆性生物，或是植物在逆境中产生的起保护作用的基因。将这些基因转移到抗性差的品种中，就可以提高抗逆性。该技术多以过表达外源抗性基因为主，不同物种之间的差异可能会影响抗性效果。拟南芥(Arabidopsis thaliana)隶属被子植物门双子叶植物纲十字花科，是现代国际和国内进行植株生物学研究的模式植物。拟南芥作为研究的模式植物得益于几个特点:基因组小，仅有5条染色体，约24000个基因；植株小；结子多；适于人工培养。对拟南芥基因功能的深入研究将有助于作物性状的遗传改良。
[0003]本发明的目的是提供拟南芥JAVl蛋白的新用途。该蛋白的氨基酸序列如序列表序列I所示，所述新用途即所述蛋白可用于调控目的植物的病害抗性和/或虫害抗性，或调节序列表序列I所示蛋白表达量的物质或方法可用于调控目的植物的病害抗性和/或虫害抗性。[0004]所述病害可为传染性病害或非传染性病害；所述传染性病害的生物病原物可为真菌、细菌、病毒和线虫；所述真菌具体可为灰霉菌(Botrytis cinerea)。[0005]所述虫害的致病害虫可为夜蛾、蕈蚊或蚜虫；[0006]所述夜蛾具体可为甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)、斜纹夜蛾(SpodopteraIitura)或棉铃虫(Heliothis armigera)；[0007]所述蕈蚊具体可为迟眼蕈蚊(Bradysia impatiens)或韭菜迟眼蕈蚊(Bradysiaodoriphage)；
[0008]所述姆虫具体可为桃姆(Myzus persicae Siilzer)。
[0009]本发明提供一种发夹RNA，其核苷酸序列由一个茎环序列及位于所述茎环序列两侧的序列A和序列B组成，所述序列A和序列B反向互补；所述序列A为序列表序列I所示蛋白的编码基因中200-500bp DNA转录得到的RNA序列。
[0010]所述蛋白的编码基因中的200-500bp的DNA中不含有所述蛋白的编码基因的5，UTR区或3’ UTR区序列。
[0011 ] 所述蛋白的编码基因具体可为序列表序列2所示的DNA分子；其中，所述5’UTR区为序列表序列2的自5’末端第I位至第259位核苷酸；所述3’ UTR区为序列表序列2的自5’末端第839位至第1129位核苷酸。
[0012]所述蛋白的编码基因中的200-500bp的DNA具体可为序列表序列2的第260-559位核苷酸序列所示的DNA。
[0013]由上述任一所述发夹RNA衍生的小干扰RNA也属于本发明的保护范围。
[0014]所述发夹RNA具体可为由如下序列依次相连组成的DNA片段转录形成的RNA --序列表序列2的第260-559位核苷酸序列、载体PTCK303的Kpn I和Spe I位点间的核苷酸序列和序列表序列2的第260-559位核苷酸序列的反向互补序列。
[0015]本发明提供上述任一所述RNA (发夹RNA或小干扰RNA)的编码基因。
[0016]所述RNA的编码基因具体为如下I)或2)的DNA分子:
[0017]I)式I所示的DNA片段，(I) SEQ正向-X-SEQ反向，
[0018]所述SEQtt是序列表序列2中包括第260位至第559位的核苷酸段，
[0019]所述SEQg的序列与所述SEQtt的序列反向互补，
[0020]所述X是所述SEQ1^1与所述间的间隔序列，在序列上，所述X与所述SEQIE向及所述SEQ反向均不互补；
[0021]2)与I)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同一性且抑制序列表序列I所示蛋·白表达的DNA分子。
[0022]所述SEQ1^1的核苷酸序列具体可为序列表序列2中第260位至第559位核苷酸序列。
[0023]本发明保护下述3)或4)的DNA分子:
[0024]3)其核苷酸序列为序列表序列2的第260位至第559位核苷酸段；
[0025]4)在严格条件下与3)限定的DNA序列杂交的DNA分子；
[0026]本发明保护含有上述任一所述RNA的编码基因或DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系、转基因植物、重组菌或重组病毒。
[0027]所述重组载体具体可为载体pBI121-JAVl-RNAi 和 pTCK303_JAVl_RNAi ；
[0028]所述载体pBI121-JAVl_RNAi为在载体pBI121的Xba I和Sac I位点间插入了由如下序列依次相连组成的DNA片段:序列表序列2的第260-559位核苷酸序列、载体PTCK303的Kpn I和Spe I位点间的核苷酸序列和序列表序列2的第260-559位核苷酸序列的反向互补序列；
[0029]所述载体pTCK303-JAVl_RNAi为在载体pTCK303的Xba I和Sac I位点间插入了由如下序列依次相连组成的DNA片段:序列表序列2的第260-559位核苷酸序列、载体PTCK303的Kpn I和Spe I位点间的核苷酸序列和序列表序列2的第260-559位核苷酸序列的反向互补序列。
[0030]本发明提供一种提高植物的病害抗性和/或虫害抗性的方法，是抑制目的植物中序列表序列I所示蛋白的表达，得到病害抗性和/或虫害抗性高于所述目的植物的转基因植物；
[0031]所述病害的致病菌可为灰霉菌(Botrytis cinerea)；
[0032]所述虫害的致病害虫可为夜蛾或蕈蚊；[0033]所述夜蛾具体可为甜菜夜蛾(Spodoptera exigua),所述蕈蚊具体可为迟眼蕈蚊(Bradysia impatiens)。
[0034]所述病害抗性高于所述目的植物表现可为:所述转基因植物叶片接种所述病害的病原物后的侵染面积小于所述目的植物叶片接种所述病害的病原物后的侵染面积；
[0035]所述虫害抗性高于所述目的植物表现可为:用所述转基因植物叶片饲喂的所述致病害虫的重量增加量小于用所述目的植物叶片饲喂的所述致病害虫的重量增加量。
[0036]所述抑制目的植物中序列表序列I所示蛋白的表达具体是通过将上述任一所述RNA的编码基因导入目的植物中表达上述任一所述RNA实现的。
[0037]本发明还提供另一种降低植物病害抗性和/或虫害抗性的方法，是将序列表序列I所示蛋白的编码基因导入目的植物中，得到病害抗性和/或虫害抗性低于所述目的植物的转基因植物；
[0038]所述病害的致病菌可为灰霉菌(Botrytis cinerea)；
[0039]所述虫害的致病害虫可为夜蛾或蕈蚊；
[0040]所述夜蛾具体可为甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)，所述蕈蚊具体可为迟眼蕈蚊(Bradysia impatiens)。
[0041]所述序列表序列I所示蛋白的编码基因可为如下I)或2)或3)的基因:
[0042]I)序列表序列2中第260位至838位所示的DNA分子；
[0043]2 )序列表序列2所示的DNA分子；
[0044]3)与I)或2)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同一性且编码序列表序列I所示蛋白的DNA分子；
[0045]4)在严格条件下与I)或2)或3)限定的DNA序列杂交且编码序列表序列I所示蛋白的DNA分子；
[0046]所述严格条件可为如下:50°C，在7%十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M Na3PO4和ImMEDTA的混合溶液中杂交，在50°C，2XSSC，0.1%SDS中漂洗；还可为:50°C，在7% SDS,0.5MNa3PO4和ImM EDTA的混合溶液中杂交，在50°C，I X SSC, 0.1%SDS中漂洗；还可为:50°C，在7% SDS,0.5M Na3PO4 和 ImM EDTA 的混合溶液中杂交，在 50°C，0.5XSSC,0.1%SDS 中漂洗；还可为:50°C，在 7% SDS,0.5M Na3POjP ImM EDTA 的混合溶液中杂交，在 50°C，0.1 X SSC,
0.1%SDS中漂洗；还可为:50°C，在7% SDS,0.5M Na3PO4和ImM EDTA的混合溶液中杂交，在65°C，0.1 X SSC, 0.1%SDS中漂洗；也可为:在6XSSC，0.5%SDS的溶液中，在65°C下杂交，然后用 2 XSSC,0.1%SDS 和 I X SSC, 0.1%SDS 各洗膜一次。
[0047]所述目的植物可为单子叶植物或双子叶植物；
[0048]所述双子叶植物具体可为拟南芥或卷心菜；
[0049]所述单子叶植物具体可为玉米或水稻。
[0050]本发明保护通过上述任一所述方法所获得的转基因植物。
[0051]实验证明，与野生型和转空载体对照相比，T3代转pBI121-JAVl_RNAi的拟南芥株系JAVl基因的相对表达量明显降低；接种灰霉菌后的侵染叶片面积为0.25-0.27平方厘米，明显小于野生型和转空载体对照的1.07和1.1平方厘米；用生长5周的叶片饲喂的甜菜夜蛾幼虫，6天后体重增加1.58—2.03毫克，明显低于野生型和转空载体对照的2.9和3.0毫克；用迟眼蕈蚊幼虫放入生长有18天的各株系单株的土壤中，12天后植株仍能正常生长而野生型植株矮小。本发明为培育抗病抗虫植物提供了一条新的途径，在农业生产领域具有广阔的应用空间和市场前景。



[0052]图1 为 RNAi 载体 pBI121-JAVl-RNAi 的 T-DNA 结构示意图。
[0053]图2为T1代转pBI121-JAVl-RNAi的拟南芥植株PCR鉴定电泳图。其中，M代表分子量标准，WT为野生型拟南芥，P为质粒pBI121-JAVl-RNAi阳性对照，1-10为待测转基因植株，含有目的条带的为阳性转pBI121-JAVl-RNAi的拟南芥植株。 [0054]图3为1代转空载体pBI121的拟南芥植株PCR鉴定电泳图。其中，M代表分子量标准，WT为野生型拟南芥，P为质粒PBI121阳性对照，其余1-4为待测转基因植株，含有目的条带的为阳性转空载体PBI121的拟南芥植株。
[0055]图4为转基因拟南芥的JAVl基因的相对表达量结果。其中，WT为野生型拟南芥，CK为转空载体PBI121的拟南芥株系，L1-L7为7个1~3代转pBI121-JAVl-RNAi的拟南芥株
系O
[0056]图5为T3代转pBI121-JAVl_RNAi的拟南芥株系喷洒灰霉菌菌液的表型。其中，框中的植株为转pBI121-JAVl-RNAi拟南芥，表现为对灰霉菌有一定抗性；其余植株为野生型及转空载体的拟南芥，表现为对灰霉菌的侵染十分敏感。
[0057]图6为T3代转pBI121-JAVl_RNAi的拟南芥株系滴加灰霉菌菌液的表型。其中，标尺代表2毫米。
[0058]图7为T3代转pBI121-JAVl_RNAi的拟南芥株系的甜菜夜蛾幼虫抗性鉴定结果。其中，标尺代表2毫米。
[0059]图8为T3代转pBI121-JAVl_RNAi的拟南芥株系的迟眼蕈蚊幼虫抗性鉴定结果。其中，标尺代表2毫米。

[0060]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0061]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0062]根癌农杆菌GV3101 (Agrobacterium tumefaciens Strain GV3101):参考文献:Cheng Huij Song Sushengj Xiao Langtaoj Soo Hui Mengj Cheng Zhiweij Xie Daoxinj PengJinrong.Gibberellin Acts through Jasmonate to Control the Expression ofMYB21, MYB24 and MYB57 to Promote Stamen Filament Growth in Arabidopsis.PLoSGenetics.2009，5(3):e 1000440.公众可从清华大学获得。
[0063]pBI121:参考文献:Zhiwei Cheng, Li Sun, Tiancong Qij Bosen Zhang, DaoxinXie.The bHLH Transcription Factor MYC3 Interacts with the JasmonateZIM-Domain Proteins to Mediate Jasmonate Response in Arabidopsis.Mol.Plant.2011,4(2):279-288.公众可从清华大学获得。
[0064]pTCK303:参考文献:Zhen Wang, Changbin Chen, Yunyuan Xuj Rongxi Jiang, YeHan，Zhihong Xu and Kang Chong.A practical vector for efficient knockdownof gene expression in rice(Oryza sativa L.).Plant Molecular BiologyReporter.2004, 4(22):409-417.公众可从清华大学获得。
[0065]实施例1、拟南芥JAVl基因的获得
[0066]提取拟南芥(Arabidopsisthaliana) Columbia_0 生态型(ArabidopsisBiological Resource Center (ABRC),种子号:CS6673)花的总 RNA,反转录得至Ij cDNA,以该 cDNA 为模板，以引物 1:5’ -CGAATCAAATTAAACATTGT-3’ 和引物 2:5’ -AAAACATTTTTATTTATTT-3’进行PCR扩增。将得到的PCR产物测序，结果如序列表序列2所示。序列表序列2为拟南芥JAVl基因的全长cDNA序列，其中，自序列表序列2的第260-838位为开放阅读框，编码序列表序列I所示的由192个氨基酸组成JAVl蛋白；自序列表序列2的5’末端第I位至第259位为5’ UTR区；自序列表序列2的3’末端第839位至第1129位为3’ UTR区。
[0067]也可人工合成序列表中的序列2。
[0068]实施例2、利用JAVl的RNAi载体培育抗虫抗病转基因拟南芥
[0069]1、RNAi 载体 pBI121-JAVl_RNAi 的获得
[0070]以实施例1 的拟南芥 cDNA 为模板，用引物 3:5，-GCTCTAGAATGGCTAACCCCAACGAGTG-3’(下划线碱基为 Xba I 识别序列)和引物 4:5’-TTGGTACCAGCAGAAGTAGTATTACCGG-3’ (下划线碱基为Kpn I识别序列)进行PCR扩增，获得300bp左右的DNA片段，将该片段用XbaI和Kpn I双酶切，与经过Xba I和Kpn I双酶切的载体pTCK303的载体骨架片段相连，获得中间载体I。
[0071]以实施例1 的拟南芥 cDNA 为模板，用引物 5:5，-CCACTAGTAGCAGAAGTAGTATTACCGG-3’(下划线碱基为 Spe I 识别序列)和引物 6:5’-TAGAGCTCATGGCTAACCCCAACGAGTG-3’ (下划线碱基为Sac I识别序列)进行P`CR扩增，获得300bp左右的DNA片段，将该片段用SpeI和Sac I双酶切，与经过Spe I和Sac I双酶切的中间载体的载体骨架片段相连，获得载体 pTCK303-JAVl-RNAi，经测序证实，载体 pTCK303_JAVl_RNAi 为在载体 pTCK303 的 Xba I和Sac I位点间插入了由如下序列依次相连组成的DNA:序列表序列2的第260-559位核苷酸序列、载体PTCK303的Kpn I和Spe I位点间的核苷酸序列和序列表序列2的第260-559位核苷酸序列的反向互补序列。
[0072]将载体pTCK303-JAVl_RNAi用Xba I和Sac I双酶切后，回收Ikb左右的片段，与经过Xba I和Sac I双酶切的pBI121载体骨架片段相连，获得RNAi干扰载体pBI121-JAVl-RNAi，经测序证实，载体 pBI121_JAVl_RNAi 为在载体 pBI121 的 Xba I 和 SacI位点间插入了由如下序列依次相连组成的DNA:序列表序列2的第260-559位核苷酸序列、载体PTCK303的Kpn I和Spe I位点间的核苷酸序列和序列表序列2的第260-559位核苷酸序列的反向互补序列。该插入片段编码具有茎环结构的发夹RNA，可产生20bp左右的小干扰RNA，该小干扰RNA再与目的基因JAZl的mRNA结合，最终沉默JAZl的表达。载体pBI121-JAVl-RNAi的T-DNA区结构示意图如图1所示。
[0073]2、转基因拟南芥的获得
[0074]I)重组根癌农杆菌的获得
[0075]将载体pBI121_JAVl_RNAi用电击法转入根癌农杆菌GV3101 (Agrobacteriumtumefaciens Strain GV3101)中，提取阳性转化子的质粒进行测序，证实该质粒为pBI121-JAVl-RNAi。将含有质粒pBI121-JAVl_RNAi的阳性转化子即重组根癌农杆菌命名为 GV3101/pBI121-JAVl-RNAi。
[0076]2)转基因拟南芥的获得
[0077]用步骤I)得到的重组根癌农杆菌GV3101/pBI121-JAVl_RNAi浸花法转化拟南芥(Arabidopsis thaliana) Columbia-O生态型,收获转化当代拟南芥植株上所结的种子，播种于含卡那霉素20mg/L的MS筛选培养基上，得到123株具有卡那霉素抗性的T1代转pBI121-JAVl-RNAi的拟南芥植株。待T1代转pBI121-JAVl_RNAi拟南芥植株长至4_6叶时移到蛭石上生长60天，光照时间(24°C:16小时/光照+8小时/黑暗)。
[0078]分别提取上述123株T1代转pBI121-JAVl-RNAi的拟南芥植株叶片基因组DNA，用CaMV35S启动子上的特异引物5’ -ACAGTGGTCCCAAAGATGGACC-3’和JAVl基因上的一条反向引物5’-GTCGGTGTTGAGAAGCGT-3’进行PCR扩增，预测产物大小为420bp，共得到55株T1代阳性转pBI121-JAVl-RNAi的拟南芥植株，部分检测结果如图2所示。
[0079]采用同样的方法，将空载体pBI121转入拟南芥(Arabidopsis thaliana)Columbia-O生态型中，得到T1代转空载体拟南芥植株。提取抗卡那霉素的T1代转空载体拟南芥叶片的基因组DNA，用pBI121载体上CaMV35S启动子上特异引物5’ -ACAGTGGTCCCAAAGATGGACC-3’ 和该载体上另条引物 5’ -TTAITTTATCAATAAATATT-3’ 进行PCR,预测产物大小为300bp，共得到10株T1代阳性转空载体的拟南芥植株，部分检测结果如图3所示。
[0080]T1代表示转化当代植株自交产生的种子及由它所长成的植株；T2代表示T1代自交产生的种子及由它所长成的植株；τ3代表示T2代自交产生的种子及由它所长成的植株。
[0081]按照上述PCR检测方法，检测T1代PCR呈阳性的转基因株系的T2代及T3代植株，将T3代植株全部呈PCR阳性的株系确定为纯合转pBI121-JAVl-RNAi的拟南芥株系或纯合转空载体的拟南芥株系。
[0082]3、转基因拟南芥的荧光实时定量PCR检测
[0083]取同一正常培养环境中生长21天的、步骤2获得的7个T3代纯合转pBI121-JAVl-RNAi的拟南芥株系(编号为LI一L7)、T3代纯合转空载体拟南芥株系(CK)和野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana) Columbia-O生态型(WT)的植株叶片，分别提取总RNA,反转录得到cDNA，再以此cDNA为模板，以JAVl基因特异引物7和8进行实时荧光定量PCR扩增，分析各株系植株内JAVl基因的表达情况，以Actin8为内参基因，引物为F和R。实时荧光定量PCR在ABI PRISlf 7500实时荧光定量PCR仪上进行，一次平行试验设3次重复。利用Livak KJ和Schmittgen TD (2001)报道的方法，即2_Δ Δετ计算相对表达量。
[0084]Δ Δ Cj^T.Actin^ Time x ^ ^T.Target ^T.Actin^ Time 0
[0085]Time x表示任意时间点，Time0表示经act in校正后I倍量的目标基因表达。
[0086]JAVl基因的特异引物序列如下(靶序列为序列表序列2的第260-835位):
[0087]引物7:5，-ATGGCTAACCCCAACGAG-3，；
[0088]引物8:5，-TTGCAACCTCGAAGA-3’ ；
[0089]内参基因Actin8的特异引物序列如下:
[0090]F:5’-TCAGCACTTTCCAGCAGATG-3’ ；
[0091 ] R:5’-CTGTGGACAATGCCTGGAC-3’。[0092]结果如图4所示，野生型拟南芥JAVl基因的相对表达量为1.0 ;转pBI121-JAVl-RNAi的拟南芥株系(L1-L7)的相对表达量均明显小于I。野生型拟南芥(WT)和转空载体拟南芥(CK)的结果无显著差异。
[0093]4、转基因拟南芥的抗病性鉴定
[0094]取步骤2中的4个编号为LI一L4的T3代纯合转pBI121_JAVl_RNAi的拟南芥株系、野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana)Columbia-0生态型(WT)和T3代纯合转空载体拟南芥株系(CK)(每个株系取30个单株，设三次重复)按照如下方法进行灰霉菌抗性检测:
[0095]I)灰霉菌(Botrytis cinerea)(文献:Mercedes M.Keller, MiriamD.Cargnel, Patricia V.Demkura, Mieke de Wit, Micaela S.Patitucci, RonaldPierik, CorneM.J.Pieterse and Carlos L.Ballare.Low Red/Far-Red Ratios ReduceArabidopsis Resistance to Botrytis cinerea and Jasmonate Responses via aCOI1-JAZlO-Dependent, Salicylic Acid-1ndependent Mechanism Ignacio Cerrud0.Plant Physiology.2012, 158(4):2042-2052)用马铃薯培养基(每升加马铃薯200g，取浸出汁加琼脂20g)，24V、12小时光照培养7到10天，收集孢子至浓度5 X IO5每毫升，按照每株2毫升的量均匀的喷洒于生长18天的拟南芥莲座叶表面，黑暗放置18-24小时，保湿7天后，拍照，统计各株系内所有单株不同侵染级别的叶片数目(没有侵染记为“O”;侵染面积在25%以下记为“I”;侵染面积在25%-50%之间的记为“2”;侵染面积大于50%的记为“3”)，分别计算各株系不同侵染级别的叶片数占株系所有叶片数的百分比，取各重复的平均值，结果表1所示。
[0096]表1.灰霉菌抗性检测结果(不同侵染级别的叶片数百分比)
[0097]