专利名称：人工皮肤的制作方法覆盖以人类为代表的各种动物的整个身体的皮肤处于由日光、干燥、氧化、环境造成的压力、精神压力等外界因素以及年龄增长所引起的皱纹的形成、硬化、斑、暗沉、弹性的降低等变化中。在天然皮肤中，大地分类由表皮和真皮这两层构成，在表皮与真皮之间存在被称为表皮基底膜的薄且纤细的膜。表皮基底膜为约O. ιμπι左右的非常薄的结构体，片状地存在于表皮与真皮的接合部。表皮基底膜由作为基本结构的致密层(lamina densa)和透明层(lamina densa)、以及角质形成细胞的半桥粒、锚丝(anchoring filament)、锚纤维等构成，特别是该基本结构由IV型胶原、各种层粘连蛋白(Iaminin)、和蛋白聚糖等构成。结合着表皮基底细胞与基本结构、特别是致密层的锚丝的主要成分为层粘连蛋白5，基本结构与真皮的胶原纤维通过以VII型胶原为主成分的锚纤维被连结。此外，锚丝与锚纤维可以彼此结合，它们形成被称为锚复合体的复合体。通过这样的结构，生物体的最外层存在的皮肤保持抵御来自外界的力学压力的强度(化妆品事典，日本化妆品技术者会编，P405-406)。然而，在由于某种原因而天生的皮肤(即，天然皮肤)受到损伤的情况下，作为其代替物的人工皮肤的需求提高。此外，作为用于测试药品、化妆品对皮肤的作用、药物的实验材料，人工皮肤的开发也是极其重要的，在任一用途中都强烈期望尽可能模仿天然皮肤的结构的人工皮肤。作为以往的人工皮肤的制造方法，已知在包含人成纤维细胞的收缩I型胶原凝胶 上培养正常人表皮角质形成细胞而形成表皮层的方法。然而，在该方法中，在模仿真皮的胶原凝胶与模仿表皮的表皮层之间不能充分地形成基底膜，因此在使用这样的人工皮肤的情况下，通过施与基质金属蛋白酶抑制剂、或基质金属蛋白酶抑制剂和基质蛋白质产生增强剂这两者，从而促进皮肤基底膜结构的再形成(日本特开2001-269398号公报)。此外，已知抑制丝氨酸蛋白酶的物质以及提高作为表皮基底膜成分的主要构成成分的IV型、VII型胶原或层粘连蛋白5的产生量的物质会促进由基质蛋白酶抑制剂产生的促进基底膜形成的效果(日本特开2004-75661号公报)。然而，在通过这样的现有技术制造的人工皮肤中，表皮基底膜与真皮的高级结构的形成仍然不成熟，不能说充分地实现了表皮基底膜与真皮间的通讯。此外，已知抑制乙酰肝素酶活性的化合物在皮肤的皱纹形成过程中改善生物体内的基底膜功能，由此抑制皱纹的形成(W0 2009/123215号)，但是关于通过使该化合物与基质金属蛋白酶抑制剂进行组合，来促进人工皮肤的表皮基底膜和真皮的再形成，并不知道。现有技术文献专利文献专利文献I :日本特开2001-269398号公报专利文献2 :日本特开2004-75661号公报专利文献3 W02009/123215 号
发明要解决的课题本发明的目的是提供充分地实现了表皮基底膜与真皮间的通讯，无限地接近天然皮肤的结构的人工皮肤。用于解决课题的方法此次，本发明人在包含来源于人表皮的角质形成细胞和来源于人真皮的成纤维细 胞的形成人工皮肤的培养基中添加基质金属蛋白酶抑制剂和乙酰肝素酶抑制剂，对该培养基中的细胞进行培养，从而形成了人工皮肤，结果成功地获得表皮基底膜和真皮的高级结构极其近似于天然皮肤的人工皮肤。因此，本申请包含以下的发明[I] 一种人工皮肤的制造方法，其包括在包含来源于人表皮的角质形成细胞和来源于人真皮的成纤维细胞的形成人工皮肤的培养基中添加基质金属蛋白酶抑制剂和乙酰肝素酶抑制剂，对该形成人工皮肤的培养基中的细胞进行培养，从而形成人工皮肤。[2] 一种人工皮肤，其特征在于，包含含有连续的致密层和从该致密层产生的锚纤维的表皮基底膜、和含有胶原纤维的真皮，通过所述表皮基底膜中存在的从连续的致密层产生的锚纤维与真皮中存在的胶原纤维进行结合，从而表皮基底膜与真皮被牢固地粘接。[3]根据上述[2]所述的人工皮肤，所述真皮还包含原纤维沉积物(fibripositor)。[4]根据上述[2]或[3]所述的人工皮肤，其特征在于，在所述真皮中形成有弹性蛋白纤维。[5]根据上述[2] [4]的任一项所述的人工皮肤，其特征在于，是通过上述[I]所述的方法制造的。[6] 一种人工皮肤，其特征在于，是在包含基质金属蛋白酶抑制剂和乙酰肝素酶抑制剂的培养基中形成的人工细胞，该人工细胞包含含有连续的致密层和从该致密层产生的锚纤维的表皮基底膜、和含有胶原纤维的真皮，通过所述表皮基底膜中存在的从连续的致密层产生的锚纤维与真皮中存在的胶原纤维进行结合，从而表皮基底膜与真皮被牢固地粘接。发明的效果令人惊讶的是，在通过本发明的方法获得的人工皮肤的表皮基底膜内，确认了在以往的人工皮肤中观察不到的连续而均匀的致密层以及与该致密层结合的锚纤维的形成。此外，在该人工皮肤的真皮内，观察到迄今为止仅在天然皮肤中报告的原纤维沉积物(fibripositor),此外确认了在以往的方法中再构建极其困难的弹性蛋白纤维的形成。这些表皮基底膜和真皮的高级结构与天然皮肤的高级结构极其近似。图I为显示对照组、在培养液中仅添加基质金属蛋白酶(MMP)抑制剂而培养的皮肤模型(A组)、在培养液中仅添加乙酰肝素酶抑制剂而培养的皮肤模型(B组)、在培养液中添加MMP抑制剂和乙酰肝素酶抑制剂这两者而培养的皮肤模型(C组)的基底膜的结构的照片。图2为显示对照组、在培养液中仅添加基质金属蛋白酶(MMP)抑制剂而培养的皮肤模型(A组)、在培养液中仅添加乙酰肝素酶抑制剂而培养的皮肤模型(B组)、在培养液中添加MMP抑制剂和乙酰肝素酶抑制剂这两者而培养的皮肤模型(C组)的基底膜正下方的真皮中存在的成纤维细胞的照片。对照组、A组、B组为通常的成纤维细胞，与此相对，C组显示包含原纤维沉积物的成纤维细胞。图3为显示在培养液中添加MMP抑制剂和乙酰肝素酶抑制剂这两者而培养的皮肤模型(C组)的真皮内形成的弹性蛋白纤维的照片。
接下来，在上述胶原凝胶上培养表皮细胞例如人正常表皮角质形成细胞，形成表皮。通过皮肤细胞的培养进行的表皮层的形成可以如下进行。将收缩胶原凝胶放在金属网上，然后将玻璃环(glass ring)放在该凝胶上。在该玻璃环内以不漏液的方式加入来源于人外表皮的表皮角质形成细胞悬浮液。在CO2培养箱内使角质形成细胞粘接，取下环。填充上述培养基直至表皮层的边界，将表皮层暴露于空气的同时继续培养，从而形成角质层。根据该方法，可以在从培养起约I天 4周、典型地为约4天 2周这样的极短期间，获得极其接近于天然皮肤的结构的人工皮肤。具体而言，在本发明的人工皮肤的表皮基底膜内，确认了在以往的人工皮肤中观察不到的连续而均匀的致密层以及与该致密层结合的锚纤维的形成。致密层为由IV型胶原、各种层粘连蛋白以及蛋白聚糖等构成的表皮基底膜的基本结构，而且以VII型胶原为主成分的锚纤维从作为该基本结构的致密层产生，其具有通过与真皮的胶原纤维相互缠绕而将表皮基底膜与真皮牢固地连接的功能。因此，本发明的人工皮肤的表皮基底膜中的连续的致密层以及从该致密层产生的锚纤维的形成意味着，本发明的人工皮肤与天然皮肤同样地对来自外界的力学压力具有极其强的强度。此外令人惊讶的是，在本发明的人工皮肤的真皮内，确认了由发达的粗面内质网和原纤维沉积物(fibripositor)赋予特征的成纤维细胞的高级结构的形成。已知在粗面内质网中，通过其内部存在的膜结合核糖体而合成分泌蛋白质。此外，原纤维沉积物在其内部具有胶原原纤维，作为从成纤维细胞突出的富含肌动蛋白的原生质膜突起是已知的，报告了通过原纤维沉积物，在由相邻的成纤维细胞形成的细胞外通道沉积了胶原原纤维(Elizabeth G. Cantyet al. , The Journal of Cell Biology, Vol. 165, No. 4, 2004, pp. 553-563，Elizabeth G. Canty et al. , The Journal of Biological Chemistry, Vol. 281-No.50,December 15，2006，Sally M. Humphries et al. , The Journal of Biological Chemistry, Vol. 283，No. 18，pp. 12129-12135，以及 Zoher Kapacee et al.，Matrix Biology27 (2008) 371-375)。因此，在本发明的人工皮肤的真皮内，存在粗面内质网发达的成纤维细胞和内部具有原纤维沉积物(fibripositor)的成纤维细胞这样的事实表明，通过基质金属蛋白酶抑制剂和乙酰肝素酶抑制剂而使再形成的人工皮肤的真皮内存在的成纤维细胞的功能被显著地活化，意味着在本发明的人工皮肤中，与天然皮肤同样地，分泌蛋白质的合成、胶原纤维这样的细胞基质的产生积极进行。 此外重要的是，在本发明的人工皮肤的真皮内，确认了在以往的人工皮肤中再构建极其困难的弹性蛋白纤维的形成。弹性蛋白纤维由作为主成分的微原纤维和无定形弹性蛋白构成，在天然皮肤中，成熟的弹性蛋白纤维分布在网状层的胶原纤维之间。弹性蛋白纤维的主要功能是赋予皮肤以弹性，保持皮肤的张力。此外，在基底膜正下方垂直移动的微原纤维发挥将基底膜与真皮连接的重要作用。因此，本发明的人工皮肤的真皮内的弹性蛋白纤维的形成是显示本发明的人工皮肤具有与天然皮肤同样的功能的极其重要的证据。本发明的人工皮肤可以在生物体的天然皮肤伴随由某种原因造成的病变或损伤的情况下，作为其代替物在临床上进行移植。此外，本发明的人工皮肤，为了修补由烧伤引起的瘢痕疙瘩痕、植皮痕、手术痕、深皱纹、深伤痕、痤疮痕、大毛孔、小皱纹等，还能够在美容学上应用于皮肤上的凹凸表面。此外，本发明的人工皮肤可以作为研究用或试验用模型，例如用于测试药品或化妆品的皮肤透过试验或效果、或者毒性，或用于研究创伤治愈、细胞迁移、癌细胞的侵入、癌细胞的转移或癌的进展等。如上所述，由于基质金属蛋白酶抑制剂和乙酰肝素酶抑制剂的组合在人工皮肤中带来与正常的天然皮肤极其近似的表皮基底膜和真皮的高级结构，因此这些组合作为用于形成本发明的人工皮肤的培养液也是有用的。因此，作为本发明的另一方式，提供了包含基质金属蛋白酶抑制剂和乙酰肝素酶抑制剂的人工皮肤培养液。此外认为，在将基质金属蛋白酶抑制剂和乙酰肝素酶抑制剂应用于生物体的皮肤的情况下，可显著地促进表皮基底膜和真皮的再生、修复。因此，在本发明的其它方式中，提供了包含基质金属蛋白酶抑制剂和乙酰肝素酶抑制剂的用于促进皮肤基底膜和/或真皮的再生、修复的I种或多种皮肤赋活用组合物。这里所谓“皮肤赋活”，是指防御、改善由例如年龄增长等引起的基底膜和/或真·皮的结构变化所导致的皮肤的功能降低，具体而言为皮肤的皱纹、硬化等。在上述的人工皮肤培养液或皮肤赋活组合物中，为了促进皮肤基底膜和真皮的再生、修复，以充分浓度含有作为活性成分的基质金属蛋白酶抑制剂和乙酰肝素酶抑制剂，典型地以相对于培养液或组合物各自为O. 0000001 10重量％、优选O. 000001 10重量％含有。此外，在上述的人工皮肤培养液或皮肤赋活组合物中，以调制它们时常用的赋形齐轉为代表，可以适当配合香料、油脂类、表面活性剂、防腐齐 、螯合齐 、水溶性高分子、增稠齐U、粉末成分、紫外线防御剂、保湿剂、药效成分、抗氧化剂、PH调节剂、洗涤剂、干燥剂、乳化剂等。在将这些各种成分配合在本发明的人工皮肤培养液或皮肤赋活组合物中的情况下，需要在不损害本发明所期望的效果的范围内进行。实施例I.皮肤模型的培养方法将皮肤模型(EFT-400，MatTeK社制)在专用培养基(EFT-400-ASY，MatTeK社制)中进行培养。作为对照组，以使终浓度为O. 1%的方式将二甲亚砜(DMSO)和乙醇添加至专用培养基中；作为乙酰肝素酶抑制剂组，以使终浓度为50 μ M的方式将50mM的1-[4_(1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-3-[4-(1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-脲(DMS0溶剂)添加至专用培养基中；作为MMP抑制剂组，以使终浓度为10 μ M的方式将IOmM的N-羟基_2_[ [ (4-甲氧基苯基)磺酰基]3-吡啶甲基)氨基]-3-甲基丁酰胺盐酸盐(CGS27023A，乙醇溶剂)添加至专用培养基中；而且作为乙酰肝素酶抑制剂+MMP抑制剂组，以使各自终浓度为50μΜ和10 μ M的方式将50mM的1-[4_(1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-3-[4_(1Η-苯并咪唑-2-基)-苯基]-脲(DMS0溶剂)和IOmM的CGS27023A (乙醇溶剂)添加至专用培养基中，对它们进行培养。2.电子显微镜观察将切出一半的培养后的上述皮肤模型利用Zamboni固定液进行固定,利用锇酸进行后固定，然后按照通用方法包埋在树脂中。制成超薄切片，由乙酸双氧铀染色后使用电子显微镜(日本电子株式会社制JEM-1230)进行组织的观察。在微观形态学上进行在通常的培养液中添加溶剂而培养的皮肤模型(对照组)、在培养液中仅添加N-羟基-2-[[(4-甲氧基苯基)磺酰基]3-吡啶甲基)氨基]-3-甲基丁酰胺盐酸盐(CGS27023A)作为MMP抑制剂而培养的皮肤模型(A组)、在培养液中仅添加1-[4-(1Η-苯并咪唑-2-基)-苯基]-3-[4-(1Η-苯并咪唑-2-基)-苯基]-脲作为乙酰肝素酶抑制剂而培养的皮肤模型(B组)、以及在培养液中添加N-羟基-2-[[(4-甲氧基苯基)磺酰基]3-吡啶甲基)氨基]-3-甲基丁酰胺盐酸盐(CGS27023A)和1-[4_(1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-3-[4-(1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-脲这两者而培养的皮肤模型(C组)的比较。将其结果示于下表中。[表 I]


本发明涉及一种人工皮肤的制造方法，其特征在于，在包含来源于人表皮的角质形成细胞和来源于人真皮的成纤维细胞的形成人工皮肤的培养基中添加基质金属蛋白酶抑制剂和乙酰肝素酶抑制剂，对该形成人工皮肤的培养基中的细胞进行培养，从而形成人工皮肤。