专利名称：朝藿定c对照品的制备方法及其产品的制作方法淫羊藿为常用中药，具有补肾阳、强筋骨、祛风湿之功效，主要用于阳痿遗精，筋骨痿软，风湿痹痛，麻木拘挛，更年期高血压等症。淫羊藿所含总黄酮类成分为有效部位之一，包括淫羊藿苷等至少六种以上的黄酮类成分，朝藿定C(epimedin C)是其中的一种。经研究得知淫羊藿的有效部位(总黄酮)中朝藿定C的含量远远高于其他黄酮类成分。而目前，药典要求的淫羊藿药材的指标性成分仅为淫羊藿苷。对一种药材进行多种指标物的测定，可以更全面地反映药材的内在质量，对质量控制有着重要意义。因此，申请人经过大量的试验研究，于2006年4月6日向国家知识产权局递交了名称为“仙灵骨葆制剂中淫羊藿苷及朝藿定C的含量测定方法”的专利申请，申请号为2006102003226。该专利申请弥补了现有质量检测标准的不足，使淫羊藿药材的质量检测标准更加完善。但在申请号为2006102003226的专利申请中，用高效液相色谱法测定朝藿定C的含量是以朝藿定C为对照品进行测定。而目前在国内尚未有可提供朝藿定C对照品的单位和机构，也未见有关朝藿定C对照品的制备方法的相关报道。于是，申请人在研究朝藿定C的含量测定方法的过程中，同时对朝藿定C对照品的制备进行了相关研究。
本发明的目的在于提供一种朝藿定C对照品的制备方法及其产品。本发明通过对淫羊藿药材的提取工艺进行全面考察，确定了朝藿定C的最佳提取工艺，并成功地对朝藿定C进行了分离和纯化，所制得的化合物经过严密的光谱鉴定可确认为朝藿定C。本发明是这样实现的朝藿定C对照品的制备方法为(1)提取取淫羊藿药材，切成断，加10-40倍量45-90％的乙醇回流2-5次，每次0.5-2h，合并所有的提取液，回收乙醇，并浓缩成60℃时相对密度为1.13-1.20；浓缩液加蒸馏水适量放置，弃沉淀，取上清液，再浓缩得浸膏；依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取至近无色，再用正丁醇反复萃取至近无色，回收正丁醇至干，即得含朝藿定C粗浸膏；(2)分离用甲醇溶解含朝藿定C粗浸膏，薄层色谱用硅胶拌样，硅胶柱色谱分离，以氯仿∶甲醇＝100∶17、100∶20、100∶22进行梯度洗脱，以硅胶预制板跟踪检识，收集硅胶预制薄层层析TLC板上比移值Rf小于淫羊藿苷的斑点流份，回收溶剂后，即得朝藿定C粗品；粗品用甲醇溶解，柱色谱用聚酰胺拌样，聚酰胺柱色谱分离，以乙酸乙酯∶甲醇∶水＝8∶1∶0、8∶1∶0.2进行梯度洗脱，以聚酰胺薄膜跟踪检识，收集聚酰胺薄膜薄层层析TLC上比移值Rf大于淫羊藿苷的斑点流份，回收溶剂后，即得朝藿定C对照品。更佳的提取过程为取淫羊藿药材，切成断，加20倍量70％乙醇回流3次，每次1h，合并三次的提取液，回收乙醇，并浓缩成60℃时相对密度为1.15；浓缩液加蒸馏水适量放置，弃沉淀，取上清液，再浓缩得浸膏；依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取至近无色，再用正丁醇反复萃取至近无色，回收正丁醇至干，即得含朝藿定C粗浸膏。其中硅胶薄层层析TLC的展开系统为氯仿∶甲醇＝100∶20。聚酰胺薄膜薄层层析TLC的展开系统为乙酸乙酯∶乙醇∶水＝8∶1∶1。
按照上述朝藿定C对照品的制备方法制备得到的朝藿定C对照品，其化学结构式为 为了验证本发明方法的可靠性和准确性，申请人对所制得的产品进行了结构鉴定和确认，具体如下1、结构鉴定所得产品为浅黄色结晶性粉末，盐酸-镁粉反应、Molish反应阳性，硅胶板上水解检出葡萄糖和鼠李糖。分子式C39H50O19(MS+13C NMR)，不饱和度Ω＝15，结合氢(碳)谱、IR、UV数据，判断为黄酮类化合物的三糖苷。
13C NMR数据δ178.2及1H NMR数据δ12.61表明该黄酮类化合物C-5上有一羟基。1H NMR数据显示1上共有五个芳氢质子，其中的一个质子信号为单峰[6.63(1H，s，6-H)]，另外的四个质子信号呈典型的B环4’-氧取代系统[7.90(2H，d，J＝8.8Hz，2’，6’-H)，7.13(2H，d，J＝8.8Hz，3’，5’-H)]，表明1为8位有取代的莰菲醇型黄酮类化合物。同时，氢(碳)谱显示该化合物上有一个甲氧基信号[δH 3.84(3H，s)；δC 55.5]，经与已知化合物的碳谱数据比较，确定该化合物4’位为甲氧基取代。另外，13C NMR数据δ17.6(q)，21.4(t)，25.5(q)，122.1(d)，131.1(s)，及1H NMR数据δ1.59(3H，s)，1.67(3H，s)，5.16(1H，t，J＝5.2Hz)表明1上有一个异戊烯基，且其C-7、C-9碳谱数据向高场位移，说明此异戊烯基位于8位，因此1的苷元为anhydroicartin。RDA裂解后形成的碎片峰(m/z 368，353，313，165[A1-C4H7]+和135[B2]+)进一步支持这一结论。
13C NMR在95-106ppm之间有3个糖端基碳的共振信号δc101.6、100.7、100.5ppm；以及15个糖碳信号。经与糖的标准碳谱数据比较，可以确定这三个糖分别为鼠李糖、鼠李糖和葡萄糖。经与已知化合物数据比较，1H NMR、13C NMR、MS、UV、IR数据与文献资料中有关朝藿定C的报道一致，故可鉴定此种化合物为朝藿定C。
2、结构确认(1)仪器与试剂红外光谱仪(德国VECTOR22型)、核磁共振波谱仪(美国瓦里安公司Varian 400MHz超导核磁共振波谱仪)、电喷雾质谱仪(GC-MS 5973型)、紫外可见分光光度仪(HP8453E)。薄层色谱用硅胶H(青岛海洋化工有限公司)，硅胶预制板(青岛海洋化工厂分厂)，聚酰胺(80～120mesh浙江省台州市路桥四青生化材料厂)，溶剂为工业级重蒸使用。
(2)熔点按《中国药典》2005年版一部附录VII C项下的“熔点测定法”方法测定。取本发明产品适量，研细，于105℃干燥2小时，分取适量样品，依法测定，测定结果为198～200℃。
(3)紫外按《中国药典》2005年版一部附录VA项下的“紫外可见分光光度法”测定。本发明产品UVλmaxMeOHnm为271，316，351。紫外光谱显示有黄酮特征吸收λmaxMeOHnm351和271。
(4)红外按《中国药典》2005年版一部附录VC项下的“红外分光光度法”测定。IR(KBr)cm-13417(OH)，2925，1651(α，β-unsaturated C＝O)，1598，1511(C＝C)，1491，1440，1377，1343，1305，1260，1220，1181，1062，983，940，919，838，810。
(5)黄色粉末(乙酸乙酯甲醇)，mp198-200℃。HCl Mg反应呈玫瑰红颜色，Molish反应出现棕色环(阳性)，FeCl3反应阳性(墨绿色)。
ESI-MS m/z823.3[M+H]+，677.2[M-rha+H]+，531.1[M-2×rha+H]+。
EI-MS m/z368[M-glc-2×rha]+，353[M-glc-2×rha-CH3]+，313[M-glc-2×rha-C4H8]+，300，177，165，146，135，85，73，60。
1H-NMR(DMSO-d6)12.61(1H，s，5-OH)，7.90(2H，d，J＝8.8 Hz，H-2’，6’)，7.13(2H，d，J＝8.8Hz，H-3’，5’)，6.63(1H，s，H-6)，5.16(1H，t，J＝5.2Hz，H-12)，5.00(1H，d，J＝6.4Hz，Glc-H-1)，3.84(3H，s，OCH3)，1.67(3H，s，H-15)，1.59(3H，s，H-14)，1.10(3H，d，J＝6.0Hz，Rha’H-6)，0.80(3H，d，J＝4.8Hz，Rha-H-6)。
5.38(1H，d，J＝1.5Hz，Rha-H-1)，4.87(1H，d，J＝1.0Hz，Rha’-H-1)，13C-NMR(DMSO-d6)157.3(C-2，s)，134.6(C-3，s)，178.2(C-4，s)，159.1(C-5，s)，98.1(C-6，d)，160.6(C-7，s)，108.3(C-8，s)，153.0(C-9，s)，105.5(C-10，s)，21.4(C-11，t)，122.1(C-12，d)，131.1(C-13，s)，25.5(C-14，q)，17.6(C-15，q)，122.1(C-1’，s)，130.6(C-2’，d)，114.1(C-3’，d)，161.5(C-4’，s)，114.1(C-5’，d)，130.6(C-6’，d)，55.5(OCH3，q)，100.5(Glc-C-1，d)，73.3(Glc-C-2，d)，76.6(Glc-C-3，d)，68.8(Glc-C-4，d)，77.2(Glc-C-5，d)，60.6(Glc-C-6，t)，100.7(Rha-C-1，d)，75.5(Rha-C-2，d)，70.4(Rha-C-3，d)，71.9(Rha-C-4，d)，70.2(Rha-C-5，d)，17.6(Rha-C-6，q)，101.6(Rha’-C-1，d)，70.7(Rha’-C-2，d)，70.1(Rha’-C-3，d)，71.3(Rha’-C-4，d)，69.6(Rha’-C-5，d)，17.5(Rha’-C-6，q)。酸水解，TLC检查，糖部分为葡萄糖、鼠李糖和鼠李糖。1H-NMR，13C-NMR，MS，IR，UV数据与文献资料中有关朝藿定C的报道一致。故该化合物鉴定为朝藿定C。
与现有技术相比，本发通过对淫羊藿药材的提取工艺进行研究考察，确定了朝藿定C的最佳提取工艺，并成功地对朝藿定C进行了分离和纯化；所得的化合物经光谱鉴定可确认为朝藿定C。朝藿定C对照品的制备为淫羊藿药材中朝藿定C的含量测定提供了有效的对照品来源，从而为淫羊藿药材进行多种指标物的测定，以更全面地反映其内在质量奠定了基础。

(2)分离工艺
①硅胶柱色谱的分离将上述所得粗浸膏用甲醇溶解，薄层色谱用硅胶拌样，硅胶柱色谱分离，以氯仿∶甲醇(100∶17，100∶20，100∶22)梯度洗脱，以硅胶预制板跟踪检识，展开系统为氯仿∶甲醇＝100∶20，收集硅胶预制板TLC上Rf值小于淫羊藿苷的斑点流份，回收溶剂后，即得朝藿定C粗品。
②聚酰胺柱色谱的分离朝藿定C粗品用甲醇溶解，柱色谱用聚酰胺拌样，聚酰胺柱色谱分离，以乙酸乙酯∶甲醇∶水(8∶1∶0，8∶1∶0.2)梯度洗脱，以聚酰胺薄膜跟踪检识，展开系统为乙酸乙酯∶乙醇∶水＝8∶1∶1，收集聚酰胺薄膜TLC上Rf值大于淫羊藿苷的斑点流份，回收溶剂后，即得朝藿定C对照品。
本发明的实施例2提取工艺取淫羊藿药材，切成断，加10倍90％乙醇回流2次，每次2h，合并两次的提取液，回收乙醇，并浓缩成60℃时相对密度为1.13。浓缩液加蒸馏水适量放置，弃沉淀，取上清液，再浓缩得浸膏。依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取至近无色，再用正丁醇反复萃取至近无色，回收正丁醇至干，即得到含朝藿定C的粗浸膏。
朝藿定C粗浸膏的分离工艺同实施例1所述。
本发明的实施例3提取工艺取淫羊藿药材，切成断，加40倍45％乙醇回流5次，每次0.5h，合并五次的提取液，回收乙醇，并浓缩成60℃时相对密度为1.20。浓缩液加蒸馏水适量放置，弃沉淀，取上清液，再浓缩得浸膏。依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取至近无色，再用正丁醇反复萃取至近无色，回收正丁醇至干，即得到含朝藿定C的粗浸膏。
朝藿定C粗浸膏的分离工艺同实施例1所述。


本发明提供了一种朝藿定C对照品的制备方法及其产品，取淫羊藿药材，用45－90％的乙醇回流提取，回收乙醇，浓缩成浸膏；依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇反复萃取至近无色，回收正丁醇至干，得粗浸膏；然后依次进行硅胶柱色谱分离和聚酰胺柱色谱分离，即得朝藿定C对照品。与现有技术相比，本发明确定了朝藿定C的最佳提取工艺，并成功地对朝藿定C进行了分离和纯化；所得的化合物经光谱鉴定可确认为朝藿定C。朝藿定C对照品的制备为淫羊藿药材中朝藿定C的含量测定提供了有效的对照品来源，从而为淫羊藿药材进行多种指标物的测定，以更全面地反映其内在质量奠定了基础。