专利名称：一种食用菌菌种潜伏污染细菌的检测方法食用菌菌种是食用菌生产之源头，食用菌菌种的纯度直接影响食用菌的生长和产量。食用菌菌种的主要生产工艺为培养料配制、装瓶或袋、灭菌、接种、培养、保存；在食用菌菌种的生产过程中，由于灭菌不彻底，或接种、培养和保存等环节的不慎，往往会携带、污染其它真菌、细菌等微生物杂菌。其中，当真菌携带量大、污染严重时会直接表现出肉眼可见的菌斑、产生不同颜色的真菌孢子，从而在检查挑选食用菌菌种时会被容易检出并剔除； 但当细菌携带量少、污染轻时，细菌会被食用菌菌丝的生长优势所抑制或隐盖，具有繁殖能力的细菌呈潜伏状态存在于食用菌菌种中，但当接种到生产下一级食用菌菌种或接种生产用于栽培出菇的菌瓶(包)时，潜伏在食用菌菌种中的细菌会大量繁殖，一方面与食用菌争夺营养和生长空间，另一方面产生有害代谢产物影响食用菌菌丝生长，进而影响子实体生长发育，导致产量与质量的“双降”而造成严重的经济损失，这对当前我国食用菌工厂化生产发展中的影响尤为显著。因此，研发一种食用菌菌种是否已被潜伏细菌污染的检测防控方法，以防止已被细菌潜伏污染的食用菌菌种用于扩繁下一级食用菌菌种或用于生产栽培出菇的菌瓶(包)，避免导致更大的损失，是一项保障食用菌菌种的纯度与质量，实现食用菌优质、稳产、高产的重要技术措施之一。在食用菌生产中，许多企业、农户由于缺乏相应的检测防控方法，导致食用菌菌种的潜伏污染不能被事先发现，还误以为是在本级食用菌菌种或栽培菌瓶(包)生产过程中的灭菌、接种和培养环节不慎所致。我们经大量的调查分析发现，食用菌菌种的细菌隐性潜伏污染是杂菌传播的重要途径之一，污染细菌的种类主要有枯草杆菌 (Bacillus-subitilis)、赌状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、假单孢杆菌(Pseudomonas spp)、黄单孢杆菌(Xanthomonas spp)、欧文氏杆菌(Erwinnia spp)等，是目前我国食用菌生产中存在的主要问题之一。由于潜伏污染的细菌携带量往往不大，并且存在隐蔽性，因此，研发开发一种快速高效的杂菌探测提取和培养检测的方法，是当前食用菌生产中迫切期待解决的问题。
本发明目的是，针对目前食用菌生产行业中食用菌菌种易被细菌潜伏污染，而又缺乏检测防控有效方法的问题，提供一种能快速高效探测提取潜伏细菌的方法；二是提供一种能快速高效对提取物进行是否含细菌潜伏污染的培养检测方法，以保障食用菌菌种的纯度与质量，为食用菌的优质、稳产、高产提供技术支持。本发明目的通过以下技术方案来实现一种用于检测食用菌菌种潜伏污染细菌的探测取样棒，该探测取样棒由棒体、凹孔或凹槽、手柄组成；其中，棒体由竹、木、塑料或钢材制备而成，其长度较插入取样的食用菌菌种袋或食用菌菌种瓶长60mm，其下端为圆钝角，上端稍扁大为手柄；竹、木或塑料质棒体的直径为5-6mm，该棒体自距下端10_15mm处开始至离手柄端6cm处为止，每间隔20mm冲制一直径为1. 5-2mm、深0. 5_lmm的凹孔；钢质棒体其直径为2_3mm，棒体上按同上方法冲制深0. 3-0. 4mm、宽0. 4-0. 5mm的倒刺状凹槽。—种检测食用菌菌种潜伏污染细菌的液体培养基，该培养基的组分与各组分在每升中的克含量为玉米芯0-150 g麸皮50-120 g麦芽粉0-30 g牛肉膏3.0-6.0 g蛋白胨1.5-12.0 g氯化钠2.0-5.0 g酵母膏0.5-1.8 g磷酸二轻钾0.1-0.5 g硫酸镁0.1-0.5 g水1000 ml；配制时，先将非溶性的玉米芯、麸皮与麦芽粉称量、煮汁、过滤后，再加入其余可溶性组分，经加热溶解、过滤、定容至1000ml、分装、灭菌、冷却而成；一种优化的检测木腐型金针菇、杏鲍菇、海鲜菇、秀珍菇、香菇及黑木耳食用菌菌种潜伏污染细菌的液体培养基，其组分与各组分在每升中的克含量为玉米芯120 g麸皮95 g牛肉膏5.0 g蛋白胨7.0 g氯化钠3.5 g酵母膏1.6 g磷酸二轻钾0.3 g硫酸镁0.2 g水1000 ml。
一种优化的检测草腐型双孢蘑菇及双环蘑菇食用菌菌种潜伏污染细菌的液体培养基，其组分与各组分在每升中的克含量为
麦芽粉20 g麸皮95 g牛肉膏5.0 g蛋白胨7.0 g氯化钠3.5 g酵母膏1.6g
磷酸二轻钾0.3 g硫酸镁0.2 g水1000 ml。
所述的麦芽粉是由小麦发芽至芽长30_40mm，经烘/晒干后磨碎成粉而制成。
食用菌菌种潜伏污染细菌的检测方法，该方法按如下步骤进行
(1)检测食用菌菌种潜伏污染细菌液体培养基的制备按上述的液体培养基的配方称取麸皮、玉米芯或麦芽粉，在IOOOml水中煮沸，文火煮15分钟后过滤，取滤汁后加入配方中的其它组分，加热搅拌至溶解，过滤后加水定容至1000ml，分装入IOOml三角瓶中至每瓶50ml，经高压灭菌、冷却后备用；
(2)食用菌菌种的探测取样与接种按食用菌菌种批次，根据批量大小随机抽取 5-10瓶或袋的食用菌菌种，在超净台、接种箱或无菌室内，每个食用菌菌种瓶或袋分别用5 根经灭菌的检测食用菌菌种潜伏污染细菌的探测取样棒，在瓶或袋口按梅花形5个点，垂直插入至底部，拔出后用无菌水IOml将探测取样棒的凹孔或凹槽处所携带的培养物料，分别冲洗到步骤(1)三角瓶内的液体培养基中；
(3)对照设置取步骤(1)6个装有液体培养基、灭菌后的三角瓶，其中，3个三角瓶按步骤(2)相同操作程序对无菌基质进行探测取样和接种，作为操作校正对照组；另3个三角瓶作为空白对照组；
(4)培养与检测将步骤( 接种后的三角瓶和步骤(3)2组对照三角瓶置摇床， 在条件下培养16-1 ，观测比较培养液清浊度、细菌生长情况；
(5)对食用菌菌种潜伏污染细菌的观测与判定对培养后的三角瓶作如下的观测凡步骤( 接种后的三角瓶培养液见有细菌繁殖变混浊，而操作/空白两对照组培养液仍保持清纯、未见细菌生长，则可判定该批食用菌菌种存在有细菌的潜伏污染，不能作菌种使用；凡步骤( 接种后的三角瓶培养液和操作/空白两对照组培养液均有细菌繁殖变混浊，则可能是操作过程污染所至，需进行重新取样、重复检测；
所述的食用菌为金针菇、杏鲍菇、秀珍菇、海鲜菇、蘑菇、香菇和黑木耳中的任选一种。
本发明的有益效果
一、提供的食用菌菌种探测取样棒设计合理，在无菌操作规程下使用，不仅可有效探测提取到所需的检测样品，如所检菌瓶(袋)无细菌潜伏污染，也不影响抽检后食用菌菌种的活力，并可正常使用；
二、用于检测食用菌菌种潜伏污染细菌的液体培养基，检测培养快速高效，一般较常规方法能提前池可培养检测出是否携带微量的潜伏污染细菌(见实施例9)；
三、设立操作对照和空白对照可有效避免灭菌和操作过程污染所造成的误判，提高了检测结果的准确性；
四、通过本发明的检测，不仅能提前检测明确所涉食用菌菌种是否含有潜伏污染细菌，而且对常见的5种污染细菌均为有效，从而可有效地防止含有潜伏污染细菌的食用菌菌种，用于扩繁下一级食用菌菌种或用于生产栽培出菇的菌瓶(包)，以免导致产量与质量的下降，造成严重的经济损失，是一项保证食用菌生产实现优质、稳产、高产的重要技术 (见实施例7、8、9、10)。


图1竹/木/塑质探测取样棒结构示意图
其中，1棒体、2凹孔、3手柄
图2钢质探测取样棒结构示意图
其中，1棒体、2凹槽、3手柄
通过以下实施例并结合附图对本发明作进一步的详细说明，但本发明的内容并不局限于此。
以下实施例所涉及的金针菇品种为“江山白菇”(国品认菌2008045)、杏鲍菇品种为“杏鲍菇1号”(国品认菌2008058)；
玉米芯粉碎至颗粒直径为5_8mm。
实施例1 (竹质或木质探测取样棒的制作)
一种用于检测食用菌菌种潜伏污染细菌的探测取样棒，该探测取样棒由棒体1、凹孔2、手柄3组成；其中，棒体1由竹材制备而成，其长度较插入取样的食用菌菌种袋或食用菌菌种瓶长60mm，其下端为圆钝角，上端稍扁大为手柄3 ；其直径为5_6mm，该棒体自距下端 10-15mm处开始至离手柄端6cm处为止每间隔20mm冲制一直径为1. 5_2mm、深0. 5-lmm的凹孔2(如图1所示)；放入密闭容器进行高压灭菌后备用。木质探测取样棒可与此相同方法制备。
实施例2 (钢质探测取样棒的制作)
该例中，探测取样棒的棒体1由钢材制备而成，其直径为2_3mm，棒体上冲制深 0. 3-0. 4mm、宽0. 4-0. 5mm的倒刺状凹槽2 ；其余结构、步骤工艺同于实施例1。
实施例3 (检测食用菌菌种潜伏污染细菌液体培养基制备1)
该培养基的组分与各组分在每升中的含量(g/L)为
玉米芯150 g麸皮50 g麦芽粉30 g牛肉膏3.0 g蛋白胨1.5 g氯化钠2.0 g酵母膏1.8 g磷酸二轻钾0.5 g硫酸镁0.1 g水1000 ml
制备方法如下按配方称取经粉碎至颗粒直径为5_8mm的玉米芯和麸皮及由小麦发芽至芽长30-40mm，经烘/晒干后粉碎而制成的麦芽粉，在IOOOml水中煮沸，再文火煮15 分钟后过滤，取滤汁加入配方中的其它组分，加热搅拌至溶解，过滤后加水定容至1000ml， 分装入IOOml三角瓶中，每瓶分装50ml，经高压灭菌、冷却后备用。
实施例4 (检测食用菌菌种潜伏污染细菌液体培养基制备2)
该培养基的配方组分与各组分在每升中的含量(g/L)为
玉米芯120 g麸皮95 g牛肉膏5.0 g蛋白胨7.0 g氯化钠3.5 g酵母膏1.6 g磷酸二轻钾0.3 g硫酸镁0.2 g水励Oml
制备方法如下按配方称取经粉碎至颗粒直径为5_8mm的玉米芯和麸皮，在 IOOOml水中煮沸，再文火煮15分钟后过滤，取清纯滤汁加入配方中的其它组分，加热搅拌至溶解，过滤后加水定容至1000ml，分装入IOOml三角瓶中，每瓶分装50ml，经高压灭菌、冷却后备用。
实施例5 (检测食用菌菌种潜伏污染细菌液体培养基制备3)
该培养基的配方组分与各组分在每升中的含量(g/L)为
麦芽粉20 g麸皮95 g牛肉膏5.0 g蛋白胨7.0 g氯化钠3.5 g酵母膏1.6 g磷酸二轻钾0.3 g硫酸镁0.2 g水 1000 ml
制备方法如下按配方称取麸皮和由小麦发芽至芽长30_40mm，经烘/晒干后粉碎而制成的麦芽粉，在IOOOml水中煮沸，再文火煮15分钟后过滤，取清纯滤汁加入配方中的其它组分，加热搅拌至溶解，过滤后加水定容至1000ml，分装入IOOml三角瓶中，每瓶分装 50ml，经高压灭菌、冷却后备用。
实施例6 (检测食用菌菌种潜伏污染细菌液体培养基制备4)
该培养基的组分与各组分在每升中的含量(g/L)为
玉米芯75 g麸皮120 g麦芽粉IOg牛肉膏6.0 g蛋白胨12.0 g氯化钠5.0 g酵母膏0.5 g磷酸二轻钾0.1 g硫酸镁0.5 g水IOOOml
制备方法同实施例3。
实施例7 (金针菇菌种潜伏污染细菌的检测)
对浙江省农业科学院试验场金针菇食用菌菌种(食用菌菌种瓶容量900ml，瓶高 170mm，瓶口内径75mm)进行潜伏污染细菌的检测，按如下步骤进行
(1)液体培养基的制备按实施例4 (即优化1)的配方与方法制备而成；
(2)金针菇菌种的探测取样与接种随机抽取同一批次的金针菇菌种5瓶(编号为JA JE)，在超净台上按无菌操作规程打开每个金针菇菌种瓶，分别用5根实施例2的经灭菌的钢质探测取样棒，在瓶口按梅花形5个点(编号为1 幻，垂直插入至该瓶培养物料的底部，拔出后用无菌水IOml将探测取样棒凹槽处所携带的培养物料，分别冲洗到步骤 (1)三角瓶内的液体培养基中(编号为JAl JE5)；
(3)对照设置另取步骤(1)6个装有液体培养基灭菌后的三角瓶，其中，3个三角瓶按步骤(2)相同操作程序对无菌培养物料进行探测取样和接种，作为操作校正对照组 (编号为OA 0C)；另3个三角瓶作为空白对照组(编号为CKl CK3)；
(4)培养与检测将步骤( 接种后的三角瓶和步骤( 2组对照校正三角瓶均置于摇床内，在条件下培养16-1他，观测比较培养液的清浊度和细菌生长情况；
(5)金针菇食用菌菌种潜伏污染细菌的判定步骤( 接种后的三角瓶和步骤 (3) 2组对照校正三角瓶均呈现清纯、未见细菌生长，可判定该批金针菇菌种无细菌潜伏污^fe ο
实施例8 (杏鲍菇菌种潜伏污染细菌的检测)
对浙江武义海兴菇业有限公司杏鲍菇菌种(食用菌菌种袋规格 18X38X0. 0053cm，袋料高18-20cm)进行潜伏污染细菌检测，按如下步骤进行
(1)液体培养基的制备按实施例5 (即优化幻的配方与方法制备而成；
(2)杏鲍菇菌种的探测取样与接种随机抽取2010年12月12日生产的同批次杏鲍菇菌种5袋(编号为XA XE)，在超净工作台上按无菌操作规程打开每个菌种袋口，并分别用5根实施例1的经灭菌的竹质探测取样棒，在袋口按梅花形5个点(编号为1 5)，垂直插入至该袋培养物料的底部，拔出后用无菌水IOml将探测取样棒凹孔处所携带的培养物料，分别冲洗到步骤(1)三角瓶内的液体培养基中(编号为XAl XE5)；
(3)对照设置另取步骤(1)6个装有液体培养基灭菌后的三角瓶，其中，3个三角瓶按步骤(2)相同操作程序对无菌培养物料进行探测取样和接种，作为操作校正对照组 (编号为OA 0C) ’另3个三角瓶作为空白对照组(编号为CKl CK3)；
(4)培养与检测将步骤( 接种后的三角瓶和步骤( 2组对照校正三角瓶均置于摇床内，在条件下培养16-1他，观测比较培养液的清浊度和细菌生长情况；
(5)对杏鲍菇菌种潜伏污染细菌的判定2个对照校正组培养液均呈现清纯、未见细菌生长；共有3个从杏鲍菇菌种袋中取样、接种的三角瓶培养液出现混浊、有细菌生长， 其编号分别为XB3、XDl和》)4，表明所抽取的5袋杏鲍菇菌种中有2袋菌种存在潜伏的细菌污染，因此该批杏鲍菇菌种宜弃之不用，或再经严格检测后才能使用。
实施例9 (本发明方法与常规检查方法的比较试验)
试验地点龙泉市双益菇业有限公司
试验时间2011年6月至9月
试验菌种为“雪秀1号”[浙(非)审2009001]
试验设计各设三个不同批次重复，每批次15600瓶，常规检查方法为先用肉眼观察检查杂菌污染和菌丝生长情况，剔除污染菌瓶和菌丝生长异常菌瓶；在肉眼观察检查基础上，采用本发明的方法对外观生长正常的菌瓶进行潜伏污染检测，本发明试验中的“食用菌菌种潜伏污染细菌探测取样与接种”以及“潜伏污染细菌培养、检测与判定”方法同实施例7、8。与常规取样、接种及常规细菌培养液检测进行比较。常规细菌培养液配方为牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，水1000ml，pH7. 2。对检测出潜伏污染的批次食用菌菌种宜弃之不用，或经严格检测后使用。试验结果如下表1:
表1本发明方法与常规检查方法的对比试验


本发明公开了一种食用菌菌种潜伏污染细菌的检测方法，属于食用菌栽培技术领域。其中包含探测取样棒、液体培养基及检测方法，该方法由液体培养基的制备；食用菌菌种的探测取样与接种；操作校正及空白对照设置；对潜伏污染细菌的观测与判定等步骤组成。本方法设计合理，较常规方法能提前2h可培养并检测出是否携带微量的潜伏污染细菌；可有效防止含有潜伏污染细菌的食用菌菌种，用于扩繁下一级食用菌菌种或用于生产栽培，可避免产量、质量的下降，造成经济损失。本发明可在食用菌菌种生产地区或企业推广应用。