专利名称：一种好氧条件下筛选非光合高效固碳微生物的方法CO2引发的“温室效应”所造成的气候变暖是当前全球面临的重大环境问题。根据IPCC第4次评估报告指出在最近的一个十年期(1995 2004年)，CO2当量排放的增加速率(每年9. 2亿吨CO2当量)比前一个十年期(197(Γ1994年)的排放速率(每年4. 3亿吨CO2当量)高得多。中国的“十二五规划建议草案”显示我国将CO2减排放在了相当重要的位置上。而在2010年末举行的坎昆会议上，中国承诺到2020年，单位国内生产总值(GDP) CO2排放将比2005年下降40%-45%。同时CO2又是地球上最丰富的碳资源，可将其转变为资源和能源。因此，CO2的固定在环境、能源、资源方面都具有重要的意义。当前，在考虑如何减排CO2的前提下，研究CO2的回收与固定，既能有效减少环境中游离的C02，又能将其再生为资源，因此已引起世界各国的广泛兴趣。CO2的固定主要有物理法化学法和生物法，而大多数物理法和化学法都必须接和生物法来最终固定co2。生物法固定CO2主要是依靠植物和自养微生物，传统上植物的光合作用较为重要也更为人所重视。但地球上存在各种各样的环境，在植物不能生长的特殊环境和场合(如干旱贫瘠的沙漠土壤和工业废气的捕集场合)，微生物所具有的环境适应性的优势便显现出来了，因此从整个生物圈的物质流和能量流来看，微生物固定CO2意义重大。目前公认具有较高固碳效率的微生物主要是光合微生物和化能自养细菌中的氢-氧化细菌。藻类等光合微生物由于在培养过程中，需要光照，以及其不耐热和高浓度CO2的特性，限制了其实际应用。而氢-氧化细菌虽然不用光照且生长范围较为宽泛，但其在生长过程中必须提供以高浓度氢气作为电子供体，因此普通环境条件难以符合其生长要求，同时在实际应用中，供氢气也存在严重的安全隐患。鉴于此，发掘不用光照与供氢的高效固碳微生物，对于实现普通环境条件下的微生物固碳(如土壤环境与吸收工业排放CO2的大型生物反应器中)具有重要意义。海洋在全球碳循环过程中有着重要地位，其每年要吸收2. OGt (lGt=109t)人为排放的CO2，海洋中固碳微生物的研究也一直是全球相关领域专家关注的焦点。为此，我们从全球多个海域(包括全球四大洋，数十个国家和地区)采集水土样品，通过分离筛选已获得了多个系列的不用光照与供氢的固碳微生物菌群。但是这些菌群只有在经过长时间的驯化(数个月甚至一年以上)，其固碳效率才会达到一个较高的水平，而且由于这些菌群是由多个菌种组成的，混合微生物尤其是混合自养微生物的菌种保藏是十分困难的，主要是菌种复苏后其固碳效率会有不同程度的下降，这些特点限制了非光合固碳微生物的工业应用，如果利用先使用氢气培养再用混合电子供体培养的方法，则可在短时间内(8天左右)从海水或海洋沉积物样品中筛选获得高效的非光合固碳微生物，从而有效解决这些问题，有利于进一步增强非光合固碳微生物菌群在实际应用中潜在的经济效益和社会效益。
本发明的目的在于为克服现有技术的缺陷而提供一种好氧条件下筛选非光合高效固碳微生物的方法。为实现上述目的，本发明所采用的技术方案是一种好氧条件下筛选非光合高效固碳微生物的方法，包含如下步骤(I)配制自养微生物的培养基；然后在上述培养基中再加入微量兀素溶液；(2)向步骤(I)中得到的含微量元素的培养基中加入海水或海洋沉积物，将含有 的混合固碳菌种的海水或海洋沉积物在好氧条件下使用氢气培养，得到混合固碳菌种的菌液；( 3 )配制电子供体浓缩液；(4)将步骤(3)中制得的电子供体浓缩液加入到步骤(I)中制得的含微量元素的培养液中；(5)向步骤(4)得到培养基中加入步骤(2)培养得到的混合固碳菌种的菌液，在好氧条件下培养。所述的步骤(I)中自养微生物的培养基包含以下组分0.5-1.0g/L KH2PO4,I. 0-2. 0g/LK2HP04、0. l-o. 2g/L MgSO4 · 7H20、10_30g/LNaCl、O. 001-0. Olg/L CaCl2,0. 0036mmol-0. 036mmol/L 亚铁离子和 0· 0075-0. 075mol/L NH4+ 离子。所述的亚铁离子来自FeSO4 · 7H20、FeSO4或FeCl2。所述的NH4+离子来自(NH4) 2S04 或 NH4Cl。所述的微量元素溶液包含I. 68mg/LNa2Mo04 · 2Η20、0· 4mg/LH3B03、I. Omg/LZnSO4 · 7Η20、1· 0mg/LMnS04 · 5Η20、7· 0mg/LCuS04 · 5Η20、1· 0mg/LCoCl2 · 6Η20 或 I. Omg/LNiSO4 · 7Η20中的一种以上。所述的步骤(I)中，每升培养液中加入2ml微量元素溶液。所述的步骤(2)的好氧条件下使用氢气培养为气体中氧气含量为5-20%，氧气含量优选10%，二氧化碳含量大于0%，二氧化碳含量优选5-30%，进一步优选二氧化碳的含量为10%，氢气含量为50-90%，氢气含量优选80% ;培养时间为4-8天。所述的步骤(2)中，海洋沉积物是海洋沉积作用所形成的海底沉积物的总称，海水 的加入量为25-75mL/L ;海洋沉淀物用量以海洋沉淀物稀释液计，为25_50mL/L ;海洋沉淀物稀释液为海洋沉淀物与无菌水制得的O. lg/L的稀释液。所述的步骤(3)中电子供体选自亚硝酸盐、硫代硫酸盐及硫化物中的一种或一种以上。所述的亚硝酸盐选自NaNO2或KNO2。所述的硫代硫酸盐选自Na2S2O3或K2S2O3。所述的硫化物选自Na2S或K2S。所述的步骤(3)中，电子供体浓缩液中每种电子供体的浓度为80_200mg/mL。所述的步骤(4)中混合电子供体的用量为，l_15g/L亚硝酸盐，l_15g/L硫代硫酸盐或l_15g/L硫化物。所述的步骤(5)中的好氧条件为气体中氧气含量为5-25%, 二氧化碳含量大于0%，二氧化碳含量优选5-30%，进一步优选二氧化碳的含量为20%，培养时间为4-8天。所述的步骤(5)中，每IL步骤(4)得到的培养基中加入25_75mL步骤(2)得到的菌液。本发明的有益效果在于在有氢气的条件下，先从海水或海洋沉积物中筛选得到非光合固碳微生物，再利用由亚硝酸盐、硫代硫酸盐及硫化物组成的混合电子供体系统，培养筛选得到非光合固碳微生物，最后可以得到有较高固碳效率的非光合固碳微生物；经实验表明，使用本发明方法所获得的固碳微生物的固碳效率要比连续使用氢气或混合电子供体筛选得到的固碳微生物分别高出210%和100%。本发明方法所获得的固碳微生物的固碳效率可达853mg C02/L。表明该方法可在短时间内筛选获得高效的非光合固碳微生物，可有效应用于固定CO2的过程中，从而实现对CO2的资源化。本发明还具有工艺简单、可操作性强和具有一定经济效益的优点。 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。实施例I(I)配制培养自养微生物的培养基培养基配方如下(g/L): KH2PO4 (1.0) ; K2HPO4 (2. O) ; MgSO4 · 7H20 (O. 2) ; NaCl (20)和CaCl2(O. 01) ； (NH4)2SO4(O. 038mol/L) ；FeS04 · 7H20(0. 0036mmol/L);在每升上述培养基中再加入2mL的微量元素溶液；微量元素溶液选自包含Na2MoO4·2Η20(1· 68) ;H3BO3(O. 4) ; ZnSO4 ·7Η20(1· O) ;MnSO4 ·5Η20(1. O) ; CuSO4 · 5Η20(7· O) ; CoCl2 · 6Η20(1. O)和 NiSO4 · 7Η20(1· O)，浓度以 mg/L 计；(2)向步骤(I)得到培养基中加入来自澳大利亚、日本或泰国沿海的海洋沉淀物稀释液；加入量为每IL培养基加25mL海洋沉淀物稀释液(海洋沉淀物稀释液为海洋沉淀物与无菌水制得的O. lg/L的稀释液。)，在好氧条件下使用氢气培养4天，得到混合固碳菌种的菌液；其中，其中混合气体由氢气、氧气和二氧化碳组成，其中氢气氧气二氧化碳=80:10:10，体积比；(3)分别单独配制之后作为电子供体的NaNO2, Na2S2O3和Na2S的浓缩液，其浓度分别为 80mg/mL ；(4)按照 5. Og/L NaNO2, 5. Og/L Na2S2O3 和 12. 5g/L Na2S 的用量向步骤(I)得到的培养基中加入步骤(3)得到的电子供体浓缩液；(5)将步骤(2)培养4天后得到的固碳微生物菌种的菌液接种于步骤(4)得到培养基中，接种量为每IL培养基加25mL步骤(2)得到的菌液，并在好氧条件下培养4天，其中混合气体由空气和二氧化碳组成，其中空气二氧化碳=90:10，体积比。实施例2(I)配制培养自养微生物的培养基。培养基配方如下(g/L) :KH2PO4 (I. O);K2HPO4 (2. O) ; MgSO4 · 7H20 (O. 2) ; NaCl (20)和 CaCl2 (O. 01) ； (NH4)2SO4 (O. 038mol/L)；FeSO4 · 7H20(0. 0036mmol/L)在每升上述培养基中再加入2mL的微量元素溶液。微量元素溶液选自包含Na2MoO4·2Η20(1· 68) ;H3BO3(O. 4) ; ZnSO4 ·7Η20(1· O) ;MnSO4 ·5H20(1. 0) ; CuSO4 · 5Η20(7· 0) ; CoCl2 · 6H20(1. 0)和 NiSO4 · 7Η20(1· 0)，浓度以 mg/L 计；(2)向步骤(I)得到培养基中加入来自南极或北极海域的海水，加入量为每IL培养基加25mL海水样，在好氧条件下使用氢气培养4天，得到混合固碳菌种的菌液；其中，其中混合气体由氢气、氧气和二氧化碳组成，其中氢气氧气二氧化碳=80:10:10，体积比。(3)分别单独配制之后作为电子供体的NaNO2, Na2S2O3和Na2S的浓缩液，其浓度分别为 160mg/mL ；(4)按照 4. 6g/L NaNO2, 5. Og/L Na2S2O3 和 12. Og/L Na2S 的用量向步骤(I)得到的培养基中加入步骤(3)得到的电子供体浓缩液；(5)将步骤(2)培养4天后得到的固碳微生物菌群接种于步骤(4)得到培养基中，接种量为每IL培养基加25mL步骤(2)得到的菌液，并在好氧条件下培养4天，其中，其中混合气体由空气和二氧化碳组成，其中空气二氧化碳=90:10，体积比。 实施例3(I)配制培养自养微生物的培养基。培养基配方如下(g/L) :KH2PO4 (I. O);K2HPO4 (2. O) ; MgSO4 · 7H20 (O. 2) ; NaCl (20)和 CaCl2 (O. 01) ； (NH4)2SO4 (O. 038mol/L)；FeSO4. 7H20(0. 0036mmol/L)在每升上述培养基中再加入2mL的微量元素溶液。微量元素溶液选自包含Na2MoO4 ·2Η20(1· 68) ; H3BO3 (O. 4) ; ZnSO4. 7Η20(1· O) ; MnSO4 ·5Η20(1. O) ; CuSO4 · 5Η20(7· O) ; CoCl2 · 6Η20(1. O)和 NiSO4 · 7Η20(1· O)，浓度以 mg/L 计；(2)向步骤⑴得到培养基中分别加入来自中国青岛、上海、厦门、海南、澳大利亚、泰国普吉、日本仙台、法国加莱、巴布亚新几内亚、南极和北极海水样品，加入量为每IL培养基加25mL海水样，在好氧条件下使用氢气培养4天，得到混合固碳菌种的菌液；其中，其中混合气体由氢气、氧气和二氧化碳组成，其中氢气氧气二氧化碳=80:10:10，体积比；(3)分别单独配制之后作为电子供体的NaNO2, Na2S2O3和Na2S的浓缩液，其浓度分别为 160mg/mL ；(4)按照 4. 6g/L NaNO2, 5. Og/L Na2S2O3 和 12. Og/L Na2S 的用量向步骤(I)得到的培养基中加入步骤(3)得到的电子供体浓缩液；(5)将步骤⑵培养4天后得到的固碳微生物菌群通过离心收集并混合，制成微生物菌体浓缩液后接种于步骤(4)得到培养基中，其接种量为每IL培养基加入75mL菌液，并在好氧条件下培养4天，其中，其中混合气体由空气和二氧化碳组成，其中空气二氧化碳=90:10,体积比。实施例中，均先在好氧条件下使用氢气培养4天(以下简称第一培养周期)，之后再在好氧条件下用混合电子供体培养4天(以下简称第二培养周期)，为研究该筛选过程中所获得的非光合固碳微生物的固碳效率，取经过第二培养周期的样品，测其培养液中总有机碳浓度，由于初始培养基总有机碳浓度为0，且在培养过程中微生物可以利用的碳源只有CO2这个无机碳源，所以培养基中增加了的总有机碳量都是来自于微生物将CO2固定所得。实施例I的结果表明，分别筛选自3个海域的非光合固碳微生物，其固碳效率平均为58gC-g-1菌体^cT1,对比使用公认的最佳电子供体H2筛选得到的非光合固碳微生物(两个培养周期内均以H2培养，而不加混合电子供体)，以及用混合电子供体筛选得到的非光合固碳微生物(两个培养周期内均以混合电子供体培养，而不加H2),本发明的效果要分别高出230%和130%。实施例2的结果中，选取南极或北极海域的海水样品，使用本发明的方法筛选得到的非光合固碳微生物，其固碳效率要比连续使用氢气或混合电子供体筛选得到的固碳微生物分别高出210%和100%。实施例3的结果中，第二个培养周期后所获得的非光合固碳微生物在4天内固定的CO2量达到了 853mg/L。上述实施例表明，经过本发明的方法，可在短时间内获得有较高固碳效率的非光合固碳微生物。综上可见，该方法工艺简单，可操作性强，而且对于来自全球4大洋十多个海域的海水或海洋沉积物样品均有效，说明该方法对于短时间内筛选获得非光合高效固碳微生物具有普遍性，可有效利用于微生物固定CO2的过程中，从而实现对CO2的资源化。上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和应用本发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于这里的实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。


本发明涉及微生物固定CO2领域，涉及一种好氧条件下筛选非光合高效固碳微生物的方法。其包含如下步骤(1)配制自养微生物的培养基；然后加入微量元素溶液；(2)向步骤(1)得到含微量元素的培养基中加入海水或海洋沉积物，将含有的混合固碳菌种的海水或海洋沉积物好氧条件下使用氢气培养，得到混合固碳菌种的菌液；(3)配制电子供体浓缩液；(4)将步骤(3)中制得的电子供体浓缩液加入到步骤(1)中制得的含微量元素的培养液中；(5)向步骤(4)得到培养基中加入混合固碳菌种的菌液，在好氧条件下培养。本发明提供的方法可有效促进非光合固碳微生物的固碳效率；本发明还具有工艺简单、可操作性强和具有一定经济效益的优点。