专利名称：由血浆microRNA组合成的肝癌诊断标志物及一种诊断肝癌的新方法肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)是世界范围内最常见的实体恶性肿瘤之一。其代表了肝癌的主要组织学类型，可能占所有肝癌病例的70%-85%。世界每年会出现大约600000个新病例，和几乎相同数目的死亡病例，这反映出对这种疾病缺乏有效的早期诊断和治疗(Thorgeirsson, S. S. and Grisham, J. ff. (2002) Nat Genet 31, 339-346 ;Jemal A et al. (2011)CA Cancer J Clin 61 :69-90. ；Bosch F. X. et al(2004)Gastroenterology 127, S5-S16 ；Perz J. F. et al. (2006)J Hepatol 45,529-538)。肝细胞癌是一类预后很差的癌症。此种疾病患者的预后取决于疾病分期。HCC患者未经手术治疗，5年生存率为< 5%，手术后生存率为60% -70%。肿瘤尺寸< 2cm且采用外科手术切除的患者的5年生存率能够达到86%。但是，没有经过任何治疗的早期癌症患者(肿瘤尺寸<5cm)的3年生存率仅为17-21%。这证明了早期癌症检测对于治疗以及提高患者生存率都是非常重要的。(Tang,Z. Y. (2001)fforld J Gastroenterol 7,445-454 ；Chambers, A. F. et al. (2002)Nat Rev Cancer 2,563-572 ;Motola_Kuba D. et al. (2006)Annalsof Hepatology 5,16-24)。一个明确的肝癌诊断经常以组织学确认为基础。组织可以通过针穿刺或活检来取样。一些肝癌分化良好，这意味着它们几乎完全由生长的、成熟的肝细胞组成。因此，这些癌症在显微镜下看起来非常类似于非肝癌组织。此外，并非所有的病理学家都能够识别分化良好的肝癌和正常肝组织的细微差别。一些病理学家会把肝癌误认为肝腺癌。腺癌是一种不同类型的癌症，它从肝外起源。转移性腺癌和原发性肝癌治疗方法不同，因此，需要早期检测以区分这些不同类型的肿瘤，指导HCC患者的治疗，以改善患者长期生存率。肝穿刺或活检的最常见风险是出血，因为肝癌是含血管非常丰富的肿瘤。在许多情况下，可能没有必要进行组织活检或穿刺。如果患者具有发生肝癌的危险因素(例如，肝硬化，慢性乙型肝炎，或慢性丙型肝炎)，血浆中α-甲胎蛋白(AFP)的水平显著升高，并且有相符合的影像学诊断，医生几乎可以不通过活检就能确定病人患有肝癌。目前，AFP是唯一的用于早期诊断肝癌的血清标志物(Mizejewski,G. J. (2003)Expert Rev AnticancerTher 2,709-735 ；Paul, S. B. et al. (2007) Oncology 72，Suppl. 1，117-123)。然而，这种单一的标志物灵敏度低，且经常出现假阳性结果，例如在大量的肝硬化患者中，AFP也会升高。此外，血清AFP仅能检测出60%的肝癌患者。因此，发现早期诊断HCC的新的分子标志物以及开发灵敏的检测方法具有重要意义。巴塞罗那临床肝癌(BCLC)分期(Llovet,J. Μ. (2003) Lancet 362,1907-1917)是最近几年出现的，用于HCC患者的临床分期。BCLC分期将肿瘤的发展阶段与推荐的治疗策略联系起来，并定义了每个肿瘤分期的护理标准(Llovet, J. Μ. (2008) J Natl CancerInst100,698-711)。极早期HCC患者(O期)最适合做手术切除。早期HCC患者(A期)最适合做放疗(肝肿瘤切除、肝移植或局部消融)。中期HCC患者(B期)适合做肝动脉化学栓塞(TACE)。而中晚期HCC患者(C期)可用索拉菲尼治疗。终末期(D期)患者可接受对症治疗。microRNA (mi RNA)是一类小的内 源性非编码RNA分子，大小为20-25个核苷酸(nt),这些小的miRNA通常祀向一个或者多个mRNA,通过翻译水平的抑制或断裂祀标mRNAs而调节基因的表达。它们大约在10年前被发现，已被认为在细胞发育、分化、增殖和凋亡中发挥重要作用(Bartel, D. P. (2004)Cell 116,281-297, Ambros, V. (2004)Nature 431，350-355 ；He,L. et al. (2004) Nat Rev Genet 5,522-531)。miRNA 比 mRNA 在作为肿瘤生物标志物方面具有更大的优势，因为它们在体外非常稳定(Lu，J. et al.，(2005)Nature 435，834-838；Lim,L.P.et al. , (2005)Nature 433,769-773)。miRNA 是从初级转录物(pri-miRNA)产生的，pri-miRNA 被 RNase III Drosha 加工为含莖_环结构的前体miRNA(pre-miRNA)。接着，在Dicer (—种RNase III)的作用下，发夹状的Pr e-mi RNA在细胞质中进一步被切割产生成熟的mi RNA，这些成熟的mi RNA与其他蛋白质一起组成miRNA-蛋白质复合体(miRNP)。miRNA引导miRNP到达它们的革巴mRNA，在此它们发挥各自的功能(综述参见例如Bartel，D. P. (2004) Cell 23，281-292 ;He，L. andHannon, G. J. (2004)Nat. Rev. Genet. 5,522-531)。根据miRNA与其靶mRNA之间的互补性程度，miRNA可以指导不同的调节过程。那些与miRNA高度互补的靶mRNA通过与RNA干扰(RNAi)相同的机制被特异降解。因此，在这种情况下，miRNA是担当小干扰RNA(siRNA)的角色；与miRNA互补性较低的祀mRNA被引导进入细胞降解途径，或者在蛋白质翻译上平上被阻遏而mRNA水平不受影响。但是，目前miRNA抑制其靶mRNA翻译的机制尚有争议。高通量microRNA定量技术(如microRNA微阵列)，是以实时定量PCR为基础的microRNA检测，为研究癌症基因组中microRNA表达谱提供了有力的工具。可获得的现有数据表明miRNA表达失调可能与某种癌症的发生和/或发展相关。例如，研究表明hsa-miR-15及hsa-miR-16-l均定位在慢性淋巴性白血病(CLL)中缺失的遗传基因座上，在大约70%的CLL患者中,这两种microRNA基因缺失或下调。另外,在结肠癌中has-miR-143及has-miR-145表达下调;而miRNA let-7的表达在肺癌中经常降低(Michael, Μ. Z. etal. (2003)MolCancer Res 1,882-891 ；Mayr, C. et al. (2007)Science 315,1576-1579)。事实上，常见癌症经常存在相关microRNA表达改变，而且microRNA通常定位于与癌症相关的基因组区域，因此可以推测miRNA可能发挥着抑癌基因和癌基因的双重作用(Esquela-Kerscher,A. and Slack, F. J(2006)Nat Rev Cancer 6, 259-269 ;Calin, G. A. andCroce, C. M. (2007)J Clin Invest 117，2059-2066 ；Blenkiron, C. and Miska, E. A. (2007)Hum Mol Genetl6, R106-R113)。已证实的microRNA在人类癌症中的异常表达更突出了它们作为诊断和预后生物标志物的潜在应用价值。迄今为止，已有学者报导了人肝细胞癌中microRNA表达谱(Murakami, Y. etal. (2006)Oncogene 25,2537-2545 ；Li, ff. et al. (2008)Int J Cancer 123,1616-1622 ；Huang, Y. S. et al. (2008)Hepatology 23,87-94 ；Ladeiro, Y. et al. (2008)Hepatology47,1955-1963 Jiang, J. et al. (2008)Clin Cancer Res 14,419-427)。这些研究均表明，与正常肝细胞或组织相比，特定的microRNA在恶性细胞或组织中存在异常表达。因此，它们有助于更深刻理解肿瘤恶性转化和发展的过程。在诸多类型的标本中，由于血液容易获取，临床操作简单、创伤小，患者所受的风险及痛苦小，被认为最适合用于筛选高危人群，以其早期发现、诊断和治疗肿瘤患者。来源于肿瘤的microRNA已被证明在人类血浆或血清中以非常稳定的形式存在，免受内源RNase酶活性的影响。这些在血清或血浆中的来源于肿瘤的microRNA足以被检测到，可以作为肿瘤生物标志物。此外，由于血浆和血清的microRNA水平密切相关，血浆或血清中的microRNA都可以作为肿瘤诊断标志物，而应用于临床(Mitchell, P. S. et al. (2008)ProcNatl AcadSci USA 105，10513-10518 ;Gilad，S. et al. (2008)PLoS ONE 3，e3148 ；Chen,X. et al. (2008)Cell Res 18,997-1006)。最近，有三个研究报道了 HCC患者中的血清microRNA。Qu等(Qu，KZ. etal (2011) JClin Gastroenterol 45:355-60)研究了血清 hsa-miR-16、hsa-miR-195 以及 hsa-miR-196a在283个样本上的诊断价值,发现hsa-miR-16具有最好的诊断效能,灵敏度和特异性分别为 72. I %和 88. 8%。Xu 等(Xu, J. et al (2011)Molecular Carcinogenesis50 :136-42)发现了血液中 hsa-miR-21、hsa-miR-122 和 hsaiiR-223 是区分 HCC 和健康个体的潜在标志物。然而，这些microRNA不能区分HCC和乙肝患者。Li等(Li，LM. et al(2010)Cancer Res 70,9798-807)报道了血清microRNA显著的诊断价值，hsa-miR-375的灵敏度和特异性分别为96%和100%，hsa-miR-375、hsa-miR-25以及hsa-let_7f联合应用后，灵敏度和特异性分别为97. 9%和99. 1%。以上结果提示，血清microRNA诊断HCC是可行的，但是这些研究存在诸多缺陷，如用于筛选的miCToRNA数目有限，样本量小或缺少独立的验证。因此，仍然有必要在HCC患者的血衆或血清中发现有诊断价值的microRNA生物标志物。通过多个microRNA生物标志物联合应用可以快速、准确、低成本的早期诊断HCC患者。
本发明的第一个目的是提供一个新的肝细胞癌(特别是早期肝细胞癌BCLC O期和A期)的诊断标志物，从而提供一种新的肝细胞癌诊断方法。本发明的第二个目的是提供一种用于诊断肝细胞癌(特别是早期肝细胞癌BCLCO期和A期)的试剂盒。本发明的第三个目的是提供一种用于区分肝细胞癌患者的血浆和健康人的血浆的试剂盒。本发明的第四个目的是提供一种用于区分肝细胞癌患者的血浆与慢性乙肝患者的血浆的试剂盒。本发明的第五个目的是提供一种用于区分肝细胞癌患者的血浆与肝硬化患者的血浆的试剂盒。本发明的第六个目的是提供一种确定肝癌诊断标志物的方法。这些及其它的目的通过以下描述将变得清楚，它们由独立权利要求的主题实现。本发明的一些优选实施方案由从属权利要求的主题限定。在第一方面，本发明公开了一种肝细胞癌诊断标志物，由多种核酸分子组成，每种核酸分子编码至少一个microRNA序列。在优选的实施方案中，所述的多种核酸分子包含至少一种编码至少一个microRNA序列的核酸分子，其在至少一种靶血浆中与在至少一种对照血浆中差异表达。在更加优选的实施方案中，所述的在至少一种靶血浆中与在至少一种对照血浆中差异表达的至少一种编码至少一个microRNA序列的核酸分子选自至少一种编码microRNA序列的核酸分子，其在至少一种靶血浆中的表达与在至少一种对照血浆中的表达相比被上调，以及至少一种编码microRNA序列的核酸分子,其在至少一种祀血衆中的表达与在至少一种对照血浆中的表达相比被下调。特别优选地，所述的在至少一种靶血浆中的表达与在至少一种对照血浆中的表达相比被上调的至少一种编码至少一个microRNA序列的核酸分子选自至少一种编码hsa-miR-801、hsa-miR_192或hsa-miR-21的核酸分子；且所述的在至少一种祀血衆中的表达与在至少一种对照血浆中的表达相比被下调的至少一种编码至少一个microRNA序列的核酸分子选自至少一种编码 hsa-miR-122、hsa-miR-26a、hsa_miR-27a 或 hsa-miR-223 的核 酸分子。在优选的实施方案中，所述的多种核酸分子还包含至少一种编码至少一个microRNA序列的核酸分子,其在至少一种祀血衆中的表达与在至少一种对照血衆中的表达相比不变。在更加优选的实施方案中，所述的在至少一种靶血浆中的表达与在至少一种对照血衆中的表达相比不变的至少一种编码至少一个microRNA序列的核酸分子选自至少一种编码hsa-miR-1228的核酸分子。在最优选的实施方案中，所述的多种核酸分子包含编码hsa-miR-122、hsa-miR-192、hsa-miR-21、hsa-miR-223、hsa_miR-26a、hsa_miR-27a、hsa-miR-801 以及hsa-miR-1228的八个核酸分子的组合。在更加优选的实施方案中，所述的至少一种对照血浆来自健康个体、慢性乙肝患者或肝硬化患者。在优选的实施方案中，所述的肝细胞癌为早期肝细胞癌(BCLC O期和A期)。在第二方面，本发明公开了一种肝细胞癌诊断试剂盒，其包含一种肝细胞癌诊断标志物，所述的肝细胞癌诊断标志物，由多种核酸分子组成，每种核酸分子编码至少一个microRNA 序列。 在优选的实施方案中，所述的多种核酸分子包含至少一种编码至少一个microRNA序列的核酸分子，其在至少一种靶血浆中与在至少一种对照血浆中差异表达。在更加优选的实施方案中，所述的在至少一种靶血浆中与在至少一种对照血浆中差异表达的至少一种编码至少一个microRNA序列的核酸分子选自至少一种编码microRNA序列的核酸分子，其在至少一种靶血浆中的表达与在至少一种对照血浆中的表达相比被上调，以及至少一种编码microRNA序列的核酸分子,其在至少一种祀血衆中的表达与在至少一种对照血浆中的表达相比被下调。特别优选地，所述的在至少一种靶血浆中的表达与在至少一种对照血浆中的表达相比被上调的至少一种编码至少一个microRNA序列的核酸分子选自至少一种编码hsa-miR-801、hsa-miR-192或hsa-miR-21的核酸分子；且所述的在至少一种祀血衆中的表达与在至少一种对照血浆中的表达相比被下调的至少一种编码至少一个microRNA序列的核酸分子选自至少一种编码 hsa-miR-122、hsa_miR-26a, hsa_miR-27a 或 hsa-miR-223 的核酸分子。在优选的实施方案中，所述的多种核酸分子还包含至少一种编码至少一个microRNA序列的核酸分子,其在至少一种祀血衆中的表达与在至少一种对照血衆中的表达相比不变。在更加优选的实施方案中，所述的在至少一种靶血浆中的表达与在至少一种对照血衆中的表达相比不变的至少一种编码至少一个microRNA序列的核酸分子选自至少一种编码hsa-miR-1228的核酸分子。在最优选的实施方案中，所述的多种核酸分子包含编码hsa-miR-122、hsa-miR-192、hsa-miR-21、hsa-miR-223、hsa_miR-26a、hsa_miR-27a、hsa-miR-801 以及 hsa-miR-1228的八个核酸分子的组合。所述的试剂盒还包含一个回归模型,如下logit(p=HCC) = -I. 424-0. 292*hsa-miR-122+0. 4511*hsa-miR-192+0. 6112*hsa-miR-21-0. 1796*hsa-miR-223_0· 2487*hsa-miR-26a_0· 3542*hsa_miR-27a+0. 209*hsa_miR-801,其中，hsa-miR-122、hsa-miR-192、hsa-miR-21、hsa-miR-223、hsa_miR-26a、hsa_miR-27a 以及hsa-miR-801的表达水平是以hsa-miR-1228为内参检测得到，模型中的logit (p = HCC)值在至少一种靶血浆中的表达与在至少一种对照血浆中的表达相比被上调。在更加优选的实施方案中，所述的至少一种对照血浆来自健康个体、慢性乙肝患者或肝硬化患者。在优选的实施方案中，所述的肝细胞癌为早期肝细胞癌(BCLC O期和A期)。在第三方面，本发明公开了一种用于区分至少一个肝细胞癌患者的血浆和至少一个健康个体的血浆的试剂盒，其包含一种肝细胞癌诊断标志物，所述的肝细胞癌诊断标志物，由多种核酸分子组成，每种核酸分子编码至少一个microRNA序列，所述的多种核酸分子包含至少一种编码至少一个microRNA序列的核酸分子,其在至少一种祀血衆中与在至少一种对照血浆中差异表达，所述的至少一种对照血浆来自健康个体。在优选的实施方案中，所述的多种核酸分子包含至少一种编码至少一个microRNA序列的核酸分子，其在至少一种靶血浆中与在至少一种对照血浆中差异表达。在更加优选的实施方案中，所述的在至少一种靶血浆中与在至少一种对照血浆中差异表达的至少一种编码至少一个microRNA序列的核酸分子选自至少一种编码microRNA序列的核酸分子，其在至少一种靶血浆中的表达与在至少一种对照血浆中的表达相比被上调，以及至少一种编码microRNA序列的核酸分子,其在至少一种祀血衆中的表达与在至少一种对照血浆中的表达相比被下调。特别优选地，所述的在至少一种靶血浆中的表达与在至少一种对照血浆中的表达相比被上调的至少一种编码至少一个microRNA序列的核酸分子选自至少一种编码hsa-miR-122、hsa-miR-801、hsa-miR-192 或 hsa-miR-21 的核酸分子；且所述的在至少一种靶血浆中的表达与在至少一种对照血浆中的表达相比被下调的至少一种编码至少一个microRNA序列的核酸分子选自至少一种编码hsa_miR-26a, hsa_miR-27a或hsa-miR-223的核酸分子。在优选的实施方案中，所述的多种核酸分子还包含至少一种编码至少一个microRNA序列的核酸分子,其在至少一种祀血衆中的表达与在至少一种对照血衆中的表达相比不变。在更加优选的实施方案中，所述的在至少一种靶血浆中的表达与在至少一种对照血衆中的表达相比不变的至少一种编码至少一个microRNA序列的核酸分子选自至少一种编码hsa-miR-1228的核酸分子。在最优选的实施方案中，所述的多种核酸分子包含编码hsa-miR-122、hsa-miR-192、hsa-miR-21、hsa-miR-223、hsa_miR-26a、hsa_miR-27a、hsa-miR-801 以及hsa-miR-1228的八个核酸分子的组合。所述的试剂盒还包含一个回归模型,如下logit(p=HCC) = -I. 424-0. 292*hsa-miR-122+0. 4511*hsa-miR-192+0. 6112*hsa-miR-21-0. 1796*hsa-miR-223_0· 2487*hsa-miR-26a_0· 3542*hsa_miR-27a+0. 209*hsa_miR-801,其中，hsa-miR-122、hsa-miR-192、hsa-miR-21、hsa-miR-223、hsa_miR-26a、hsa_miR-27a 以及hsa-miR-801的表达水平是以hsa-miR-1228为内参检测得到，模型中的logit (p = HCC)值在至少一种靶血浆中的表达与在至少一种对照血浆中的表达相比被上调。 在优选的实施方案中，所述的肝细胞癌为早期肝细胞癌(BCLC O期和A期)。在第四方面，本发明公开了一种用于区分至少一个肝细胞癌患者的血浆和至少一个慢性乙肝的血浆的试剂盒，其包含一种肝细胞癌诊断标志物，所述的肝细胞癌诊断标志物，由多种核酸分子组成，每种核酸分子编码至少一个microRNA序列,所述的多种核酸分子包含至少一种编码至少一个microRNA序列的核酸分子,其在至少一种祀血衆中与在至少一种对照血浆中差异表达，所述的至少一种对照血浆来自慢性乙肝患者。在优选的实施方案中，所述的多种核酸分子包含至少一种编码至少一个microRNA序列的核酸分子，其在至少一种靶血浆中与在至少一种对照血浆中差异表达。在更加优选的实施方案中，所述的在至少一种靶血浆中与在至少一种对照血浆中差异表达的至少一种编码至少一个microRNA序列的核酸分子选自至少一种编码microRNA序列的核酸分子，其在至少一种靶血浆中的表达与在至少一种对照血浆中的表达相比被上调，以及至少一种编码microRNA序列的核酸分子,其在至少一种祀血衆中的表达与在至少一种对照血浆中的表达相比被下调。特别优选地，所述的在至少一种靶血浆中的表达与在至少一种对照血浆中的表达相比被上调的至少一种编码至少一个microRNA序列的核酸分子选自至少一种编码hsa-miR-801或hsa-miR-21的核酸分子；且所述的在至少一种祀血衆中的表达与在至少一种对照血浆中的表达相比被下调的至少一种编码至少一个microRNA序列的核酸分子选自至少一种编码 hsa-miR-122、hsa-miR-192、hsa_miR-26a、hsa_miR-27a 或 hsa-miR-223 的核酸分子。在优选的实施方案中，所述的多种核酸分子还包含至少一种编码至少一个microRNA序列的核酸分子,其在至少一种祀血衆中的表达与在至少一种对照血衆中的表达相比不变。在更加优选的实施方案中，所述的在至少一种靶血浆中的表达与在至少一种对照血衆中的表达相比不变的至少一种编码至少一个microRNA序列的核酸分子选自至少一种编码hsa-miR-1228的核酸分子。在最优选的实施方案中，所述的多种核酸分子包含编码hsa-miR-122、hsa-miR-192、hsa-miR-21、hsa-miR-223、hsa_miR-26a、hsa_miR-27a、hsa-miR-801 以及hsa-miR-1228的八个核酸分子的组合。所述的试剂盒还包含一个回归模型,如下logit(p=HCC) = -I. 424-0. 292*hsa-miR-122+0. 4511*hsa-miR-192+0. 6112*hsa-miR-21-0. 1796*hsa-miR-223_0· 2487*hsa-miR-26a_0· 3542*hsa_miR-27a+0. 209*hsa_miR-801,其中，hsa-miR-122、hsa-miR-192、hsa-miR-21、hsa-miR-223、hsa_miR-26a、hsa_miR-27a 以及hsa-miR-801的表达水平是以hsa-miR-1228为内参检测得到，模型中的logit (p = HCC)值在至少一种靶血浆中的表达与在至少一种对照血浆中的表达相比被上调。在优选的实施方案中，所述的肝细胞癌为早期肝细胞癌(BCLC O期和A期)。在第五方面，本发明公开了一种用于区分至少一个肝细胞癌患者的血浆和至少一个肝硬化患者的血浆的试剂盒，其包含一种肝细胞癌诊断标志物，所述的肝细胞癌诊断标志物，由多种核酸分子组成，每种核酸分子编码至少一个microRNA序列,所述的多种核酸分子包含至少一种编码至少一个microRNA序列的核酸分子,其在至少一种祀血衆中与在至少一种对照血浆中差异表达，所述的至少一种对照血浆来自肝硬化患者。 在优选的实施方案中，所述的多种核酸分子包含至少一种编码至少一个microRNA序列的核酸分子，其在至少一种靶血浆中与在至少一种对照血浆中差异表达。在更加优选的实施方案中，所述的在至少一种靶血浆中与在至少一种对照血浆中差异表达的至少一种编码至少一个microRNA序列的核酸分子选自至少一种编码microRNA序列的核酸分子，其在至少一种靶血浆中的表达与在至少一种对照血浆中的表达相比被上调，以及至少一种编码microRNA序列的核酸分子,其在至少一种祀血衆中的表达与在至少一种对照血浆中的表达相比被下调。特别优选地，所述的在至少一种靶血浆中的表达与在至少一种对照血浆中的表达相比被上调的至少一种编码至少一个microRNA序列的核酸分子选自至少一种编码hsa-miR-801的核酸分子；且所述的在至少一种祀血衆中的表达与在至少一种对照血衆中的表达相比被下调的至少一种编码至少一个microRNA序列的核酸分子选自至少一种编码hsa-miR-122、hsa-miR-192、hsa-miR-21、hsa_miR-26a、hsa_miR-27a 或 hsa-miR-223 的核酸分子。在优选的实施方案中，所述的多种核酸分子还包含至少一种编码至少一个microRNA序列的核酸分子,其在至少一种祀血衆中的表达与在至少一种对照血衆中的表达相比不变。在更加优选的实施方案中，所述的在至少一种靶血浆中的表达与在至少一种对照血衆中的表达相比不变的至少一种编码至少一个microRNA序列的核酸分子选自至少一种编码hsa-miR-1228的核酸分子。在最优选的实施方案中，所述的多种核酸分子包含编码hsa-miR-122、hsa-miR-192、hsa-miR-21、hsa-miR-223、hsa_miR-26a、hsa_miR-27a、hsa-miR-801 以及hsa-miR-1228的八个核酸分子的组合。所述的试剂盒还包含一个回归模型,如下logit(p=HCC) = -I. 424-0. 292*hsa-miR-122+0. 4511*hsa-miR-192+0. 6112*hsa-miR-21-0. 1796*hsa-miR-223_0· 2487*hsa-miR-26a_0· 3542*hsa_miR-27a+0. 209*hsa_miR-80,其中，hsa-miR-122、hsa-miR-192、hsa-miR-21、hsa-miR-223、hsa_miR-26a、hsa_miR-27a 以及hsa-miR-801的表达水平是以hsa-miR-1228为内参检测得到，模型中的logit (p = HCC)值在至少一种靶血浆中的表达与在至少一种对照血浆中的表达相比被上调。在优选的实施方案中，所述的肝细胞癌为早期肝细胞癌(BCLC O期和A期)。在第六方面，本发明公开了一种确定肝癌诊断标志物的方法，包括(a)在一个或多个靶血浆中确定多个核酸分子的表达水平，每个核酸分子编码至少一个microRNA序列；(b)在一个或多个对照血浆中确定上述多个核酸分子的表达水平；(c)通过对比在步骤(a)和(b)中获得的多个核酸分子的相应表达水平，来从所述多个核酸分子中鉴定出在所述的靶血浆和所述的对照血浆中差异表达的一个或多个核酸 分子，将在所述的靶血浆和所述的对照血浆中差异表达的一个或多个核酸分子作为肝癌诊断标志物。本发明的其他实施方案将从以下详细描述中变得明了。
图I为本发明用于鉴定至少一个肝细胞肝癌靶血浆，特别是存在早期肝细胞肝癌(BCLC O期和A期)的miCToRNA组合的筛选、训练以及验证阶段的实验设计流程图。图2为确定本发明用于诊断肝细胞肝癌，特别是诊断早期肝细胞肝癌(BCLC O期和A期)患者的血液中miCToRNA组合的主要方法步骤图。对照组包括健康、慢性乙肝和肝硬化受试者。图3说明了包含本发明用于确定至少一个肝细胞肝癌靶血浆的优选HiiCT0RNA组合(hsa-miR-122、hsa-miR-192、hsa-miR-21、hsa-miR-223、hsa_miR-26a、hsa_miR-27a 和hsa-miR-801)的逻辑回归模型。A)训练集(η = 407)中HCC组与对照组比较时microRNA组合的诊断价值的ROC曲线图。与AFP(AUC = O. 76)相比，microRNA组合在区分HCC组血浆和对照组血浆时具有显著高的诊断准确度(AUC = O. 86)。B)验证集(η = 390)中HCC组与对照组比较时microRNA组合的诊断价值的ROC曲线图。与AFP (AUC = 0. 68)相比，microRNA组合在区分HCC组血浆和对照组血浆时具有显著高的诊断准确度(AUC = 0. 89)。图4说明了包含本发明用于进一步区分肝细胞癌患者血浆和健康个体、慢性乙肝患者或肝硬化患者的血楽·的优选microRNA组合(hsa-miR-122、hsa-miR-192、hsa-miR-21、hsa-miR-223、hsa-miR-26a、hsa_miR-27a 和 hsa-miR-801)的逻辑回归模型。A)验证集(η=390)中HCC组与健康组比较时microRNA组合的诊断价值的ROC曲线图。与AFP (AUC =
0.64)相比，microRNA组合在区分HCC患者血浆和健康个体血浆时具有显著高的诊断准确度(AUC = 0. 95)。B)验证集(η = 390)中HCC组与慢性乙肝组比较时microRNA组合的诊断价值的ROC曲线图。与AFP(AUC = 0. 62)相比，microRNA组合在区分HCC患者血浆和慢性乙肝患者的血浆时具有显著高的诊断准确度(AUC = 0. 85)。C)验证集(η = 390)中HCC组与肝硬化组比较时microRNA组合的诊断价值的ROC曲线图。与AFP (AUC = 0. 78)相比，microRNA组合在区分HCC患者血浆和肝硬化患者的血浆时具有显著高的诊断准确度(AUC=0. 89)。图5说明了包含本发明用于鉴定不同BCLC分期的肝细胞癌的至少一个靶血浆的优选 microRNA 组合(hsa-miR-122、hsa-miR-192、hsa-miR-21、hsa-miR-223、hsa-miR-26a、hsa-miR-27a和hsa-miR-801)的逻辑回归模型。A)极早期HCC(BCLC O)与对照组比较时microRNA组合的诊断价值的ROC曲线图。与AFP(AUC = O. 68)相比，microRNA组合在区分极早期HCC患者血浆和对照组血浆时具有高得多的诊断准确度(AUC = O. 94)。B)早期HCC(BCLC A)与对照组比较时microRNA组合的诊断价值的ROC曲线图。与AFP(AUC =
O.65)相比，microRNA组合在区分早期HCC患者血浆和对照组血浆时具有高得多的诊断准确度(AUC = O. 90)。C)中期HCC(BCLC B)与对照组比较时microRNA组合的诊断价值的ROC曲线图。与AFP(AUC = 0. 74)相比，microRNA组合在区分中期HCC患者血浆和对照组血浆时具有高得多的诊断准确度(AUC = 0. 85)。D)进展期HCC(BCLC C)与对照组比较时mi croRNA组合的诊断价值的ROC曲线图。与AFP (AUC = 0. 79)相比，microRNA组合在区分进展期HCC患者血浆和对照血浆时并无显著差异(AUC = 0. 80)。图6说明了包含本发明用于鉴定AFP彡20ng/ml及AFP > 20ng/ml的肝细胞癌的至少一个祀血衆的优选 microRNA 组合(hsa-miR-122、hsa-miR-192、hsa-miR-21、hsa-miR-223、hsa-miR-26a、hsa-miR-27a和 hsa-miR-801)的逻辑回归模型。A) AFP 彡 20ng/ ml的HCC组和对照组比较时microRNA组合的诊断价值的ROC曲线图。与AFP (AUC = 0. 63)相比，microRNA组合在区分AFP ( 20ng/ml的HCC组血浆和对照组血浆时具有高得多的诊断准确度(AUC = 0. 87)。B) AFP > 20ng/ml的HCC组和对照组比较时microRNA组合的诊断价值的ROC曲线图。与AFP(AUC = 0. 69)相比，microRNA组合在区分AFP > 20ng/ml的HCC组血浆和对照组血浆时具有高得多的诊断准确度(AUC = 0. 90)。图7为7个选出来的microRNA和AFP手术期间变化的箱线图。分别在术前和术后第6天，取行肝切除手术的54个HCC患者的血液样本。在术后第6天，AFP和3个 microRNA (hsa-miR-21、hsa-miR-192 和 hsa-miR-223)的表达水平有明显改变。在外科切除术后，AFP和2个microRNA (hsa-miR-21和hsa-miR-192)的表达水平显著下降，hsa-miR-223的表达显著增加。

典型地，包含在肝细胞癌诊断标志物中的核酸分子是人类序列，下文称为“has”(智人(Homo sapiens))。特别优选地，所述的多种核酸分子包含编码hsa-miR-122 (SEQ ID NO : I)、hsa-miR-192 (SEQ ID NO :2)、hsa-miR-21 (SEQ ID NO :3)、hsa-miR-223 (SEQ ID NO :4)、hsa-miR-26a(SEQ ID NO :5)、hsa_miR-27a(SEQ ID NO :6)、hsa-miR-801(SEQ ID NO :7)以及内参hsa-miR-1228 (SEQ ID NO :8)的一个或多个核酸分子。上面提到的microRNA的核酸序列列在表I中。表I


本发明涉及由血浆microRNA组合成的肝癌诊断标志物，含有该标志物的试剂盒，以及一种诊断肝癌(特别是早期肝癌)的新方法。所述的肝癌诊断标志物由多种核酸分子组成，每种核酸分子编码至少一个microRNA序列，优选由编码hsa-miR-122、hsa-miR-192、hsa-miR-21、hsa-miR-223、hsa-miR-26a、hsa-miR-27a、hsa-miR-801和hsa-miR-1228的核酸分子组成。所述的试剂盒可用于诊断肝细胞癌，尤其是早期肝细胞癌，或者区分至少一个肝细胞癌患者的血浆和至少一个健康个体的血浆、至少一个慢性乙肝患者的血浆或者至少一个肝硬化患者的血浆。