茶树来源的3种microRNA及其应用的制作方法【技术领域】[0001]本发明属于药物【技术领域】，具体涉及3种来源于茶树的microRNA及其应用。[0002]microRNA (miRNA)是近年来研究较多的“明星分子”。由18-25个核苷酸组成的非编码RNA，首先由核基因组转录，形成带帽状结构和多聚腺苷尾巴的初级miRNA(pr1-miRNA)o Pr1-miRNA经核酸酶Drosha处理后形成约70nt的含莖环节后的前体miRNA(pre-miRNA),其后又经核酸酶剪切为成熟的miRNA。miRNA通过碱基非完全配对与靶基因mRNA 3’UTR序列结合,引导沉默复合体(RNA-1nduced silencing complex,RISC)降解mRNA或抑制mRNA的翻译,从而调控基因的表达。一个miRNA可结合多个祀基因，而一个mRNA也可由多个miRNA共同调节。这种复杂的调节网络既可以通过一个miRNA来调控多个基因的表达，也可以通过几个miRNA的组合来精细调控某个基因的表达。据推测，miRNA调节着人类三分之一的基因。[0003]研究证明，miRNA广泛参与细胞活动的一系列生理及病理活动过程，包括细胞发育、细胞调亡、细胞代谢、肿瘤形成、病毒感染及免疫应答等。miRNA作为调控细胞功能的关键因子，其与人体疾病的发生发展密切相关。当生物体体内Dicer酶缺失或不足时，内源性miRNA无法正常生成，从而导致干细胞的丢失和细胞周期的改变、早期胚胎体致死和器官发育异常。MiR-17在肺生长发育中也起到重要作用。缺乏miR-17基因的胚胎具有严重的肺部发育不良，但没有某特定的分支缺陷；在miR-17基因缺失小鼠中表现为B细胞发育缓慢，严重的肺及心脏发育缺陷，并将导致出生后不久死亡。肺内特异性过表达miR-17则表现出内皮细胞过度增生，抑制肺内皮祖细胞的分化。在肺内炎性反应中，内毒素可以引起巨噬细胞中miR-132，miR-146a, miR-155表达水平增加，miR-125b表达水平下降。另一个炎症系统中重要的miRNA是miR-155，它在病毒或细菌刺激的巨噬细胞中表达增加，更有意义的是，miR-155是唯一受细菌或病毒刺激后表达都增加的miRNA。miRNA广泛参与肿瘤的病理过程，Let-7基因家族能调控N-Ras和K-Ras mRNA表达，其编码的miRNA与肺癌的发生密切相关，其革巴点包括Ras家族和非组蛋白染色体蛋白HMGA2(high-mobility groupprotein A2)。[0004]由于miRNA不仅在基因位置上保守，序列上也呈现出高度的同源性。那么一些植物内源性的核苷酸类物质通过日常饮食吸收进入体内后,可被体内的Dicer酶剪切，产生一类类似于miRNA的核苷酸类物质，进而影响人体mRNA的表`达。茶叶是很多人日常生活中的必需品，茶叶在人体保健和医药方面有很多的研究和应用。来源于茶叶的miRNA是否能够通过饮用的方式进入人体，并调节人体内的相应基因的表达，进而对人体健康产生或好或坏的影响，这是一个很有意思，也很有意义的课题。如果我们能够找到茶叶中相应的miRNA在人体内发现并调节相应基因的证据，进而研究其靶基因相应的功能，可能会对于茶叶保健或者医疗方面的分子机理有更加深入的认识。[0005]为了验证这些检测到的植物miRNA序列的确来源于植物，对人/小鼠血清的totalRNA进行高碘酸钠处理，对人/小鼠血清中检测到的几个植物miRNA进行miRNA测序和qPCR鉴定。由于高碘酸钠为强氧化剂，能够氧化动物来源的miRNA的2’、3’位自由羟基，导致动物来源的miRNA在进行miRNA测序和qPCR时不被检测到或者检测丰极低。植物来源的miRNA由于其末端本身是2-0-甲基化修饰的，高碘酸钠处理对对其结构不产生影响，所以在进行miRNA测序和qPCR时其检测表达量几乎不产生变化。从而证明几个miRNA的确来源于植物。
[0006]针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供3种来源于茶树的治疗肿瘤、糖尿病、脂肪肝和呼吸系统疾病的microRNA及其应用的技术方案。
[0007]所述的用于制备治疗肿瘤、糖尿病、脂肪肝和呼吸系统疾病的药物，其特征在于包含3种茶树microRNA的任一种，所述的3种茶树microRNA分别为cs1-miRl、csi_miR2和cs1-miR3,所述的csiniRl核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示,所述的csi_miR2核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述的cs1-miR3核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
[0008]所述的用于制备治疗肿瘤、糖尿病、脂肪肝和呼吸系统疾病的药物，其特征在于3种茶树microRNA的前体RNA包含如下序列:csi_miRl前体核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，cs1-miR2前体核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，csi_miR3前体核苷酸序列如SEQ IDNO:6所示。
[0009]所述的用于制备治疗肿瘤、糖尿病、脂肪肝和呼吸系统疾病的药物，其特征在于所述的茶树包含如下任何一种:山茶属植物茶树、瘤叶短蕊茶、白毛红山茶、油茶、山茶、厚短蕊茶、拎木属植物拎木和岗茶。
[0010]所述的3种茶树microRNA在制备治疗肿瘤、糖尿病、脂肪肝和呼吸系统疾病药物中的应用，其特征在于包含cs1-miRl、csi_miR2和csi_miR3中的任一种，所述的csi_miRl核苷酸序列如SEQ ID NO:1所 示,所述的cs1-miR2核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示,所述的cs1-miR3核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
[0011]所述的应用,其特征在于3种茶树microRNA的前体RNA包含如下序列:csi_miRl前体核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，cs1-miR2前体核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，cs1-miR3前体核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
[0012]所述的应用，其特征在于所述的茶树包含如下任何一种:山茶属植物茶树、瘤叶短蕊茶、白毛红山茶、油茶、山茶、厚短蕊茶、拎木属植物拎木和岗茶。
[0013]本发明一方面提供了一种治疗肺部感染性疾病的药物，该药物具有抗肿瘤细胞增殖，降低II型糖尿病高血糖，改善肝脏脂肪积聚及其所产生的炎症，抑制病毒诱导的肺损伤、肺水肿、肺炎，降低支气管黏液分泌等药理作用，本发明另一方面确定了一种治疗肿瘤、糖尿病、脂肪肝和呼吸系统疾病的药物的应用，其可作为治疗非小细胞肺癌、肝癌、II型糖尿病、非酒精性脂肪肝炎、急性肺炎、流感病毒性肺炎。



[0014]图lcs1-miRl~3 二级莖环节构；
图2PT-PCR检测不同茶树植物中cs1-miRl~3的表达，M:50 bp DNA ladder ；1~8:依次是茶树(Camellia sinensis)、瘤叶短蕊茶(C.muricatala Chang)、白毛红山茶(C.albovillosa)、油茶(C.0lifera Abel)、山茶(C.Japounica Linn.)、厚短蕊茶(C.pachyandra)、怜木(Eurya acuminatissima Merr)、岗茶(Eurya chinensis)；
图3cs1-miRl~3对荷瘤小鼠A549及!fepG2肿瘤组织中相关基因表达的影响；
图4cs1-miRl~3对II型糖尿病小鼠胰岛细胞形态的影响；
图5cs1-miRl~3对非酒精性脂肪肝炎大鼠肝细胞病理形态的影响；
图6cs1-miRl~3对流感病毒性小鼠肺组织病理形态的影响。

[0015]以下结合实施例来进一步说明本发明。
[0016]实施例1:miRNA的筛选及鉴定
选择新鲜的茶树叶片，分别用于喂食小鼠和miRNA测序(2个生物学重复)。两组ICR小鼠(18~20 g)，共计24只，分别禁食12 h后，对照组喂食小鼠饲料，实验组灌食茶树叶片。不同的时间点采集相应小鼠的肝脏组织和血清，分别提取total RNA。喂食小鼠饲料组0h、3h的血清样本RNA等量混合进行I个miRNA测序，3h、6h的血清样本RNA等量混合进行一个miRNA测序；喂食小鼠饲料组0h、3h的肝脏样本RNA等量混合进行I个miRNA测序，3h、6h的肝脏样本RNA等量混合进行一个miRNA测序。灌食茶树叶片组样本采集和测序如上。根据测序结果，选择在茶树叶片miRNA测序中发现并有较高表达丰度，在喂食小鼠饲料的小鼠组织/血清miRNA测序中未发现或者表达丰度很低，在灌食茶树叶片组的小鼠组织/血清miRNA测序中发现并有较高表达丰度的miRNA，这些miRNA作为植物来源的miRNA在小鼠体内发挥生物学功能的可能性很大。对于这些植物来源的miRNA (选择3-5个表达丰度相对高的)，通过qPCR分别在喂食小鼠饲料/灌食茶树叶片的血清/肝脏RNA和茶树叶片RNA进行鉴定。最终选择小鼠cs`1-miRl:UGUCAGUUUGUCAAAUAAA (该序列如SEQ ID NO:1 所示)；cs1-miR2:UGGUAGUUGGUGGUAGUGGUAG (该序列如 SEQ ID NO:2 所示)；csi_miR3:GGGUGCAGAGACAGCCAGA (该序列如SEQ ID NO:3所示)，其前体序列分别为cs1-miRl前体:AUCCCAGAACUAACAGAGGAAAGAAGAGCUUCUGUCAGGAAAGGAAGGCAAUUAUGGUAAUGUCAGUUUGUCAAAUAAAUU ⑶ AAAAACA ⑶ UUCAAA ⑶ AAACGCAUA ⑶⑶ GGGAAGAUGAAUUAUGG ⑶ CACAGAG^^GCUCUUCCUUAGAUCCAGG(该序列如SEQ ID NO:4所示);csi_miR2前体:GAACUUUUGUGUUUGAUUU⑶⑶GGAACCAAUGAUG⑶⑶ AUCAAG⑶UA⑶ CAG ⑶UUCCAGCC ⑶⑶G⑶ A ⑶UG⑶ G⑶ A⑶G ⑶ AGGCAUCAUGGACAGAGCACACGCAAUCAAAGACC(该序列如 SEQ ID NO:5 所示);csi_miR3 前体:UUCCUCUGGUGUGUACUUGUCAUCCAGCACAGUGGGUGCAGAGACAGCCAGAGCUC(该序列如 SEQ ID NO:6 所示)。比较其表达量在喂食小鼠饲料/灌食茶树后随着时间变化的趋势，基本判定这些miRNA是来自于茶叶灌食。通过RNA 二级结构分析软件,确定cs1-miRl前体、csi_miR2前体和csi_miR3前体的二级结构如图1所示。
[0017]实施例2:3种miRNA在植物中的分布
采用改进的CTAB法从茶树叶片中提取和富集小分子RNAs。具体如下:(1)每个样品取
0.1 g茶树嫩叶片在液氮中迅速研碎，转移到含有600 μι CTAB缓冲液(2% CTAB;100 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0 ；20 mmol/L EDTA ；1.4 mol/L NaCl ；2% β -巯基乙醇)的 1.5 ml 离心管中，混匀后，65°C水浴20 min。(2)4°C 8 000 r/min离心10 min，上清液被转移到新的离心管中，用氯仿/异戊醇(24:1)抽提2次。(3)上清液再次被转移到新的离心管中，加入1/4 体积的 10 mol/L LiCl,混匀后，-20°C沉淀 2 h。(4) 4°C 10 000 r/min 离心 10 min,弃上清，用 300 μ? DEPC 水溶解沉淀，加入 50 μ? 50% PEG8000 和 50 μ? 5 mol/L NaCl，混匀后，冰浴2 h。(5)4°C 10 000 r/min离心10 min，上清液被转移到新的离心管中，加入1/10体积的3 mol/L NaAc (pH 5.2)和2.5倍体积的无水乙醇，混匀后_70°C沉淀I h。
(6)4°C 10 000 r/min 离心 20 min,用 300 M-1 DEPC 水溶解沉淀，加入 3 M-1 RNase-freeDNase I和I μ? RNase抑制剂，37°C酶解3 h。(7)用氯仿/异戊醇(24:1)抽提I次，上清液加入1/10体积的3 mol/L NaAc (pH 5.2)和2.5倍体积的无水乙醇，混匀后_70°C沉淀I h。(8)4°C 10 000 r/min离心20 min，用20 μ? DEPC水溶解沉淀，然后在2.5%的琼脂糖凝胶上检测小分子RNA的完整性。
[0018]采用茎环RT-PCR方法来检测鉴定茶树中保守miRNA。采用表1中引物完成RT-PCR 反应。
[0019]表1采用茎环引物鉴定miRNAs的引物序列