利用microRNA海绵技术预防和治疗肿瘤的方法[0002]结肠癌(Colorectalcancer)是胃肠道系统(Gastrointestinal system)中常见的恶性肿瘤之一。近些年来结肠癌的发病率在我国呈明显上升趋势，从上世纪70年代的万分之一上升到现在的万分之三，居恶性肿瘤发病率的第四位。[0003]结肠癌的发生非常复杂，其发病原因至今仍不太明确。但是越来越多的证据表明，慢性炎症与肿瘤的发生存在着密切关系。慢性炎症过程中释放的炎症因子及其他的有害复合物能够造成细胞DNA的损伤，从而改变细胞的増殖和生存能力，促进肿瘤的发生。比如:慢性大肠炎(Chronic inflammatory bowel disease)能够极大增加结肠癌的发病几率；溃瘍性结肠炎(Ulcerative colitis)患者的肠癌发生率也高于一般人群。[0004]NF-k B在慢性炎症和肿瘤的发生过程中起着关键的作用。NF-k B作为ー种重要的转录因子，对免疫球蛋白(IgG)的kappa轻链的转录进行调控。此后发现:NF-k B在固有免疫和适应性免疫应答、炎症反应、肿瘤发生以及有机体的分化发育等过程中也起到重要作用注。NF-K B家族转录因子主要包含五个成员:p50、p52、p65、C-Rel和RelB，它们分别由 NF-k B1、NF-k B2、RelA、c-Rel 和 RelB 基因编码。[0005]NF- K B的活化过程主要有两条通路:经典NF- k B通路(Canonical pathway)和非经典NF- K B通路(Non-canonical pathway)。经典NF- k B通路与肿瘤的关系已经有大量的报道。它涉及肿瘤发生发展的各个方面，与肿瘤细胞的増殖与凋亡、肿瘤血管形成和肿瘤的转移等都密切相关，经典NF-K B通路的作用在各种类型的肿瘤中得到体现，如淋巴瘤、黑色素瘤、胃癌、肝癌、肺癌、结肠癌、胰腺癌和前列腺癌等中都检测到经典通路的激活。目前对于非经典NF- K B通路在肿瘤中作用的研究相对较少，但是在胰腺癌中非经典NF- K B通路的激活促进了肿瘤细胞的増殖；在前列腺癌中阻断非经典NF-k B通路能够通过降低IL8的生成而抑制肿瘤的生长。[0006]但是目前本领域对于NF-k B与癌症尤其是结肠癌的具体联系和机制尚不明确，因此本领域迫切需要进行此发明的研究和开发。
[0007]本发明的目的就是提供ー种利用microRNA海绵技术预防和治疗肿瘤的方法。
[0008]在本发明的第一方面，提供了ー种RelA因子的抑制剂、或RelA基因的抑制剂的用途，它们被用于制备预防或治疗肿瘤的药物。
[0009]在另ー优选例中，所述的RelA因子选自下组:
[0010]⑷氨基酸序 列如SEQ ID N0.: 2所示的多肽；
[0011](B)将SEQ ID N0.: 2所示的氨基酸序列经过ー个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的RelA因子衍生物，或其活性片段；
[0012](C)序列与SEQ ID N0.: 2所示的氨基酸序列相比，同源性≥90%，较佳地≥95%，更佳地> 98%，最佳地> 99%的RelA因子衍生物，或其活性片段。
[0013]在另ー优选例中，所述的RelA基因编码RelA因子。
[0014]在另ー优选例中，所述的RelA基因选自下组:
[0015](Al)编码如SEQ ID N0.:2所示RelA因子的多核苷酸序列；
[0016](BI)如SEQ ID N0.:1所示的多核苷酸序列；
[0017](Cl)将SEQ ID N0.:1所示的多核苷酸序列经过ー个或几个核苷酸的取代、缺失或添加而形成的多核苷酸序列；
[0018](Dl)序列与SEQ ID N0.:1所示的多核苷酸序列相比，同源性≥90%，较佳地≥95%，更佳地> 98%，最佳地> 99%的多核苷酸序列；
[0019](El)与(Al)-(Dl)任一所述的多核苷酸序列互补的多核苷酸序列。
[0020]在另ー优选例中，所述的肿瘤选自下组:结肠癌、胰腺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、胃癌、肝癌、肺癌、前列腺癌。[0021]在另ー优选例中，所述的肿瘤为结肠癌。
[0022]在另ー优选例中，所述RelA因子的抑制剂选自下组=RelA因子的抗体、RelA因子的结合蛋白。
[0023]在另ー优选例中，所述RelA基因的抑制剂为:mir_221海绵、mir_222海绵、抑制RelA启动子的抑制剂、或其组合。
[0024]在另ー优选例中，所述RelA基因的抑制剂为mir-221海绵和/或mir-222海绵。
[0025]在另ー优选例中，所述的mir-221海绵的序列如SEQ ID N0.:5或SEQ ID N0.:6所示。
[0026]在另ー优选例中，所述的mir-222海绵的序列如SEQ ID N0.:7或SEQ ID N0.:8所示。
[0027]在本发明的第二方面，提供了ー种microRNA海绵,所述的microRNA海绵具有选自下组的结构(或序列):
[0028]序列如SEQ ID N0.:5或SEQ ID N0.:6所示的mir-221海绵、和/或序列如SEQID N0.:7 或 SEQ ID N0.:8 所示的 mir-222 海绵。
[0029]在另ー优选例中，所述的microRNA海绵可以特异性地与RelA因子的编码序列结
ム
ロ o
[0030]在本发明的第三方面，提供了第二方面所述海绵的用途，它被用于制备预防或治疗肿瘤的药物。
[0031]在另ー优选例中，所述的microRNA海绵用于抑制肿瘤细胞。
[0032]在另ー优选例中，所述的抑制肿瘤细胞包括:抑制肿瘤细胞的生长、抑制肿瘤细胞的増殖、诱导肿瘤细胞的凋亡、或其组合。
[0033]在本发明的第四方面，提供了ー种体外非治疗性的抑制肿瘤细胞的方法，包括步骤:在RelA因子抑制剂或RelA基因抑制剂存在的条件下，培养肿瘤细胞，从而抑制抑制肿瘤细胞。
[0034]在另ー优选例中，所述的RelA因子抑制剂抑制所述肿瘤细胞中RelA因子的活性；或RelA基因抑制剂抑制所述肿瘤细胞中RelA基因的表达。
[0035]在另ー优选例中，所述的肿瘤选自下组:结肠癌、胰腺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、胃癌、肝癌、肺癌、前列腺癌；较佳地为结肠癌。
[0036]在另ー优选例中，所述的抑制肿瘤细胞为抑制肿瘤细胞的生长或抑制肿成瘤。
[0037]在另ー优选例中，与对照肿瘤细胞相比，所述肿瘤细胞中RelA因子的活性降低10%以上，较佳地降低20%以上，更佳地降低30%以上，更佳地降低40%以上，更佳地降低50%以上，更佳地降低60%以上，更佳地降低70%以上，更佳地降低80%以上，更佳地降低90%以上，最佳地完全没有RelA因子的活性。 [0038]在另ー优选例中，与对照肿瘤细胞相比，所述肿瘤细胞中RelA基因的表达降低10%以上，较佳地降低20%以上，更佳地降低30%以上，更佳地降低40%以上，更佳地降低50%以上，更佳地降低60%以上，更佳地降低70%以上，更佳地降低80%以上，更佳地降低90%以上，最佳地完全没有RelA基因的表达。
[0039]在本发明的第五方面，提供了ー种可用于治疗肿瘤或抑制肿瘤细胞的药物组合物，包括药学上可接受的载体和有效量活性成分=RelA因子的抑制剂或RelA基因的抑制剂。
[0040]在另ー优选例中，所述的RelA因子抑制剂选自下组=RelA因子抗体、RelA因子结
合蛋白。
[0041]在另ー优选例中，所述的RelA基因的抑制剂为mir-2212海绵，和/或mir-222海绵。
[0042]在另ー优选例中，所述的RelA基因的抑制剂包括特异性针对mir_221的海绵、特异性针对mir-222的海绵、或其组合。
[0043]应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。



[0044]下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。
[0045]图1显示非经典NF-K B通路的激活依赖于经典NF-K B通路；其中，图1A显示RelA和RelB在结直肠癌临床样本中的表达情況；图1B显示RelA和RelB的表达在结直肠癌临床样本中呈高度正相关；图1C-图1F显示RelA在蛋白和RNA水平都可影响非经典NF- K B通路相关基因的表达。
[0046]图2显示miR-221/222能够影响RelA的表达并影响经典和非经典NF-k B通路的激活；其中，图2A-图2D显示miR-221/222影响RelA的蛋白表达；图2E-图2H显示 miR-221/222 影响 RelA 的 RNA 水平；图 21 显示 miR-221/222 影响 RelA, RelB 和 p52的核内水平；图2J-图2K显示miR-221/222影响NF- k B报告基因活性；图2L显示抑制miR-221/222部分阻断TNFa刺激的经典NF-k B通路的激活；图2M-图20显示抑制miR-221/222部分阻断⑶40L刺激的非经典NF- k B通路的激活。
[0047]图3显示miR-221/222通过调控RelA的编码区影响RelA的表达；其中，图3A显示抑制miR-221/222可抑制RelA和RelA+5”UTR表达载体的蛋白表达；图3B显示抑制miR-221/222可抑制RelA和RelA+5” UTR表达载体的RNA水平；图3C-图3D显示了图3A实验中的miR-221/222的表达情况；图3E显示miR-221/222不影响RelA的5”UTR报告基因活性；图3F-图31显示miR-221/222通过调控RelA编码区调控RelA的表达；图3J显示miR-221/222可影响RelA的mRNA稳定性；图3K-图3L显示在RKO细胞系中miR-221/222可能通过其它机制调控RelA。
[0048]图4显示miR-221/222通过调控PDUM2影响RelA的表达；其中，图4A显示在抑制miR-221/222情况下MG132处理可恢复RelA的表达；图4B显示不同结直肠癌细胞系中miR-221/222、RelA、RelB 和 PDLIM2 的表达情况；图 4C-图 4F 显示 HCTl 16、RKO 和 293T 中miR-221/222可影响PDLIM2的表达；图4G-图4H显示miR-221/222通过结合PDLIM2的3” UTR直接调控其表达。
[0049]图5显示RelA和RelB正调控miR-221/222的表达；其中，图5A显示RelA/p50可上调miR-221/222表达；图5B显示RelB/p52可上调miR-221/222表达；图5C显示敲低RelA可下调miR-221/222表达；图显示敲低RelB可下调miR-221/222表达。
[0050]图6显示敲低RelA可抑制肿瘤细胞系的体外增殖和体内成瘤；其中，图6A显示细胞在24、48、72、96、120小时时计数绘制细胞生长曲线，敲低RelA可降低HCT116细胞的体外生长；图6B显示WST-1法检测24、48、72、96、120小时时细胞数量与活力；图6C显示细胞周期分析，BrdU-7AAD加入诱导培养的稳转细胞系，继续培养50分钟，流式检测细胞周期，Flowjo7.6软件分析结果，敲低RelA可减少S期细胞增加G0/G1期细胞；图6D为克隆形成实验，细胞诱导培养11天，结晶紫染色计数大于20个细胞的克隆数，进行统计分析，敲低RelA可減少克隆数；图6E为软琼脂实验，稳转细胞系以10000个细胞种植于软琼脂胶内，培养28天后，结晶紫染色计数大于20个细胞的克隆数，敲低RelA可減少软琼脂克隆数；图6F-图6G显示RelA R NAi与对照tGFP RNAi稳转细胞系注射到裸鼠腋窝皮下成瘤；图6H显示22天取肿瘤称量重量；图61-图6J为Real-time PCR检测肿瘤组织中相关基因的表达情况；图6K为WB检测肿瘤组织中RelA、RelB等基因表达情況。
[0051]图7显示抑制miR-221/222可降低结直肠癌细胞系的体外増殖和体内成瘤；其中，图7A为细胞在24、48、72、96、120小时时计数绘制细胞生长曲线，抑制1^1?-221/222可降低HCTl 16细胞的体外生长；图7B显示了 WST-1法检测24、48、72、96、120小时时细胞数量与活力；图7C为细胞周期分析，BrdU-7AAD加入诱导培养的稳转细胞系，继续培养50分钟，流式检测细胞周期，Flowjo7.6软件分析结果，抑制miR-221/222可减少S期细胞增加G0/G1期细胞；图7D为miR-221/222 sponge构建示意图；图7E为miR-221/222 sponge稳转细胞系中miR-221和miR-222的表达情况；图7F:miR-221/222 sponge稳转细胞系中RelA和RelB的表达情况；图7G为克隆形成实验，细胞诱导培养11天，结晶紫染色计数大于20个细胞的克隆数，进行统计分析，抑制miR-221/222可减少克隆数；图7H:软琼脂实验，稳转细胞系以10000个细胞种植于软琼脂胶内，培养28天后，结晶紫染色计数大于20个细胞的克隆数，抑制miR-221/222可减少软琼脂克隆数；图71-图7J:miR-221/222 sponge与对照sponge稳转细胞系注射到裸鼠腋窝皮下成瘤；图7K:22天取肿瘤称量重量。

[0053]RelA因子及其编码基因
[0054]如本文所用，术语“RelA因子”属于NF-k B家族转录因子的成员之一。RelA因子是重要的转录因子，对免疫球蛋白(IgG)的kappa轻链的转录进行调控。NF-k B在固有免疫和适应性免疫应答、炎症反应、肿瘤发生以及有机体的分化发育等过程中也起到重要作用。
[0055]如本文所用，术语“ Re IA基因”、“ Re IA编码基因”、“ Re IA因子的编码基因”、“ Re IA因子的编码序列”可以互换使用，都是指编码NF-K B家族转录基因p-65的多核苷酸序列。本领域的普通技术人员可使用常规方法获得RelA基因的序列，如从NCBI获取。
[0056]本发明的RelA因子可以是重组多肽、天然多肽或合成多肽。本发明的RelA因子可以是天然纯化的产物或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的RelA因子可以是糖基化的或非糖基化的。本发明的RelA因子还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。本发明还包括具有RelA因子或RelA因子活性的RelA因子多肽片段和类似物。如本文所用，术语“片段”和“类似物”是指基本上保持天然RelA因子相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是:(i)有ー个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的 取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的；或(ii)在ー个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽；或(iii)成熟多肽与另ー个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽；或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
[0057]本发明还包括与本发明的RelA因子具有50%或以上(优选60%以上，70%以上，80%以上，更优选90%以上，更优选95%以上，最优选98%以上，如99%)同源性的具有相同或相似功能的多肽或蛋白。在蛋白质变体可以经过若干个(通常为1-60个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)取代、缺失或添加至少ー个氨基酸所得的衍生序列，以及在C末端和/或N末端添加ー个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在所述蛋白中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能，在C末端和/或末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。本发明包括RelA因子类似物与天然RelA因子的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些蛋白的类似物包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分了生物学的技木。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如e、Y-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的蛋白并不限于上述例举的代表性蛋白。
[0058]修饰(通常不改变一级结构)形式包括:体内或体外蛋白的化学衍生形式如こ酸化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在蛋白质合成和加工中进行糖基化修饰。这种修饰可以通过将蛋白暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。
[0059]在本发明的一个优选例中，编码RelA因子的氨基酸序列(NP_068810.3)为；
[0060]MDELFPLIFP AEPAQASGPY VEIIEQPKQR GMRFRYKCEG RSAGSIPGER STDTTKTHPT 60
[0061]IKINGYTGPG TVRISLVTKD PPHRPHPHEL VGKDCRDGFY EAELCPDRCI HSFQNLGIQC 120
[0062]VKKRDLEQAI SQRIQTNNNP FQVPIEEQRG DYDLNAVRLC FQVTVRDPSG RPLRLPPVLS 180
[0063]HPIFDNRAPN TAELKICRVN RNSGSCLGGD EIFLLCDKVQ KEDIEVYFTG PGWEARGSFS 240
[0064]QADVHRQVAI VFRTPPYADP SLQAPVRVSM QLRRPSDREL SEPMEFQYLP DTDDRHRIEE 300
[0065]KRKRTYETFK SIMKKSPFSG PTDPRPPPRR IAVPSRSSAS VPKPAPQPYP FTSSLSTINY 360
[0066]DEFPTMVFPS GQISQASALA PAPPQVLPQA PAPAPAPAMV SALAQAPAPV PVLAPGPPQA 420
[0067]VAPPAPKPTQ AGEGTLSEAL LQLQFDDEDL GALLGNSTDP AVFTDLASVD NSEFQQLLNQ 480
[0068]GIPVAPHTTE PMLMEYPEAI TRLVTGAQRP PDPAPAPLGA PGLPNGLLSG DEDFSSIADM 540·[0069]DFSALLSQIS S551
[0070]SEQ ID N0.:2
[0071]本发明还提供了编码RelA因子的多核苷酸序列。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括:DNA、基因组DNA或人工合成的DNA，DNA可以是单链的或是双链的。编码成熟多肽的多核苷酸包括:只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是ー个多核苷酸的替换形式，它可能是ー个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
[0072]在本发明的一个优选例中，编码RelA因子的DNA序列(NM_021975.3)为；
[0073]agcgcgcagg cgcggccgga ttccgggcag tgacgcgacg gcgggccgcg cggcgcattt 60
[0074]ccgcctctgg cgaatggctc gtctgtagtg cacgccgcgg gcccagctgc gaccccggcc 120
[0075]ccgcccccgg gaccccggcc atggacgaac tgttccccct catcttcccg gcagagccag 180
[0076]cccaggcctc tggcccctat gtggagatca ttgagcagcc caagcagcgg ggcatgcgct 240
[0077]tccgctacaa gtgcgagggg cgctccgcgg gcagcatccc aggcgagagg agcacagata 300
[0078]ccaccaagac ccaccccacc atcaagatca atggctacac aggaccagg gacagtgcgca 360
[0079]tctccctggt caccaaggac cctcctcacc ggcctcaccc ccacgagctt gtaggaaagg 420
[0080]actgccggga tggcttctat gaggctgagc tctgcccgga ccgctgcatc cacagtttcc 480
[0081]agaacctggg aatccagtgt gtgaagaagc gggacctgga gcaggctatc agtcagcgca 540