专利名称：用于中药桑白皮的化妆品美白活性物初步筛选方法近年来，国内外许多学者对中草药活性成分的开发利用进行了卓有成效的工作，如从主治面色黑黯的植物药中提取增白亮肤类活性物，从活血化瘀的植物药中发现改善微循环、悦色润面的调理剂。然而目前化妆品的中草药、天然产物类功能性成分，还主要以总提取物的形式添加，对于真正的具有特定功能的功效性成分没有明确，质量标准以总苷，总碱，总黄酮等形式表征，或者只是以复杂体系中単一特征化合物作为指标含量測定，而这ー特征化合物的选择多是參照中医药行业标准进行，而确切具有特定功效的外用美白抗氧化等功能性成分则很少作为含量指标。这些都是由于中草药成分的复杂性导致的体系有效成 分不确定，物质基础不明确，不透明，从而使得质量不可控，功效与安全性较难得到保证。化妆品作为ー种较常用的消费品，除了需要具有让消费者愿意接受的，喜欢的气味和外观特殊性，还应将功效与安全性放在第一位。所以，必须采用现代科学的方法对其主要的有效成分进行有效性筛选，然后提取，分离，去除影响质量的杂质，最大限度地保留有效成分，建立科学的质量标准和检测方法，保证产品质量的稳定性，因此针对天然产物和中草药这种复杂体系进行ー些有效成分筛选研究，明确复杂体系的活性成分就显得很有必要。桑白皮(Cortex Mori)别名桑根皮、白桑皮、根皮,系桑科桑属植物桑Morus albaL.除去栓皮的根皮，它具有清肺平喘、利尿消肿作用，主治肺热喘咳、水肿、腹胀和小便不利。桑白皮主要含多种黄酮类成分等。关于桑属植物的美白活性，长期以来在外用护肤美白化妆品方面一直备受关注，然而针对桑白皮具体美白活性成分的研究还为数不多。为了进ー步探讨单味中药桑白皮提取物美白活性成分对皮肤的美白作用，本发明提供中药桑白皮美白活性成分初步筛选追踪的相关方法。酪氨酸酶普遍存在于人和动植物体内，是黑色素生物合成过程中的关键限速酶。酪氨酸酶的合成増加，催化活力升高，会导致体内黑色素合成过多，造成色斑形成及黑色素的形成。研究表明可通过抑制酪氨酸酶活性来预防和治疗色素沉着及黑色素形成，因此，可以选择应用酪氨酸酶抑制剂通过抑制酪氨酸酶的活性，阻断黑色素的合成反应链，減少其在皮肤内的生成从而达到祛斑增白的效果。本发明主要为桑白皮提取物美白活性成分初步筛选提供方法。
本发明所要解决的技术问题在于提供一种用于中药桑白皮美白化妆品活性物的初步筛选方法。本发明建立了一种简便快捷高效灵活的方法初步筛选中药桑白皮的美白活性成分，采用薄层色谱分离技术及其对应的多显色方式对中药桑白皮的化学成分进行显色定位少量分离制备，结合化妆品美白活性物经典体外筛选的生化反应高效、快速、简便的进行活性成分初歩筛选。本发明把简单、快速、有效、灵活的薄层色谱分离技术与美白化妆品活性物筛选里的经典实验方法结合起来，解决上述技术问题所采取的技术方案是一种用于中药桑白皮美白化妆品活性物的初步筛选方法，其中，以中药桑白皮的粗提物为筛选对象，筛选方法包括下述步骤 第一歩采用薄层色谱分离技术对中药桑白皮的粗提物进行色谱分离； 第二步用碘蒸气或5 10%硫酸こ醇显色方法,或用254nm、365nm波长的紫外光检测检识方法对薄层色谱上的各个色谱带组分进行显色定位并计算相应的Rf值； 第三步对显色定位好的薄层色谱上的色谱带组分进行区域划分； 第四歩分别刮取划分好的谱带组分并研碎，对各个组分进行洗脱提取，得到对应的若干样品溶液； 第五步对上述若干样品溶液以酪氨酸酶活性抑制率为指标进行平行測定；
第六步根据酪氨酸酶活性抑制率測定结果即可确定各色谱带组分活性相对高低，为进ー步确定桑白皮提取物中具体美白目标活性単体成分提供依据。经过初步筛选之后，可进ー步采用液相-质谱，红外光谱，核磁共振谱等现代方法为美白成分确证提供依据。桑白皮粗提物的制备为常规技术，一般包括将中药桑白皮粉碎后加こ醇或水回流提取，过滤，合并提取液，旋转蒸发减压浓缩至干，或经过简单的萃取，醇沉等简单操作得到的提取物，即桑白皮粗提物。在上述方案的基础上，第一歩中，所述粗提物进行薄层色谱分离上样，上样的形状为点状或条带状，然后用展开剂展开，其中，展开剂为氯仿与甲醇按体积比I:I 10:1的混合溶液，展距为6 19 Cm。具体的，展开剂中氯仿与甲醇的体积比可以为5:1,5. 5:1,6:1,6. 5:1,7:1,7. 5:1、8:1、8· 5:1、9:1、9· 5:1 或 10:1 ;展距可以为 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18 或 19cm。在上述方案的基础上，所述的薄层色谱分离技术采用硅胶G型薄层板、硅胶GF254型薄层板、硅胶H型薄层板或硅胶HF254型薄层板。在上述方案的基础上，第三步中，薄层色谱上的色谱带组分进行区域划分，主要依据一定色谱条件下可以观测到的各化合物的RF值，从薄层色谱的前沿至点样位置，按照Rf值从高到低顺序对显色定位后的色谱带组分进行划分，其中，Rf值为被测组分到点样原点之间的距离与溶剂前沿到点样原点之间距离的比值。请參阅图I为Rf值测定示意图所示，Rf = b/a =被测组分到点样原点之间的距离/溶剂前沿到点样原点之间距离的比值。薄层色谱定性的基本參数和被测物质极性、展开剂极性有夫，也和固相吸附剂的吸附能力有夫。一定的展开体系下(展开剂、被测物、吸附载体)，被测化合物具有固定的Rf值，具有重现性，但是受湿度，温度等条件影响会有小许偏差。在上述方案的基础上，第四步中，将分别刮取划分好的各个色谱带组分，对各个组分进行洗脱提取，收集洗脱液置蒸发皿中浓缩至干，溶解定容。在上述方案的基础上，所述的洗脱剂为ニ氯甲烷、甲醇、こ醇、こ酸こ酷、氯仿中的ー种或多种的混合溶液。在上述方案的基础上，所述的溶解定容用的溶剂为1，3- 丁ニ醇、磷酸缓冲溶液或~■甲基亚讽。本发明的有益效果是
1、把简单快速有效灵活的薄层色谱分离技术与美白化妆品活性物筛选里的经典实验方法结合起来能快速简便有效的初步筛选出中药桑白皮里的美白活性成分；
2、一定的薄层色谱条件，合适的色谱带组分定位方法，操作步骤简单，不需要大型仪器设备，不需要繁琐的分离纯化过程，成本耗费较低；
3、本方法是建立在技术和方法都比较成熟的经典方法之上，包括薄层色谱分离技术，体外酪氨酸酶抑制试验，所以可以较好的进行推广。


图I为Rf值测定示意图。图2为中药桑白皮提取物的こ酸こ酯萃取液的薄层图，以碘蒸气显色，两侧样品为桑根酮C标准品。图3为中药桑白皮提取物的こ酸こ酯萃取物在硅胶薄层板上条带状上样、展开并以碘蒸气熏后的色谱条帯。图4为中药桑白皮提取物的こ酸こ酯萃取物在硅胶薄层板上点状上样、展开并以硫酸こ醇显色的色谱条帯。图5为中药桑白皮提取物的こ酸こ酯萃取物在硅胶薄层板上条带状上样、展开在254nm紫外灯下检视的色谱条带。图6为中药桑白皮提取物的こ酸こ酯萃取物在硅胶薄层板上条带状上样、展开在365nm紫外灯下检视的色谱条带。图7为中药桑白皮提取物的こ酸こ酯萃取物色谱分离定位并区域划分后各个样品色谱带组分对应的酪氨酸酶抑制活性。

桑白皮粗提物的制备
桑白皮药材粉碎，称量50g粉末，加60%的こ醇300ml于500ml圆底烧瓶内，80°C回流75min，提取三次，过滤，合并提取液，旋转蒸发减压浓缩至干，得浸膏6. 5g，出膏率约为13%。用IOOml去离子水将上述浸膏溶解混悬，将混悬液转移至分液漏斗，用こ酸こ酯IOOml进行萃取三次。萃取液用无水硫酸钠脱水，合并浓缩回收こ酸こ酯至50ml，即得到中药桑白皮粗提物。第一歩粗提物的薄层色谱分离
吸取上述こ酸こ酯浓缩溶液，条带状点样于硅胶H薄层板上(O. 5mm),以氯仿与甲醇体积比6 1为展开剂,上行展开16cm,取出，晾干。第二步色谱带组分的显色定位和Rf值计算
薄层板放置于紫外灯下，在365nm和254nm波段观测计算相应色谱带组分的Rf值(图5、图6)，根据化合物的紫外光吸收色带进行组分定位。其中，Rf值的计算，请參阅图I为Rf值测定示意图所示，Rf = b/a =被测组分到点样原点之间的距离/溶剂前沿到点样原点之间距离的比值。然后放入碘缸，用碘蒸气显色，至斑点清晰，置可见光下检视，二次定位各化合物色谱条帯，并计算Rf值，计算方法同上。第三步色谱带组分的区域划分；
结合碘蒸气显色和紫外灯下观测上述两种方法，定位划分薄层色谱的条带组分，将整个薄层色谱板划分定位(图2和图3)。


本发明提供用于中药桑白皮美白化妆品活性物的初步筛选方法，把简单快速有效灵活的薄层色谱分离技术与化妆品活性物筛选结合，解决桑白皮应用于化妆品所产生的化学成分多体系复杂，物质基础不明确，有效物质不确定的问题。薄层色谱法对粗提物进行色谱分离，显色定位各个色谱带组分的位置并计算相应Rf值。然后将薄层色谱上的色谱带组分根据显色情况进行区域划分，洗脱提取，得到对应的若干样品溶液。最后测定体外酪氨酸酶酶活性抑制率，将各样品组分平行测定，进行美白活性追踪，进行活性成分初步筛选。用上述方法选择具有美白活性的组分，为进一步采用液相-质谱，红外光谱，核磁共振谱等现代方法进行美白成分确证提供前期初步筛选方法。