专利名称：一种用生物反应器和微载体逐级放大培养动物细胞的方法大规模细胞培养是通过哺乳动物细胞培养生产病毒疫苗或蛋白产品的有效途径，自从1967年Van Wezel成功利用二乙胺基乙基纤维素(DEAE)培养贴壁依赖性细胞以来，已开发了多种商业化的微载体，使得贴壁依赖性细胞贴附在微载体上利用生物反应器悬浮培养成为迄今最常用、最有效的细胞大规模培养模式之一。一般通过多级生物反应器连续放大培养获得工业化生产生物制品所需的细胞量。这需要将贴附在微载体上的动物细胞多次由较小规模生物反应器中接种至较大规模生物反应器，现有技术通常使用胰蛋白酶将细胞从微载体上消化下来，然后用生物反应器和微载体逐级放大培养动物细胞的方法在放大培养的过程中贴附在更多的微载体上。由于逐级放大培养过程(尤其是消化过程)中细胞的活力会遭到损伤，继而造成细胞贴附率降低、细胞收获率较小等问题，从而对放大培养比例造成了限制，阻碍了生物制品生广效率的提闻。
本发明的目的是克服现有用生物反应器和微载体逐级放大培养动物细胞的方法损伤细胞的活力而造成细胞贴附率降低、细胞收获率较小的缺点，提供一种新的用生物反应器和微载体逐级放大培养动物细胞的方法，该方法减小了对细胞所造成的损伤，可使细胞贴附率升高、细胞收获率变大。本发明提供了一种用生物反应器和微载体逐级放大培养动物细胞的方法，所述方法包括以下步骤I)提供动物细胞已贴附在微载体上的细胞培养混合物，其中，所述细胞培养混合物通过在种子生物反应器中培养获得，并且在该细胞培养混合物中所述微载体的浓度为2-20g/L，所述动物细胞在微载体上的汇合度不小于80% ；2)消化所述细胞培养混合物中贴附在微载体上的动物细胞，其包括以下步骤2-1)停止种子生物反应器的搅拌，使所述贴附有动物细胞的微载体自然沉降；2-2)去除步骤2-1)所得的种子生物反应器中的上清培养液，用pH为7. 4-8. 0的洗涤液洗涤所得贴附有动物细胞的微载体；2-3)用消化液从微载体上消化动物细胞去除步骤2-2)所述洗涤液，向种子生物反应器加入pH值为7. 4-8. 0的消化液，消化的条件如下消化温度36-38°C ；种子生物反应器转速20-100rpm ;消化液体积下一级扩增生物反应器培养体积的1% -15% ；消化终点在大于80%的动物细胞从微载体上脱落时，其中，所述脱落的动物细胞的活力大于等于90%，加入含血清的或含消化液抑制剂的新鲜动物细胞培养液终止消化，得到包括有已分离的微载体和动物细胞的混合液；3)将步骤2)所得混合液接种至扩增生物反应器，其中，所述扩增生物反应器中添加有未贴附动物细胞的空微载体和新鲜培养基，接种后所述扩增生物反应器中微载体的终浓度为2-20g/L，所述动物细胞的接种密度为I X IO5至I X IO6 细胞/mL ；4)在扩增生物反应器中进行扩增培养。本发明的有益效果体现在如下几个方面首先，本发明的发明人发现在碱性pH下细胞粘附较弱，通过对洗涤液pH控制，同时结合生物反应器搅拌强度、洗涤时间、洗涤液体积、洗涤液中EDTA含量等主要工艺参数确定，在全面去除细胞培养基及血清的同时，减弱细胞与贴附基质之间的作用力，保证了下一步消化液中消化作用的进行；其次，本发明根据消化液最适作用pH，限定消化液pH，同时结合消化温度、生物反应器转速、消化时间、消化液体积、消化液中EDTA含量等主要工艺参数确定，在最大限度减少动物细胞损伤同时提高细胞消化回收率；再次，本发明通过对消化回收细胞活力、下一级生物反应器微载体浓度、细胞密度等参数确定，保证了细胞悬液在下级生物反应器的正常快速生长；最后，本发明通过实验确定了最佳生物反应器体积放大比例，在保证细胞数量与活力的同时减少工艺耗时，提高生物制品生产效率。总之，与现有用生物反应器和微载体逐级放大培养动物细胞的方法相比，由于本发明的方法，严格控制了动物细胞的消化程度，减小了现有技术在放大培养动物细胞过程中的消化等操作对细胞所造成的损伤，最终保证了放大培养的细胞收获率和所收获细胞的质量(细胞活力)，同时使细胞能够应用于较大的放大比例，从而减少了放大培养的次数。7.4-8. 0 ;消化时间为5-15min ;步骤A)中将动物细胞贴附到微载体上的培养条件如下培养温度36-38°C ;pH值为7. 0-7. 8 ;搅拌转速20_100rpm ;溶氧20% -80%。一般情况下，本发明步骤I)中的步骤A)用以获得用生物反应器和微载体逐级放大培养动物细胞所需的起始种子细胞，通常只进行一次。所述步骤B)中消化动物细胞的条件与以上所述的步骤2)相同，其将动物细胞贴附到微载体上的培养条件与以上所述的步骤3)相同。本发明所述的用生物反应器和微载体逐级放大培养动物细胞的方法中的步骤I)至4)可反复循环，直至获得利用生物反应器进行生物制品工业化生产所需的细胞数量。即步骤4)扩增生物反应器中得到的扩增产物，可以作为步骤I)所述的动物细胞已贴附在微载体上的细胞培养混合物。本发明所述的种子生物反应器和扩增生物反应器可为例如搅拌式生物反应器、气升式生物反应器、WAVE生物反应器、中空纤维反应器等的生物培养器。所述动物细胞由种子生物反应器至扩增生物反应器的生物反应器体积放大比例为I : 2至I : 20，更优选I : 5至I : 20，还优选I : 8至I : 15，最优选I : 10至I : 15。所述生物反应器放大比例是指，种子生物反应器中最终培养体积与扩增生物反应器中最终培养体积的比例。生物反应器微载体放大培养级数指实现特定放大比例所进行的生物反应器微载体培养次数的总和。本发明中所述的洗涤液优选为无钙离子且无镁离子的平衡盐溶液，更优选为包含 0. 01% -0. 03% (w/v)EDTA的无钙离子且无镁离子的平衡盐溶液。本发明中所述的消化液优选为包含0. 1-0.5% (w/v)胰蛋白酶的无钙离子且无镁离子的平衡盐溶液，更优选还包含0.01-0. 03% (w/v)的EDTA，可以消化难被消化的细胞。本发明中所述EDTA指乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid)或其盐，如乙二胺四乙酸一钠、乙二胺四乙酸二钠。其主要作用在于排除Ca2+、Mg2+等离子，使细胞之间裂解，以分散细胞。本发明中所述平衡盐溶液(Balanced Salt Solution BSS)又称生理盐水或盐溶液，其本身具有维持渗透压，调控酸、碱度平衡的作用，同时能供给细胞生存所需的能量和无机离子成分；用以洗涤组织、细胞以及配制各种培养用液的基础溶液，例如可为Ringer液、PBS液、Tyrode液、Earle’ s液、Hanks’液、Dulbecco液、D-Hanks液和Eagle液等平衡盐溶液。由于韩、镁离子是细胞膜的重要组成成分，它们有促使细胞凝聚作用。因而配制离散细胞用的消化液和细胞洗涤液时，宜采用钙、镁离子含量低的Dulbecco液和无钙、镁的D-Hanks液，或更为简单的PBS液。一般情况下，生物制品是指应用普通的或以基因工程、细胞工程、蛋白质工程、发酵工程等生物技术获得的微生物、细胞及各种动物和人源的组织和液体等生物材料制备的，用于疾病预防、治疗和诊断的药品。本发明中的生物制品则是指以细胞为生物材料制备的用于人类疾病预防、治疗和诊断的药品，如疫苗、单克隆抗体等。即利用本发明的方法培养获得的动物细胞可以用于生产病毒疫苗(例如，用作宿主)或蛋白产品(例如，用作基因工程工具细胞)。本发明中所述细胞包括所有生物制品生产最常用的贴壁生长细胞或兼性贴壁细胞，例如哺乳动物传代细胞，如非洲绿猴肾细胞的传代细胞系Vero细胞、幼仔地鼠肾的传代细胞系BHK21细胞、猴肾细胞的传代细胞系Marcl45细胞、中华仓鼠卵巢细胞的传代细胞系CHO细胞、猪肾细胞的传代细胞系PK15细胞或猪睾丸细胞的传代细胞系ST细胞、狗肾传代细胞系MDCK细胞等；例如人二倍体细胞，如2BS细胞、KMB-17, MRC-5细胞等。本发明中所述细胞培养液没有特别限定，可使用所有能用于细胞培养的常用细胞培养基，如基础MEM细胞培养基、基础DMEM细胞培养基以及改良型MEM细胞培养基等。很多细胞培养基都已经是商业化产品，可以通过商业途径获得。本发明中所述载体没有特别限定，可为所有能用于细胞培养的常用微载体，很多微载体都已经是商业化产品，可以通过商业途径获得。优选所述微载体为Cytodex系列微载体、Cytopore系列微载体、Cytoline系列微载体和/或FibmCel Disks微载体。除非特别说明，本发明使用的各种试剂均可以商购，也可以采用本领域常用的方法制备。用于细胞培养的试剂，不仅纯度要求高，优选分析纯，而且不能存在任何影响细胞正常生理活动的物质，因此还需要符合医药制品的要求，优选注射级原料药。实施例II)提供动物细胞已贴附在微载体上的细胞培养混合物，1-1)复苏、扩增培养Marc 145细胞将从液氮中取出的冻存Marcl45细胞立即放入37°C水浴中解冻；将ImL的冻存细胞液加入到5mL的新鲜细胞培养液中，轻轻混勻；在800rpm下离心5分钟，弃上清液；向细胞沉淀中加入5mL新鲜细胞培养液，轻轻混匀后，转移至T75细胞培养瓶(培养面积75cm2的方形细胞培养瓶)中，添加细胞生长液至20mL，在37°C，5% CO2培养箱中培养至细胞生长至良好单层；倾去T75细胞培养瓶中培养基，加入ImL含0. 02 % EDTA的胰蛋白酶消化液，在37°C下消化至细胞附着松动、细胞边缘卷起且细胞间的间隔加大，倒去消化液，加入新鲜细胞培养液后吹打，得到游离细胞悬液；将所获得的细胞悬液接种至15L转瓶，并向转瓶中加入新鲜细胞培养液使所述接种细胞的终密度为2 X IO5个细胞/mL ;然后在37°C、pH 7. 2、转速12rph的条件下培养至细胞生长至良好单层；倾去转瓶中培养液，加入ImL的含0. 02% EDTA的胰蛋白酶消化液，在37°C下消化至细胞附着松动、细胞边缘卷起且细胞间的间隔加大，倒去消化液，加入新鲜细胞培养液后重悬细胞，获得细胞总数为4X IO8的游离细胞悬液；其中，所述细胞培养液为适用于Marcl45细胞培养的改良DMEM细胞培养基(Cat No. MD210，北京清大天一科技有限公司)。1-2)在5L生物反应器中微载体培养Marc 145细胞 预先水化微载体，并对承载水化微载体的5L生物反应器(德国贝朗医疗有限公司)生物反应器进行在位清洗和灭菌。将步骤1-1)获得的细胞悬液接种至所述生物反应器中，细胞培养体积为4L。其中所述微载体为Cytodexl (美国GE医疗集团生命科学部)，微载体量为3g/L，所述接种细胞的密度为IX IO5细胞/mL ;然后在37°C、pH 7. 2、溶氧50%的条件下，培养获得在微载体上贴附有单层细胞的细胞培养混合物；2)消化所述细胞培养混合物中贴附在微载体上的动物细胞2-1)当生物反应器中细胞汇合度为80%时，培养细胞的密度达2X IO6个细胞/mL，停止种子生物反应器(5L生物反应器)的搅拌，使所述贴附有细胞的微载体自然沉降；2-2)泵出上清培养液，向5L生物反应器加入预热至37V的pH7. 4的无Ca2+，Mg2+离子的磷酸缓冲液(PBS),以IOOrpm的搅拌速度洗漆生物反应器中微载体2遍,每次5min。所述EDTA-PBS溶液使用量为500mL/g ；2-3)用消化液从微载体上消化动物细胞，收获5L生物反应器中细胞泵出所述洗涤废液(pH 7. 2)，向种子生物反应器(5L生物反应器)加入预热至37°C的pH值为7. 4的消化液(含0. 1% (w/v)胰蛋白酶的磷酸缓冲液(PBS))，以如下条件从微载体上消化细胞消化液体积800mL ;温度36°C ;生物反应器转速20rpm ;间隔5min取样在光学显微镜下观察，10分钟后，80%细胞从微载体脱落，直接添加含5%血清的新鲜细胞培养液终止消化作用，即得到微载体与细胞分离开来的混合液。利用血球计数板对消化后游离的细胞进行细胞计数，所得结果除以消化前细胞计数的结果，计算得到细胞回收率为100%。利用台盼蓝排斥实验测得细胞活力为98% ；3)在120L生物反应器中接种培养Marcl45细胞预先水化微载体，并对承载水化微载体的120L生物反应器(北京清大天一科技有限公司)生物反应器进行在位清洗和灭菌。将步骤2)所得混合液接种至扩增生物反应器(120L生物反应器)，其中，所述扩增生物反应器中添加有未贴附动物细胞的空微载体和新鲜培养基，细胞培养体积为80L，接种后所述扩增生物反应器中微载体的终浓度为2g/L，所述动物细胞的接种密度为I X IO5细胞/mL ;单次放大比例为20倍；4)在37°C、pH 7. 2、溶氧50%的条件下，于扩增生物反应器中进行扩增培养，直至所述微载体上贴附有单层细胞。利用台盼蓝排斥实验测得所得动物细胞活力为98%。在上述步骤中所述“预先水化微载体，并在位清洗和灭菌生物反应器”是指，提前按照以下操作水化微载体以及对承载水化微载体的生物反应器清洗和灭菌
将微载体与50mL/g的量的无Ca2+和Mg2+的PBS液混合，在室温下开始水化，其间每15min以IOOrpm的转速搅拌2分钟，水化过夜后，停止搅拌，自然沉降，弃去上清，完成预处理；加入30mL/g的量的新鲜无Ca2+和Mg2+的PBS液,然后每15min以IOOrpm的转速搅拌2分钟，30min后停止搅拌，自然沉降，弃去上清液，完成洗涤；重复所述洗涤3次，弃去用于洗涤的上清液PBS ；加入30mL/g的量的新鲜无Ca2+和Mg2+的PBS液，得到水化的微载体；
然后将水化微载体置于反应器罐体；连接反应器各个管路，121°C高压湿热灭菌30min ；无菌排出无Ca2+和Mg2+的PBS液，加入无菌的新鲜细胞培养液，对灭菌后的水化微载体润洗一次，排出润洗液，再加入培养体积的无菌的新鲜细胞培养液。5)重复放大培养过程即以步骤4)中的扩增生物反应器作为种子生物反应器，将其中的细胞培养混合物消化后接种至650L 二次扩增生物反应器(培养体积400L)中，继续进行放大培养。所述重复放大培养过程与第一次扩增反应器培养的条件一致。6)本实施例放大培养效果评价本实施例总的放大培养倍数100倍。达到上述放大倍数的放大培养级数为3级。实施例2-4按照表I记载的条件，按照与实施例I相同的操作，进行了实施例2-4，得到可用于下游生物制品生产的大规模培养动物细胞。表I
条件__实施例2__实施例3__实施例4_
细胞_j MDCK细胞系I ST细胞系 I Vero细胞系
步骤I )
提供动物细胞已贴T75细胞培养瓶T75细胞培养T75细胞培养瓶-附在微载体上的细-转瓶-细胞工厂瓶-T175细胞转瓶-细胞工厂胞培养混合物培养瓶-旋转培___养瓶__


本发明涉及一种用生物反应器和微载体逐级放大培养动物细胞的方法，所述方法包括以下步骤1)提供动物细胞已贴附在微载体上的细胞培养混合物，2)消化所述细胞培养混合物中贴附在微载体上的动物细胞，3)将步骤2)所得混合液接种至扩增生物反应器，以及4)在扩增生物反应器中进行扩增培养。使用本发明的方法，由于严格控制了动物细胞的消化程度，减小了现有技术在放大培养动物细胞过程中的消化等操作对细胞所造成的损伤，从而保持了细胞在培养过程中的活力，保证了放大培养的细胞收获率和所收获细胞的质量。