专利名称：多层管状结构细胞培养支架及其制备方法和用途的制作方法组织工程的本质是用活细胞构建一种新的有功能的组织，这些细胞以某种方式与细胞外基质或支架材料相结合，细胞基质和支架材料引导组织的发育。利用组织工程方法在体外构建人造器官，再植入体内，在许多疾病的治疗特别是器官的修复具有很好的前景。这其中，更真实的模拟体内器官多种细胞在细胞外基质上生长和分布情况，让人造器官实现原有功能，成为研究的难点和热点。体内许多器官的结构是管状结构，如血管、肾小管、肠道、淋巴管、输卵管等，除了管状结构外，这些组织大部分都具有一个共同特点:管壁都是有多层不同的细胞构成(少数除外，比如肾小管、毛细血管和淋巴管)。在组织工程领域有许多文献报道了管状结构组织工程支架的制备方法。其基本思路是高分子材料依靠柱状或管状模具成型后，将细胞种植在管状结构上，培养形成细胞-材料复合物，或是将细胞种植在平面上，再依靠管状模具将平面卷起来。现今主要有两种多层细胞管状结构制备方法:第一种，将多层细胞逐层地卷曲在圆柱形模子外侧，经过长时间培养(至少三个月)，使细胞层之间形成连接，最终形成管状结构。第二种，将细胞种植在薄膜表面，然后手动将薄膜叠在一起卷曲成卷，并在外部用O形环固定，使之保持管状结构。其存在的问题为:培养时间长，由于需要手动卷曲，并需要用O形环将管状结构固定，存在着人为因素对管状结构的影响。管状结构中细胞生长的极性与真实器官不符；更不可能实现多种细胞在材料上的可控分布生长。
因此，本发明的目的是针对现有技术存在的培养时间长；需要手动卷曲，并需要用O形环将管状结构固定这些人为因素对管状结构的影响；管状结构中细胞生长的极性与真实器官不符；更不可能实现多种细胞在材料上的可控分布生长的不足，提供一种多层管状结构细胞培养支架及其制备方法和用途，具体为将单种或多种细胞层状分布在多层管状结构细胞培养支架的方法及由该方法制得的单种或多种细胞层状分布的三维管状结构的用途，以实现管状结构中细胞生长的极性与真实器官相符并且实现多种细胞在材料上可控地分布生长。针对上述目的，一方面，本发明提供一种多层管状结构细胞培养支架，该支架包括高分子弹性膜层和与其贴合的高分子固定层，所述高分子弹性膜层的弹性使得所述支架自动卷曲成多层管状结构。 优选地，所述高分子弹性膜层为聚二甲基硅氧烷(PDMS)或丙三醇-癸二酸共聚物(PGS)弹性膜层。优选地，所述高分子弹性膜层为带有多孔结构的弹性膜层或由两条弹性条带构成的弹性膜层。优选地，所述高分子固定层由聚二甲基硅氧烷弹性膜或丙三醇-癸二酸共聚物弹性膜层或其他具有柔韧性的高分子薄膜构成。优选地，所述高分子薄膜为电纺丝薄膜。优选地，当所述高分子固定层由聚二甲基硅氧烷弹性膜或丙三醇-癸二酸共聚物弹性膜层构成时，所述高分子固定层下表面设有微槽结构。优选地，当所述高分子固定层由具有柔韧性的高分子薄膜构成时，所述高分子弹性膜层与高分子固定层通过粘合剂层贴合。另一方面，本发明还提供一种多层管状结构细胞培养支架的制备方法，包括以下步骤:1)制备高分子弹性薄膜；2)制备高分子固定层；3)将高分子弹性薄膜拉伸后贴合在高分子固定层上成双层复合膜；4)将上述步骤3)所得双层复合膜释放后，自卷曲形成多层管状结构。优选地，在步骤I)中，所述高分子弹性膜层为聚二甲基硅氧烷或丙三醇-癸二酸共聚物弹性膜层，其是通过包括下述步骤的方法制备的:将聚二甲基硅氧烷预聚物反应液或熔融状态的丙三醇-癸二酸预聚物旋涂于模板的基底上成薄膜，之后再经过高温反应固化交联成弹性薄膜，即得；优选地，所述聚二甲基硅氧烷预聚物反应液由聚二甲基硅氧烷预聚物与固化剂以10: I体积比组成；优选地，所述聚二甲基硅氧烷预聚物反应液或熔融状态的丙三醇-癸二酸预聚物在匀胶机中旋涂于模板的基底上，所述匀胶机的转速为IOOOrpm 6000rpm，时间是30s 60s ；优选地，当所述高分子弹性膜层为聚二甲基硅氧烷弹性膜时，所述高温反应条件为 80-150°C烘烤 5-30min ;或当所述高分子弹性膜层为丙三醇-癸二酸共聚物弹性膜层时，所述高温反应条件为于真空干燥箱内，真空度为30 50mTorr，120_150°C反应24 48h ;更为优选地，所述模板的基底经等离子体处理后，再用匀胶机旋涂蔗糖水溶液于模板的基底上，所述匀胶机的转速为1000 3000rpm，旋涂时间是30 60s。更为优选地，当所述高分子弹性膜层为带有多孔结构的弹性膜层时，在将聚二甲基硅氧烷预聚物反应液或熔融状态的丙三醇-癸二酸预聚物旋涂成薄膜之前，还包括通过光刻制备柱状微阵列模板，再将其通过全氟硅烷处理的步骤；更优选地，所述模板的基底为单晶硅片。优选地，在步骤2)中，所述高分子固定层由聚二甲基硅氧烷预聚物弹性膜或丙三醇-癸二酸预聚物弹性膜层或其他具有柔韧性的高分子薄膜构成，优选地，所述具有柔韧性的高分子薄膜为电纺丝薄膜；优选地，当所述高分子固定层由聚二甲基硅氧烷预聚物弹性膜或丙三醇-癸二酸预聚物弹性膜层构成时，所述高分子固定层下表面设有微槽结构；其是通过包括下述步骤的方法制备的:将聚二甲基硅氧烷预聚物反应液或熔融状态的丙三醇-癸二酸预聚物旋涂于模板的基底上成薄膜，之后再经过高温反应，即得，优选地，高温反应至所述聚二甲基硅氧烷预聚物反应液达到半固化交联状态；优选地，所述聚二甲基硅氧烷预聚物反应液由聚二甲基硅氧烷预聚物与固化剂以10: I体积比组成；优选地，所述聚二甲基硅氧烷预聚物反应液或熔融状态的丙三醇-癸二酸预聚物在匀胶机中旋涂于模板的基底上，所述勻胶机的转速为IOOOrpm 6000rpm,时间是30s 60s ；优选地，当所述高分子固定层由聚二甲基硅氧烷弹性膜构成时，所述高温反应条件为 80-150°C烘烤 5-30min ;或优选地，当所述高分子固定层由丙三醇-癸二酸共聚物弹性膜构成时，其是通过包括下述步骤的方法制备的:将丙三醇-癸二酸的预聚物在熔融状态下通过旋涂或流延的方法形成薄膜，之后再经过真空高温反应固化交联成弹性薄膜；更为优选地，熔融温度为120 150°C，高温真空反应条件为真空度为30 50mTorr环境下120 150°C反应24 48h ;或优选地，当所述高分子薄膜为电纺丝薄膜时，其是通过包括下述步骤的方法制备的:配制高分子电纺丝溶液，再将其放入电纺丝装置的注射针筒中，获得静电纺丝薄膜；或优选地，当所述高分子固定层下表面设有微槽结构时，在将聚二甲基硅氧烷预聚物反应液或熔融状态的丙三醇-癸二酸预聚物旋涂成薄膜之前，还包括通过光刻制备柱状微阵列模板，再将其通过全氟硅烷处理的步骤。更为优选地，所述模板的基底为单晶硅片或载玻片。优选地，在步骤3)中，其是通过包括下述步骤的方法制备的:当所述的高分子弹性膜层和高分子固定层均由聚二甲基硅氧烷构成时，将半固化的高分子固定层放置在固定轨道上，再将拉伸后的高分子弹性膜层和高分子固定层贴合后加热使其完全固化，优选地，于80°C 150°C烘箱中加热15 35min，优选地，所述高分子弹性膜层通过拉伸装置进行拉伸，优选地，所述拉伸装置包括两个`夹具和与配套的固定轨道。优选地，当所述高分子弹性膜层和高分子固定层均由丙三醇-癸二酸预聚物弹性膜构成时，将高分子弹性膜层和高分子固定层贴合前，还包括将高分子弹性膜层和高分子固定层的接触面都经过等离子体处理，再将高分子弹性膜层拉伸与高分子固定层贴合的步骤，优选地，等离子体处理1.5min ;或当所述高分子弹性膜层为多孔结构的弹性膜层时，还包括在高分子弹性膜层和高分子固定层之间涂抹聚二甲基硅氧烷预聚物反应液的步骤；或当所述高分子固定层通过具有柔韧性的高分子薄膜构成时，在高分子弹性膜层和高分子固定层贴合前，还包括在高分子弹性膜层和高分子固定层之间均匀涂覆粘合剂的步骤。优选地，在步骤4)中，具体通过以下方法进行:将贴合牢固的高分子固定层和高分子弹性膜层从基底和夹具上剥离释放，高分子固定层和高分子弹性膜层共同自发卷曲成多层管状结构的细胞培养支架，即得；优选地，所述模板的基底为单晶硅片或载玻片。再一方面本发明提供一种将单种/多种细胞层状分布在多层管状结构细胞培养支架的方法，包括以下步骤:I)将上述的细胞培养支架或将上述方法制得的细胞培养支架平整地固定于培养皿底部；2)制备聚二甲基硅氧烷微流管道，并将其紧密贴合在步骤I)中的细胞培养支架表面；3)在聚二甲基硅氧烷微流管道中通入细胞外基质蛋白，孵育，优选地，所述细胞外基质蛋白为纤维连接蛋白(fibronectin, FN)或层粘连蛋白(laminin, LN)；4)在聚二甲基硅氧烷微流管道的不同管道分别通入单种/多种细胞悬液；5)细胞贴壁后，将聚二甲基硅氧烷微流管道揭去，释放载有细胞的自卷曲高分子膜，形成具有单种/多种细胞层状分布的三维管状结构，即得。优选地，在步骤2)中，所述聚二甲基硅氧烷微流管道过软刻蚀的技术制得，优选地，聚二甲基硅氧烷微流管道的模板通过光刻的方法在硅片上制备，或通过机械加工的方法在有机玻璃上刻出图案，经聚二甲基硅氧烷一次翻模和二次翻模制备而得。又一方面，本发明还提供一种由上述方法制得的单种/多种细胞层状分布的三维管状结构的用途，所述三维管状结构用于模拟血管或肠道等多种细胞层状分布管状结构的人体器官、用于病变或受损器官修复和作为体外研究模型。本发明的有益效果为:不仅能够制备多层细胞的管状结构，而且优点明显，首先，不需要圆柱体作为依托和手动卷曲。因为本发明的卷曲材料为自卷曲弹性薄膜，可以自动卷曲，不需要三个月培养， 只需两天，然后将薄膜释放，其就可以自动成卷，释放后薄膜会自动卷曲，这样去除了人为因素的影响，更重要的是本发明的薄膜为内部应力驱动的，不需要外部O形环固定；在三维管状结构中实现多种细胞的可控层状分布，更真实模拟体内管状组织结构。解决组织工程学中存在的问题，比如:小尺寸(小于6毫米)人造血管易造成血管堵塞问题。
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中:图1为本发明所述的多种细胞层状分布在多层管状结构细胞培养支架的制备方法的原理图，A中I为被拉伸的PDMS薄膜的高分子弹性膜层，2为固定的高分子固定层(PDMS薄膜)，3为基底，箭头为拉伸方向；B中4为微流管道，5为粘合后的双层自卷曲膜；C中6为不同细胞通入微流管道中不同通道内；D1中7为揭去管道后，管道中不同细胞被限定在不同区域，D2中8为纵向排列的细胞，9为横向排列的细胞；E1为Dl释放后形成的三层细胞管状结构，E2为D2释放后形成的四层细胞管状结构；图2本发明所述拉伸装置，图2A为本发明所述拉伸装置的俯视图，图2B为本发明所述拉伸装置的照片，图2C为正在拉伸高分子弹性膜层的本发明所述拉伸装置的照片，其中I为拉伸装置，2为高分子弹性膜；图3为本发明所述多孔结构的PDMS自卷曲薄膜的制备方法示意图，其中，A中I为被拉伸的多孔PDMS薄膜的高分子弹性膜层，2为具有高分子薄膜(电纺丝膜)的高分子固定层，3为基底，箭头为拉伸方向；B中高分子弹性膜层和高分子固定层粘合在一起；C中释放双层膜自发卷曲成多层管状结构；图4为本发明所述电纺丝薄膜的自卷曲膜制备方法示意图，其中，A中I为被拉伸的PDMS条带的高分子弹性膜层，2为静电纺丝薄膜的高分子固定层，3为基底，箭头为拉伸方向；B中被拉伸的PDMS条带和静电纺丝薄膜粘合在一起；C中释放PDMS条带和静电纺丝膜后自发卷曲成多层管状结构；图5为本发明所述的多种细胞层状分布的三维管状结构激光共聚焦荧光显微镜照片，图中A为揭去微流管道后三种细胞在平面PDMS自卷曲膜的分布情况，三种细胞分别染上不同颜色的荧光为释放载有细胞的自卷曲PDMS膜后管壁的各层；C*B的局部放大图；图6为本发明所述的多层电纺丝管状结构细胞培养支架的扫描电子显微镜照片，A为聚己内酯(PCL)电纺丝，B为PCL自卷曲纺丝膜形成的多层管状结构(即，多层管状结构细胞培养支架)；图7为本发明所述的多孔结构的自卷曲薄膜(即，多层管状结构细胞培养支架)扫描电镜照片，A为多孔结构的自卷曲膜形成的管状结构；B为六中矩形框局部放大照片；图8为本发明所述的具有上皮细胞层状分布管状结构的激光共聚焦荧光显微镜照片；图9为本发明所述的具有环形和纵形细胞排列的三种细胞层状分布管状结构的激光共聚焦荧光显微镜照片，A为三种细胞层状分布管状结构；B为中间层平滑肌细胞横向排列的局部放大照片；C为中间层平滑肌细胞纵向排列的局部放大照片。

高分子固定层为电纺丝薄膜的自卷曲膜(B卩，多层管状结构细胞培养支架)制备，具体步骤如下:(I)制备高分子弹性膜层，即PDMS薄膜:预聚物和固化剂按照10: I的体积比例配制PDMS预聚物反应液，在匀胶机中旋涂于光滑单晶硅片的表面，转速为lOOOrpm，时间是45s。放在鼓风干燥箱中150°C烘烤5min，从烘箱中取出，将PDMS薄膜从硅片上揭下。(2)制备高分子固定层，即电纺丝薄膜:配制高分子电纺丝溶液，例如:20Wt%聚乙交酯丙交酯预聚物(PLGA)溶液，以丙酮/N，N-二甲基甲酰胺(质量比为2: I)为混合溶剂或20wt%聚己内酯(PCL)溶液，以二氯甲烷/N，N-二甲基甲酰胺(质量比为3: I)为混合溶剂，放入电纺丝装置的注射针筒中，金属针头加正高压，接收铝箔或不锈钢网接地，获得静电纺丝薄膜。(3)把电纺丝膜放置载玻片上并置于固定轨道上。将PDMS薄膜切割成PDMS条带，条带按一定间距放入夹具 中，一般条带的数目是两条，拉伸后与电纺丝膜贴合，之间涂覆硅胶粘合剂层，等待粘合剂层固化。(4)将PDMS条带从夹具中释放，即可获得电纺丝自卷曲膜，即多层管状结构细胞培养支架(如图6所示)。实施例5按照与实施例3相同的方法制备微槽结构的PDMS自卷曲薄膜，所不同的是，在(I)制备高分子弹性膜层中，放在鼓风干燥箱中120°C烘烤18min ;在(2)制备具有微槽结构的高分子固定层中，也放在鼓风干燥箱中120°C烘烤18分钟，在步骤(3)中，高分子弹性膜层贴合在高分子固定层上后放在烘箱中，于115°C烘烤25min后取出。实施例6PGS (制备方法和性质见文献 Nature Biotechnology, VOLUME 20，2002，602-606)
自卷曲膜(即，多层管状结构细胞培养支架)的制备。(I)高分子弹性膜层，即PGS薄膜的制备:单晶硅片经等离子体处理5min，用匀胶机旋涂61.5%蔗糖水溶液于硅片上，转速为3000rpm，时间是60s。在烘箱内135°C烘烤IOmin0将PGS预聚物在120°C熔融，随后旋涂到涂覆蔗糖的硅片上，转速是1500rpm，时间是60s。随后在真空干燥箱内(真空度为30mTorr) 120°C反应48h。(2)将PGS薄膜从硅片上小心揭下，高分子弹性膜层在夹具中夹好，高分子固定层膜平铺在载玻片上放置在固定轨道上，两层膜膜接触面都经过等离子体处理1.5min，拉伸高分子弹性膜层贴合在高分子固定层上，放入烘箱中80°C烘烤30min。(3)将PGS双层膜从夹具中释放，即可获得PGS自卷曲膜，即多层管状结构细胞培养支架，其特点是可以完全降解。实施例7-9按照与实施例6相同的方法制备PGS自卷曲膜，不同的条件如下:


本发明提供一种多层管状结构细胞培养支架及其制备方法和用途，该支架包括位于高分子弹性膜层和与其贴合的高分子固定层，所述高分子弹性膜层的弹性使得所述支架自动卷曲成多层管状结构；所述该细胞培养支架的制备方法，包括以下步骤高分子弹性薄膜的制备；高分子固定层的制备；高分子弹性薄膜的拉伸及将其贴合在高分子固定层上；管状结构的成型；所述用途为提供一种将单种/多种细胞层状分布在多层管状结构细胞培养支架的方法及由该方法制得的单种/多种细胞层状分布的三维管状结构的用途，其用于模拟血管或肠道多种细胞层状分布的人体器官、用于病变或受损器官修复和作为体外研究模型。