专利名称：一种保持在体生理状态的原代呼吸道上皮细胞的培养基的制作方法呼吸道上皮细胞构成了从鼻腔到终末细支气管的第一道天然屏障，是病原体经呼吸道侵入机体后产生炎症反应的主要起始部位。国内外大多采用AM9，16HBE, BEAS-2B等细胞系复制呼吸道疾病的细胞模型，用以研究微生物感染和炎症反应等。然而A549，16HBE 等这类细胞系本身来源于肿瘤细胞，或是如BEAS-2B由正常呼吸道上皮细胞与肿瘤细胞融合后而得到永生化成为细胞系，它们的生理特征与在体细胞差异较大，对呼吸道疾病的细胞学研究产生了一定的局限性。因此，原代培养呼吸道上皮细胞，并使其生理上接近在体状态，具有重要价值。呼吸道上皮细胞附着于基膜生长，共同构成呼吸道的假复层柱状纤毛上皮，其表面的纤毛有节律地向咽部运动，在机体排除呼吸道刺激性异物的过程中发挥了重要作用。 基膜是上皮细胞基底面与深部的结缔组织之间的薄膜，由以下两部分组成靠近上皮的部分成为基板，主要由黏连蛋白、胶原蛋白和硫酸肝素多糖等构成；与结缔组织相接的部分为网板。呼吸道与外界直接相通，使呼吸道上皮细胞有较多机会接触病原微生物，其生长微环境中存在着强大的抗感染生物因素。由于极易遭受外界刺激而损伤，为维持稳态，局部环境中富含一些刺激因子，它们均作用于呼吸道上皮细胞使其具备旺盛的自我更新能力。由于受这种特殊的生长条件限制，而现有的常规培养基未能够营造出适宜呼吸道上皮细胞生长的微环境，该种细胞原代培养较难。
本发明所要解决的技术问题是在于提供一种原代呼吸道上皮细胞的培养基，该培养基所培养的原代呼吸道上皮细胞具有纤毛摆动功能，保持其在体生理状态。本发明解决上问题的技术方案为一种保持在体生理状态的原代呼吸道上皮细胞的培养基，其特征在于，每升所述培养基由以下组分组成DMEM/F12培养基12g，青霉素G钠盐30mg，链霉素50mg，胰岛素 IOmg,转铁蛋白5mg，表皮生长因子25 μ g，霍乱毒素100 μ g，氢化可的松108. 741 μ g，牛垂体提取物Ig,牛血清白蛋白3g，维甲酸1. 5 X 10_2 μ g，庆大霉素50mg,两性霉素BO. 5mg,胎牛血清50ml，其余为水。上述方案中的DMEM/F12培养基为美国invitrogen公司生产的产品，其产品代号为12500-096，产品的组成成分见产品说明书。本发明所述的培养基的制备方法如下所述按配比将青霉素、链霉素、胰岛素、转铁蛋白、表皮生长因子、霍乱毒素、氢化可的松、牛垂体提取物、牛血清白蛋白、维甲酸、庆大霉素、两性霉素B和胎牛血清加入到DMEM/ F12培养基中，加水至1升充分混勻，层流细胞培养室0. 22 μ m微孔滤膜过滤，收集滤液即可。本发明所述的培养基中，DMEM/F12作为基础培养液构成了细胞生长发育的基本微环境；胰岛素可通过促进细胞摄取葡糖糖和氨基酸，从而促进细胞增殖分裂；转铁蛋白能够结合铁离子，减少其毒性和被细胞所利用，同时可以减少培养过程中成纤维细胞的数量； 表皮生长因子对呼吸道上皮细胞有强烈的促分裂作用；牛垂体提取物含有多种促进细胞生长的成分，牛血清白蛋白则能够为包括表皮生长因子在内的多种生长因子提供载体，这些生长刺激物的存在，更有效地刺激了细胞的生长，提高了细胞的培养效果；霍乱毒素和维甲酸分别有促进细胞增殖分化和增强损伤修复的功能；氢化可的松能有助于呼吸道上皮细胞的生长发育；青霉素、链霉素、庆大霉素和两性霉素B共同构成了强大的防御屏障，对真菌、 革兰氏阳性和阴性细菌都有强效抑制作用，减少了污染风险。上述各组分的联合作用，使培养的原代呼吸道上皮细胞具有纤毛摆动功能，保留了原代呼吸道上皮细胞的在体生理状态。国外认为血清会抑制呼吸道上皮细胞的生长，因此目前普遍采用无血清培养。而本发明人的研究结果恰恰相反，培养液中含有胎牛血清非但对呼吸道上皮细胞的生长没有抑制作用，反而在一定程度上有助于细胞贴壁。另外，采用本发明所述的培养基所培养的原代呼吸道上皮细胞生长活力良好。目前，市售的原代呼吸道上皮细胞价格昂贵，且多数都已丧失纤毛摆动的节律运动，说明其生理状态与在体水平相差较大。本发明克服了上述缺点，且配制简单，可重复性强，操作简单易行，便于推广应用。本发明为有关呼吸道上皮细胞的科研、教学、医学应用提供了有利的物质条件，具有广泛的推广价值。图1为光学显微镜下连续拍摄的30张下述实施例所培养的原代呼吸道上皮细胞的全息照片。
本发明涉及人的局部活体部分的保存，具体涉及一种保持体外培养原代呼吸道上皮细胞在体生理状态的培养基，其特征在于，每升所述培养基由以下组分组成DMEM/F12培养基12g，青霉素G钠盐30mg，链霉素50mg，胰岛素10mg，转铁蛋白5mg，表皮生长因子25μg，霍乱毒素100μg，氢化可的松108.741μg，牛垂体提取物1g，牛血清白蛋白3g，维甲酸1.5×10-2μg，庆大霉素50mg，两性霉素B0.5mg，胎牛血清50ml，其余为水。本发明培养基所培养的原代呼吸道上皮细胞具有纤毛摆动功能，可保持其在体生理状态。