专利名称：一种分离培养肝脏原代细胞的方法原代细胞作为ー种体外模型，在基因功能研究方面有其突出的优点可同时获得大量性状较均一的样本；与生物体内情况基本保持一致，可以在接近生理状态的情况下研究基因的表达；排除许多复杂因素干扰，如神经、激素的干扰；原代肝细胞具有较好的体 外实验重现性，基本維持了肝脏的代谢功能，特别是很好的保留了与体内一致的细胞色素P450酶(cytochrome P450)的水平，基本保留肝脏原有的代谢功能和细胞分化状态。肝细胞Ofepatocytes)是肝脏最主要的实质细胞类型，生理状况下占60 %，属于高度分化的多功能、实质性脏器细胞。肝细胞既能高度分化，又能很快进入细胞周期而增殖，在体外培养体系中，根据研究目的的不同，既有支持其増殖的培养体系，也有支持其分化的培养体系。肝细胞离体后，在不适宜的环境中很快出现肝细胞衰老和失功能，PH值不适合、无激素支持导致细胞死亡，基因的激活造成细胞凋亡等。原代肝细胞在一般培养条件下，几小时内便丧失其缝隙连接，几天内丧失其组织特异性代谢活动。现有技术中常用的肝细胞分离方法是灌流法，传统灌流法操作环节多，时间长，肝细胞容易损伤，活力低、效率低，纯度不高。因此，迫切需要制备体外培养活力旺盛、功能良好的猪肝脏原代细胞以满足细胞生物学、组织培养技术等研究的要求。
本发明的目的在于提供一种分离培养肝脏原代细胞的方法，以克服上述现有技术中存在的缺陷。本发明提供的分离培养肝脏原代细胞的方法，包含以下步骤(I)从肝脏的肝门静脉输入灌流液；所述的灌流液，其IL配方为NaCl 8-9. 4g，KCl O. 2-0. 4，HEPES 2. 4-4. 8g,双蒸水定容至 1L, pH 值 7. 2-7. 4 ；(2)输入胶原酶灌流溶液，肝组织呈龟背状裂开后，停止灌流；(3)将消化成熟的肝脏浸泡于胶原酶溶液中；(4)加清洗液终止消化，过滤，收集肝细胞悬液；(5)离心，弃上清，用完全培养基重悬培养。所述步骤I)的肝脏为新鲜采集的离体肝脏，或新鲜离体肝脏经肝门静脉以80-100ml/min速度注射3倍以上肝体积的0_4°C预冷UW液，肝温降至10°C以下，保持1_4°C离体3h之内的肝脏。当肝温降至10°C以下后，可将肝脏置于冰盒或其他能够保持1_4°C的容器中保存肝脏不超过3h。本发明方法采用蠕动泵进行灌流，用无菌PBS排空蠕动泵管道内气泡。其中所述步骤(I)是以恒温37で灌流液开放灌流10-15min,流速50-60ml/min。其中所述步骤(2)胶原酶灌流溶液灌流流速50-60ml/min。其中所述步骤(2)的胶原酶灌流液，其IL配方为NaCl 8-9. 4g，KCl 0. 2-0. 4g，HEPES 2. 4-4. 8g，Na2HPO4O. 5-0. 6g，CaCl2O. 10-0. 15g，II 型或 IV 型胶原酶 0. 5g，双蒸水定容至1L。其中所述步骤⑶浸泡时间为5-10min。其中所述步骤(4)清洗液配方为NaCl 8-9. 4g，KCl 0. 2-0. 4g，HEPES 2. 4-4. 8g，Na2HPO4O. 5-0. 6g, CaCl2O. 10-0. 15g，双蒸水定容至 IL0其中所述步骤(4)过滤是将肝脏细胞悬液通过两层纱布和两层细胞筛，纱布和细胞筛均用清洗液浸润，所述细胞筛上层100目，下层200目。本发明分离培养肝脏原代细胞所用几种溶液的配方见表I。表I灌流液，胶原酶灌流液，清洗液配方表本发明提供一种分离培养肝脏原代细胞的方法，包括以下步骤1)从肝脏的肝门静脉输入灌流液；2)输入胶原酶灌流液；3)将消化成熟的肝脏浸泡于胶原酶灌流液中；4)加清洗液终止消化，过滤，收集肝细胞悬液；5)离心，弃上清，用完全培养基重悬，培养。本发明方法操作简单，成本低，稳定高效，肝细胞得率高，活力高，易贴壁。此法可在实验室推广，成为科学研究的常规方法。