专利名称：类黄酮浓缩物的制作方法 类黄酮是一类具有包括将其用作治疗剂、抗菌剂和抗氧化剂在内的广泛应用的植物化学物质。它们能够治疗和/或预防一定范围内的医学上的病症和疾病，举例来说包括诸如心脏病、阿尔茨海默病、痴呆和癌症这样的变性疾病。类黄酮的特征和特性充分公开在科学文献中。对‘天然’植物化学药物的需求正在逐渐增加且这种需求在世界人口的平均年龄稳步增加的同时也将进一步增加。此外，占这些人口中年龄较轻的部分为治疗或预防医学上的疾病而正在转向选择天然药物。此外，对不含有机溶剂残余物、特别是那些以工业化方式合成的残余物这样的物质和对使用以对环境影响最低的方式生产的产品存在强烈的需求。整个社会也认为使用对环境影响最低的可生物降解的物质和方法具有很高的价值。类黄酮是一小组植物多酚类、即由15个碳原子基础骨架组成的二环或三环结构。植物类黄酮苷元(即不含连接的糖的类黄酮)以不同结构形式出现。然而，所有结构形式均在其母核上含有15个碳原子且它们按照C6-C3-C6构型排列、即通过可以或不可以形成第三个环的3个碳单位连接的两个芳香环。类黄酮在饮食和药物中的重要作用正在越来越得到重视。正是红葡萄酒、绿茶、特级初榨橄榄油、大豆产品、水果和蔬菜、各种传统的草药药茶和药酒中的类黄酮至少部分导致因消耗它们而产生的有益作用。价值得到充分确立的一组类黄酮是异黄酮类。异黄酮类具有一定的特征结构并可形成特定的异构型类黄酮。异黄酮类的有益作用是广泛的，包括提示它们是导致东亚区一定人群中乳腺癌和前列腺(prostrate)癌发生率降低的传统东方饮食中的要素。尽管异黄酮类出现在其它科的植物中，但是它们绝大部分与豆科植物、特别是与豆科的蝶形花亚科极为相关，所述的蝶形花亚科包括许多众所周知的诸如三叶草、豆类植物(pulses-beans)、大豆和豌豆这样的饲料作物和诸如荆豆和金雀花这样的灌木。异黄酮类除对人和动物健康有益外，近来已经证实它们在动物饲料工业上的应用，其中给予补充了异黄酮类的饲料的猪表现出每日平均体重获得增加、但摄入的饲料并没有增加。猪的屠体肌肉的百分比也得到提高且每日估计的肌肉产生量较高。尽管在一个完美的世界中我们都希望从精细选择的食品、膳食和饮料中获得足够的这些化合物，但实际上尤其是对城市的劳动者来说，这通常恰恰是不可能的。因此，对可以便利和有效地用作饮食补充剂或治疗剂的富含类黄酮的制品存在需要和需求。
用于从种子中生产含类黄酮的浓缩物的现有技术一般存在下列缺点(i)仅含相对地低水平的类黄酮和(ii)它们导致原料类黄酮丢失并需要复杂的多步骤的处理以从废料中回收。
本发明寻求克服现有技术的缺陷并提供一种与现有技术方法相比以比较高的水平和产率获得植物浓缩物中类黄酮的简单而便利的方法。
本发明的公开本发明提供了一种从含有合适的类黄酮苷和/或其复合物的植物物质生产类黄酮苷元浓缩物的方法，该方法包括下列步骤(i)以酶促方式将类黄酮苷或其复合物转化成类黄酮苷元；和(ii)调节pH以使类黄酮苷元变得相对不溶并形成含有它们的浓缩物。
就本发明的目的而言，术语“类黄酮”是具有下列一般结构式的任意植物多酚或其二聚体、三聚体或聚合物 用于本发明目的的特定类黄酮包括查耳酮类(chalcones)；二氢查耳酮类(dihydrochalones)；噢哢类；黄烷酮类；黄酮类；新类黄酮；儿茶素类；黄酮醇类；二氢黄酮醇类；原花色素类；黄烷类；黄烷-3-醇类和双类黄酮；它们的各种甲氧基化和其它修饰形式，诸如复合物、诸如酰基复合物，而更具体地说，用于本发明目的的特定类黄酮包括金合欢素、芹菜配基、贝加因、柯因、金圣草黄素、橡精、dihydrobinetin、二氢莰非醇、地奥亭、儿茶酸、表儿茶酸、圣草酚、非瑟酮、黄颜木素、高良姜精、橙皮素、异鼠季亭、莰非醇、藤黄菌素/木犀草素、桑色素、杨梅黄酮、柚配基、木蝴蝶素A、ponciretin、六羟黄酮、五羟黄酮、刺槐亭、黄芩配基、水飞蓟素部分、水飞蓟素、异水飞蓟素、次水飞蓟素、黄芩新素II、福桔黄素、沃贡宁；以及异黄酮类，诸如染料木碱、黄豆苷原、7-羟基-4’-甲氧异黄酮、鹰嘴豆素A、baptenin和红车轴草素，它们具有下列一般结构通式
这些植物物质可以改变且优选包括含有类黄酮苷和/或其复合物的植物或植物部位或其制备物。植物物质特别包括叶；花瓣；萼片；花；叶柄；枝条；根；茎；种子；豆荚；块茎；树皮；形成层；木材；倍子；果实；蔬菜；草药；细菌；藻类；蕨类植物；树汁；树脂；外皮，诸如葡萄、苹果、洋葱和鳄梨的外皮；皮，包括柑桔属的皮；果实外皮；诸如苹果的苹果酱；果酒的果渣；谷物外皮；稻草；干草；来自橄榄、油菜籽或canola的含油种子饼；或其它含油作物的提取物。
优选地，植物物质是豆科植物种子原料诸如发芽或萌发种子，其包括在刚刚出根的预萌发阶段到还可看到苗芽的阶段的发芽种子。在这方面，已经发现发芽或萌发的豆科植物种子可包含有意义的异黄酮水平，因为(i)种子的原始内含物；和(ii)发芽后产生异黄酮。类黄酮的明显合成一般直到发芽相对前进时才进行。在室温下这常常要到至少第二天后。然而，相对于发芽后种子的重量的类黄酮水平在一段时间后(在室温下通常少于10天)达到稳定，且当幼苗继续发育成完整的成熟植物时在成长的植物中实际的异黄酮水平相对于其他成分诸如水溶性纤维，下降。
用于本发明目的的植物包括含有足够水平的类黄酮苷和/或其复合物的任意植物，不过，特别优选的植物是豆科植物，诸如大豆(例如大豆属)，不包括未发芽的大豆种子；羽扇豆(例如羽扇豆属，诸如白羽扇豆(L.albus)，L.angutifolius L luteus和L mutabilis)；鹰嘴豆(例如鹰嘴豆属，诸如鹰嘴豆)；木豆(木豆属)；白草香木犀(例如白草香木樨)；紫花苜蓿或苜蓿(例如紫苜蓿)；车轴草属的种类。烹饪用云扁豆(菜豆属和Lunatus)或烹调用豌豆(豌豆属)也用作本发明的植物物质。本领域技术人员不用过度的试验和实验将能够识别和获得用于本发明的其他天然植物物质。可以理解的是来自不同植物的物质的组合可以构成用于本发明的植物物质。
优选地，用作本发明的植物物质源的植物产生低水平的，甚至更优选地非常低或不含，能破坏糖苷酶或苷元的内生酶类。在这方面，很多植物产生能够戏剧性地降低产率的多酚氧化酶或酪氨酸酶。可采用其他手段包括物理方法诸如加热或化学药品(例如焦亚硫酸钠)以减少植物物质中不必要的酶的效应，不过，这些处理的时间选择必须是使糖苷酶转化成苷元的酶在转化足够的糖苷酶之前不是未活化的。
含在植物物质中的类黄酮通常是以水溶性糖连接的苷的形式，并因此在常规产生提取物诸如蛋白质浓缩物情况下抵抗浓缩。然而，使用在细胞内，但固定在独立的细胞腔隙的内生酶可以使所述类黄酮苷转化成苷元。
因而，优选使用含在植物物质中的内生酶实现酶转化。当使用内生酶时，通过任何使细胞结构破坏以允许该内生酶来与苷底物接触的方法，可使它们与苷开始接触。
因而，本发明还提供了一种从含有合适的类黄酮苷和/或其复合物的植物物质生产富集类黄酮浓缩物的方法，该方法包括下列步骤(i)使所述植物物质的细胞结构破坏以实现将类黄酮苷或其复合物酶转化成类黄酮苷元；(ii)调节pH以使类黄酮苷元变得相对不溶并形成含有它们的浓缩物。
破坏细胞结构的处理方法包括使细胞破碎的处理方法且是可变和对本领域技术人员而言是显而易见的。它们包括诸如研磨、压碎、捣击或滚压、冷冻和融化这样的处理方法；诸如半纤维素酶或纤维素酶这样的酶处理方法；超声处理方法；干燥法；接触紫外线；使用包括挤压和密封分批施压在内的减压或升压的处理方法；微生物消化或青贮；接触氧化性和其它化学药品；洗涤剂处理或上述方法的任意组合。
可以理解的是天然原料本身的结构能限制细胞破坏的程度，从而当待处理的原料有较高的纤维内容物或较厚的细胞壁，或较小的细胞尺寸等的时候，需要更强有利的方法。
另外可以理解的是在进一步加工前应将破坏方法中使用的防碍其它处理步骤的任何成分从反应混合物中除去。
还发现，当使用相同的破坏细胞的方法时，一段冷藏时期(约5℃)后的苗芽使保留在所生产的浓缩物中的异黄酮水平降低，这可能是由于寒冷导致的细胞膜变化，此变化使它们对破坏更加抵抗并因此限制酶与在所述植物细胞中保持在不同部分或膜约束细胞器中的类黄酮苷的混合。
当内生酶没有履行适当的苷向苷元的转化时，可能必需加入酶以促进转化。
因而，本发明还提供了一种从含有合适的类黄酮苷和/或其复合物的植物物质生产富集的类黄酮浓缩物的方法，该方法包括下列步骤(i)使所述植物物质的细胞结构破坏并加入另外的外生酶以实现将类黄酮苷或其复合物酶转化成类黄酮苷元；(ii)调节pH以使类黄酮苷元变得相对不溶并形成含有它们的浓缩物。
以不同的酶可实现酶转化，所述酶包括具有水解苷键能力的酶，诸如一种或多种来自糖苷酶、β-糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酸酶、果胶酶、橙皮苷酶、花色素酶、鼠李淀粉酶(rhamnodiastase)、柚(皮)苷酶或高淀粉酶组成的组。
其他的酶包括适合于水解在类黄酮苷复合物中在葡萄糖(糖)部分和接合部分(例如酰基)之间的键的那些酶，诸如异黄酮7-O-苷-6”丙二酸盐丙二酰酯酶(malonylesterase)或可在合适的植物中发现等同的酶。
当必需时，外生酶可市售获得或从本领域技术人员显而易见的来源获得，所述来源包括动物，诸如来自猪的肝脏；植物诸如三叶草属的种类(trifolium spp)、鹰嘴豆属的种类(Cicer spp)、向日葵属的种类(Helianthus spp)、草木犀属的种类、苜蓿属的种类、茶的种类、李属的种类(Prunus spp)(例如扁桃、洋李、甜樱桃、杏)、药炭鼠李和冻绿(Rhamnus utilis)；霉菌诸如曲霉属的种类，包括黑色曲霉或米曲酶、红色糖多孢菌、刺槐和根瘤菌属的种类；诸如酒明串珠菌、啤酒片球菌和植物乳芽孢杆菌这样的细菌或诸如类细菌种类这样的肠内细菌；以及酵母，诸如啤酒糖酵母、异常汉逊氏酵母、细尖克勒克氏酵母和铁红假丝酵母(Candida pulcherimma)。
其他的酶包括遗传工程酶诸如获自遗传修饰(遗传工程)生物体的那些酶。当使用工程酶时，它们是外生的酶从而方便加入到反应混合物中。另外，应用遗传操作，可以使用否则产生不足量的酶或具有不充分活性的酶的植物物质。例如，可将编码适合的酶的基因插入到植物的基因组，否则该植物将不产生足够的用于转化的内生酶，从而使其适合于用在本发明中。此外，还可以将遗传工程用于改进酶的特性，诸如其活性。所有这类遗传工程产物能够用于本发明的方法。
可以理解的是多种酶，或同时或顺序地，可用于影响转化。当所述苷在转化为苷元之前需要转化成中间体时，多种酶可以是特别必需的。不过，当不需要用于转化为中间体的时候，也可以使用多种酶。在这方面，取决于所述原料，多种不同的酶比一种酶可实现更好的转化。
本领域技术人员至少基于对方法和原料的要求能够确定转化反应所需(内生或外生的)的酶的性质。具体地说，转化成中间体和使用的特定的酶的要求对本领域技术人员来说是显而易见的。例如，必须首先用α-鼠李糖苷酶(rhamnosidase)将narangin(一种苷)转化为江户樱花苷(中间体苷)，然后通过用β葡糖苷酶水解葡萄糖部分将其转化为其类黄酮苷元形式的naringinin。
充分转化为苷元所需时间的量根据植物物质、所使用的酶、温度和全部方法要求必备的条件(即，在所述浓缩物中所需类黄酮的最终水平)而改变。例如，在压碎的白羽扇豆苗芽中发现在室温下转化花费的时间少于16分钟。优选地，类黄酮苷和/或其复合物的转化是完全的。然而，更可靠和更实际的是一部分所述原料中的类黄酮苷和/或其复合物没有转化成为类黄酮苷元。明显地，转化程度越高，从提取方法中回收的类黄酮苷元将会越多。在任何情况下在本发明的方法中实现的转化水平将通过操作参数，包括该方法所需要的输出量来确定。
当植物物质是发芽的苗芽时，在发芽的苗芽中的类黄酮水平受到种子的种类和质量、出芽温度和时间，以及光的存在和浸泡用水pH的影响。在进行本发明的方法之前，也可将植物物质进行特殊预处理以提高苷的水平。例如，可以用铜溶液、茉莉酮类化合物、真菌提取物或糖溶液处理植物物质以提高在该原料中的内生异黄酮水平。另外，对子叶应用物理应力诸如切割，也能使植物物质诸如种子增加产生异黄酮。
因而，先于产生本方面浓缩物，在进一步增加内生异黄酮水平之前，优选将植物物质接触光诸如日光。
在酶转化成类黄酮苷元前，还可以预处理植物物质以便除去一种或多种糖残基或其部分。在这方面，可以处理类黄酮苷以便水解某些糖残基或其部分诸如糖单位，从而产生部分转化的类黄酮苷。在这种选择中，可以通过使用在类黄酮苷上至少保留一种糖残基的强酸水解从类黄酮苷上除去一个或多个糖残基。
可能需要调节其它变化因素以便从给出的提取方法且更具体地说是酶转化法中获得最佳性能。控制这些变化因素和产生最佳转化的特定组合条件对本领域技术人员来说是显而易见的。这类变化因素包括温度、含湿量和添加其它溶质或酶稳定剂。
另外可以理解的是可以将按照本发明方法生产的提取物进行进一步处理以便进一步提高所关注的类黄酮的浓度水平。在这方面，可以实施诸如醇浸提这样的其它纯化方案。
一旦产生了类黄酮苷元，就必须防止它发生聚合或其它不需要的修饰。例如可能需要限制或除去多酚氧化酶的活性以便防止类黄酮苷元的聚合。这一结果可以通过例如加热这样的物理方式或例如二氧化硫、焦亚硫酸钠、氢氰酸、一氧化碳、蛋白质消化酶或酶类这样的化学方式和/或通过使用例如通过提供二氧化碳气体或氮气气氛除氧方法或通过真空抽吸而实现。在后一种手段中，将缺氧维持至通常可以将多酚氧化酶活性持久消除或另一方面直到从含有多酚氧化酶的液体或固体中分离出类黄酮苷元为止。
调节pH以使类黄酮苷元不可溶。优选地，将pH调节到至少少于将要提取的类黄酮的最低pKa值约2个pH单位。例如，对genestein和鹰嘴豆素A(biochanin A)来说pH5.2或更低。更优选地，将所述pH调节到约4-4.5诸如4.1或4.2。
可以使用本领域技术人员显而易见的许多方式中的任意一种来调节pH以使类黄酮苷元不溶，包括添加诸如可以是液体、固体或气体形式的盐酸、硫酸、磷酸、硝酸、乳酸、酒石酸、柠檬酸、乙酸或丙酸这样的酸。改变pH以确保足够比例的类黄酮苷元不溶。如果需要，可以通过搅拌来进行pH调节以便确保反应物充分混合且绝大部分类黄酮苷元类实际上能够完全酸化。可以处理可溶性部分以便进一步使类黄酮苷元更完全地保留在不溶性相中。
在类黄酮苷元充分出现在悬浮液或沉淀中之后，可以除去所述酸性水溶成分，并将废料干燥以获得类黄酮富集的浓缩物。通过除去存在的酸性水溶成分诸如糖类、矿物质、皂草苷类、氨基酸和肽类实现浓缩。
通过植物物质的物理参数将酸性水溶成分的提取等级控制，并能以很多不同的方法从简单的浸泡和过滤、利用重力或更有力的提取方法诸如逆流提取使酸性水溶液向下通过保留在筛网上的原料进行酸性水溶性成分的提取。其他提取水溶成分的方式和方法对本领域技术人员是显而易见的。
干燥沥滤了的物质形成最终的浓缩物可通过很多方法之任何一种来实施，假如它足够快而能防止微生物性腐败，且温度未超出这样的程度引起不合需要的味道或过分地减少食物的价值和消化性诸如通过加热损坏了蛋白成分。喷雾干燥是一种可能，不过，其他方法对本领域技术人员是显而易见的。
任选地，在转化苷成为苷元后，可将反应混合物干燥或不干燥储藏到方便进一步处理时为止。如果发生所述物质含相当程度的异黄酮破坏酶诸如多酚氧化酶的情况，首先应将这些酶灭活。
将植物物质用作原料的一种可能出现的复杂情况是在浓缩过程中不需要的植物蛋白共沉淀。在这方面，在该方法中为分离类黄酮苷元而控制的各种条件可能不足以使类黄酮苷元与其它植物蛋白分离。这一问题可以通过用于原料或工艺过程中的其它处理步骤来解决以便至少减少与共沉淀相关的问题。
因此，本发明可以进一步包括一种处理方法，其中对不需要的蛋白质进行修饰以便它们对本发明方法中类黄酮苷元的浓度不会过度稀释。这类处理方法包括那些在酸化步骤后实现可溶性相中不需要蛋白质或蛋白质物质的浓度增加的方法。
所述的处理方法可以改变且包括那些对本领域技术人员而言属于显而易见的方法。本发明包括的处理方法包括化学处理例如水解、在酸性pH调节前酶处理植物物质。另外，将酶转化后的反应混合物通过装填了吸附蛋白质但不吸附类黄酮苷的物质的柱。
优选地，通过使类黄酮苷元在对苷元特别特异的pH不溶，降低最终浓缩物中的非类黄酮蛋白质的水平。为此目的，优选的pHs是在约1-3之间，甚至更优选在约1.5-2.5之间。还发现使用盐酸或磷酸来调节pH比使用硫酸更优选，因为已经发现这些酸增解蛋白质更有效。
在使苷元不溶之前，作为替代或附加使用特异性pHs的本发明的方法还可包括使用水解酶以选择性地或优先地分解杂质蛋白质的步骤。这一步骤也改善最终浓缩物中的类黄酮水平。
因而，可以用诸如可使不需要的蛋白质在酸性介质中转化成可溶形式的胃蛋白酶或木瓜蛋白酶这样的蛋白酶处理由细胞破裂步骤产生的反应混合物。还可以使用大小排阻色谱，包括可以使用凝胶过滤或大小排阻滤膜，这种滤膜带有足够小以使类黄酮分子通过而不允许较大的蛋白质分子通过的孔。还可以使用其它生物方式，包括用消化或吸附微生物的蛋白质发酵。青贮粉碎的原料也可能有助于该提取方案。
专利申请人还确定可以采用多种方法操控该反应混合物中其他成分的水平以便使最终浓缩物中的类黄酮浓度最大化。
浓缩物中的脂质水平能够通过从该反应混合物物理分离或通过有机溶剂提取来降低。优选地，所使用的溶剂或溶剂混合物应该选择为使兴趣类黄酮的共提取作用最小化的溶剂。
优选地，脂质水平通过利用植物生化行为而降低。在这方面，已经发现在萌芽和发芽后采用冷却的步骤降低保留在浓缩物中的脂质水平。因而，本发明还提供一种从含有合适类黄酮苷和/或其复合物的萌发的苗芽形式的植物物质生产类黄酮苷元浓缩物的方法，包括以下步骤(i)在预定温度将萌发的苗芽冷却预定的时间；(ii)将类黄酮苷或其复合物酶促转化成类黄酮苷元；和(iii)调节pH以使可溶性类黄酮苷元变得相对不溶并形成含有它们的浓缩物。
预定的时间和温度可根据植物物质的类型、最终浓缩物中所需的浓度而改变。优选地，该温度至少象10℃一样低，并且更优选地至少象6℃一样低。优选地，预定的时间至少是1-6周。然而，可以理解的是用于特定提取的时间和温度可通过本领域技术人员使用常规的试验和实验来确定。
关于包括饮食纤维的碳水化合物，在某些情况中由于察觉到它们有益于健康可将饮食化合物评价为食物添加成分，在另一些情况中由于生物利用度的原因可以期望它减少，也可以期望它升高类黄酮和可能的蛋白质的相对水平，或期望它能更有效除去水溶性成分。通过使用能够分解碳水化合物的酶制剂可将所述碳水化合物的水平降低。这些酶制剂包括那些含半纤维素酶和纤维素酶的制剂。
优选在将苷转化为苷元之后或期间且在调节pH步骤之前，将碳水化合物水平进行处理。
作为对通过降低浓缩物中不需要蛋白质的水平以改善类黄酮水平的一种替代，通过增加浓缩物中的总蛋白质含量可增加营养需求。在这方面，根据所需要的蛋白质浓缩物最终用途，可能高总蛋白质水平以及高类黄酮水平是可取的。为了使蛋白质含量最大化，必须对反应混合物中的蛋白酶给予考虑，该蛋白酶可分解代谢蛋白质因而减少蛋白质的产出率。例如，在白羽扇豆苗芽中存在一种蛋白酶，其pH最大值pH 4.0近似于蛋白质不溶性的可能的pH最大值pH 4.0-4.5。
因而，本发明还可包括使在反应混合物中蛋白酶失活的步骤。通过加热反应混合物可使蛋白酶失活，其具有另外的优点增加蛋白质沉淀并使它们从可溶部分中易于分离。温度可以改变，优选为至少45℃。另外，假如在苷充分转化为苷元之后加入化学药品，蛋白酶可通过化学方法失活。
另外，可通过使用来自具有低内生蛋白酶水平栽培品种(cultivars)的植物物质，或通过操控生长时间和/或萌发和出芽实施的温度限制内生蛋白酶的作用。
本发明还提供凝固剂或其他化合物的用途，它们使蛋白质不溶最大化，诸如加入的树胶和聚合型阴离子例如阿拉伯胶、羧甲基纤维素、聚半乳糖醛酸、藻酸盐、角叉菜聚糖和六甲基磷酸盐(hexametaphosphate)；二价阳离子诸如钙、镁和锌。可将这些成分加入以改善从反应混合物保留蛋白质，并且这能增加作为结果的浓缩物中蛋白质的量。
在本说明书的上下文中，除非另有说明，将术语“包括”或其变化形式理解为包含所述的整数或整数组，但不排除任何其它的整数或整数组。
现在将描述本发明，关于下列实施例对前述段落无任何限制。
实施例实施例1从发芽的白羽扇豆生产异黄酮富集的浓缩物将苦白意大利羽扇豆(Lupinus albus)，暂时确定为塔斯马尼亚生长的Superlupe栽培品种，平均种子重量0.7g，浸泡24小时伴2次1小时的空气中断，然后在其后每12小时浸泡约1小时。
将羽扇豆暴露于低强度间接的太阳光下并在约20-25℃室温进行发芽，小心分离腐烂无法生存的种子并保持低的堆高。在第十二天，当伴随部分子叶几乎全部张开和首批叶发生情况下根发育良好的时候，将苗芽在掺和机中处理。将重191克的56个脱离外壳的苗芽分成2组并且以相同重量的水掺和3分钟。
从第二次掺和结束预留30分钟后，为酶水解异黄酮苷，将所获得的泥浆用另外400毫升水进一步稀释，并将其pH调节为pH4.2。将如此产生的悬浮液在之后的22分钟期间时常搅拌。过夜后，将该悬浮液在1号Whitman滤纸上过滤。过滤完成后，将保留的物质用新鲜的pH4.2的溶液冲洗数次(所使用的体积约390毫升)，一个周期超过数小时。
一天后，将所过滤的物质在68℃鼓风干燥，获得伴有3.2g/100g湿度的10.11g物质。让其达到10％湿度水平获得10.9g异黄酮富集的具有下列特征的羽扇豆浓缩物。
表1A

用轻的石油溶剂油(light petroleum spirits)(约750毫升，加热至大约45-50℃)浸泡此浓缩物7小时，滤出0.98g脂质和约125mg异黄酮。
在68℃鼓风干燥，获得9.01g物质。让所干燥的物质达到与室内湿度均衡使其重量增加到9.67g，每100g下列组成表1B

**41.9g/100g dwb。
每100g种子浓缩物产率-24.7g。
实施例2从发芽的白羽扇豆生产异黄酮富集的浓缩物，有加热步骤以便增加蛋白质保留。
将苦白意大利羽扇豆(Lupinus albus)，暂时确定为塔斯马尼亚生长的Superlupe栽培品种，浸泡24小时伴2次1小时的空气中断，然后在其后每12小时浸泡约1小时。从无法生存的种子小心分离萌芽种子并确保种子个体有足够的萌发空间。
将羽扇豆暴露于低强度间接的太阳光下并在约20-25℃室温进行发芽，并在第十二天，当伴随部分子叶几乎全部张开和首批叶发生情况下根发育良好的时候，将苗芽在厨房掺和机中处理。将重182克的56个脱离外壳的苗芽分成2组并且以相同重量的水掺和4分钟。
从第二次掺和结束预留30分钟后，为酶水解异黄酮苷，将所获得的泥浆用另外400毫升水进一步稀释，并将其pH调节为pH4.2。将如此产生的悬浮液在之后的25分钟期间时常搅拌。然后，将该悬浮液加热到约62.5℃40分钟，以便至少部分地凝固蛋白质。过夜后，将该悬浮液在1号Whitman滤纸上过滤。过滤完成后，经过数小时，将保留的物质用新鲜的pH4.2的溶液冲洗数次(所使用的体积约640毫升)，一个周期超过数小时。
一天后，将所过滤的物质在68℃鼓风干燥，获得伴有3.1g/100g湿度的14.4g物质。让其达到10％湿度水平获得15.5g异黄酮富集的具有下列特征的羽扇豆浓缩物。
表2A

*蛋白质干燥重量基数32.9g/100g用石油溶剂油(petroleum spirits)(约750毫升，加热至大约45-50℃)浸泡此浓缩物7小时，滤出2.58g脂质和约127mg异黄酮。
在68℃鼓风干燥，获得11.69g物质。让所干燥的物质达到与室内湿度均衡使其重量增加到12.69g，每100g下列组成表2B


**40.4g/100g dwb。
每100g种子浓缩物产率-32.4g。
假设白羽扇豆具有澳大利亚平均蛋白质含量39.5g/100g种子dwb，虽然其水平可低如31.8g/100g dwb，那么加热(使酸性pH蛋白酶失活？)使每100g干燥种子蛋白质保留率从9.3g升高到13.1g或使所期望的原始的羽扇豆种子蛋白质提高三分之一或更高。为通过减少酶失活前时间增加蛋白质保留蛋白质效率，可期望使用络合阳离子提高到市售豆类蛋白质浓缩物生产所见的效率，保留约二分之一原始蛋白质。
实施例3从低温储存后的发芽的白羽扇豆生产异黄酮富集的浓缩物，有加热步骤以便增加蛋白质保留。
将苦白意大利羽扇豆(Lupinus albus)，暂时确定为塔斯马尼亚生长的Superlupe栽培品种，浸泡24小时伴2次1小时的空气中断，然后在其后每12小时浸泡约1小时。从无法生存的种子小心分离萌芽种子并确保种子个体有足够的萌发空间。
将羽扇豆暴露于低强度间接的太阳光下并在约20-25℃室温进行发芽，并在第十二天，当伴随部分子叶几乎全部张开和首批叶发生情况下根发育良好的时候，将苗芽放在浸湿的纸围成的容器中并在6℃储存8天。
在温度允许调节到室温(25.0℃)后，将苗芽在厨房掺和机(Panasonic model Super Blender)中处理。将63个脱离外壳的且每个苗芽平均重3.41g的苗芽分成2组并且在液化选项基础上以相同重量的水掺和3分钟。
从第二次掺和结束预留33分钟后，为酶水解异黄酮苷，将所获得的泥浆用另外400毫升水进一步稀释，并将其pH调节为pH4.1。将如此产生的悬浮液在之后的20分钟期间时常搅拌。然后，将该悬浮液加热到约62.5℃45分钟，以便至少部分地凝固蛋白质。过夜后，将该悬浮液在Whitman 1号滤纸上过滤。过滤完成后，将保留的物质用新鲜的pH4.2的溶液冲洗数次(所使用的体积约680毫升)，一个周期超过数小时。
一天后，将所过滤的物质在68℃鼓风干燥，获得伴有2.5g/100g湿度的9.86g物质。让其达到10％湿度水平获得10.67g异黄酮富集的下列羽扇豆浓缩物表3A

*蛋白质干燥重量基数29.1g/100g用石油溶剂油(约750毫升，加热至大约45-50℃)浸泡此浓缩物7小时，滤出0.46g脂质和约98mg异黄酮。
在68℃鼓风干燥，获得9.30g物质。让所干燥的物质达到与室内湿度均衡使其重量增加到10.00g，每100g下列组成作为允许达到与室内湿度均衡的产物，每100g表3B

**30.8g/100g dwb。
每100g种子浓缩物产率-22.7g。
从粉碎发芽白羽扇豆提取，干燥并用甲醇提取，通过质子核磁共振和与紫外线光谱法结合的高压液相色谱分析过的酸不溶的异黄酮苷元的分析表明多数是伴有较少量2’-羟基染料木黄酮的染料木黄酮，和少量的其他异黄酮类。
本发明的方法考虑到使用相对简单的方法生产相当大量特异性异黄酮苷元，其可按比例放大用作饲料或饮食添加剂的类黄酮浓缩物的大规模生产。从脱脂大豆原料常规生产含异黄酮的浓缩物，发现含三种异黄酮，顺序为染料木黄酮＞黄豆苷原＞glycitrins。当一定范围的发芽的豆类细胞损坏时，发现它们不仅产出每原始种子量相当高水平的酸溶液不溶的异黄酮苷元，直至大于大豆种子总异黄酮含量6倍，而且异黄酮的种类组成也可彻底不同。
因而，本发明提供这种可能浓缩物有较高异黄酮含量但组分不同，诸如伴有比染料木黄酮更大量的黄豆苷原(发芽的大豆)，或伴有染料木黄酮苷元比例非常高(白羽扇豆和狭叶羽扇豆两者的栽培品种的苗芽)，经修饰的染料木黄酮(白羽扇豆和狭叶羽扇豆两者的栽培品种的苗芽)和其中异黄酮基本上是formonentin比鹰嘴豆素A(biochanin A)为1比1或2比1的浓缩物(相应为desi和Kabuli鹰嘴豆苗芽)。
这些异黄酮生化性质上不同，从而在它们的作用和对健康的好处方面不同，并因此不需要限制为单一的异黄酮合并成分。利用萌发的豆类苗芽的方法使更加市场区分的特制产品能够生产。
实施例4从发芽的狭叶羽扇豆生产异黄酮富集的浓缩物将从市场谷物出口商得到的收获约6个月的gungurru栽培品种的狭叶(狭叶)羽扇豆(Lupinus angustifolius)(平均种子重量0.15g)浸泡24小时，伴2次1小时的空气中断，然后在其后每12小时浸泡约1小时。
在约25℃的室温让羽扇豆发芽并暴露于低强度间接的太阳光下。8天后，当从为萌发的种子中分离所有的苗芽，并将苗芽放在浸湿的纸围成的容器中在6℃储存5天半。
在约25℃的室温让羽扇豆发芽。在这阶段，羽扇豆的二等分的子叶张开并分隔很远，且部分首批叶已经发育到要分离小叶但未到小叶变平的时刻。茎约6-7cm长，从变色的顶部算起的根长度达8.8cm。
在温度允许调节到室温(25℃)后，将苗芽移出并在厨房掺和机(Panasonic model Super Blender)中处理。将468个脱离外壳的且平均重1.14g(每个苗芽)的苗芽分成4组并且在液化选项基础上以相同重量的水掺和3分钟。将第1组与第2组及第3组与第4组的掺合产物合并成每组约534g的两个组。在这个时刻，悬浮液的温度相应为32℃和33℃。
从掺和结束预留90分钟后，为酶水解异黄酮苷，将所获得的两个悬浮液终产物(泥浆)在另外水中进一步稀释成最终重量800g并将其pH调节为pH4.5。将如此产生的悬浮液在之后的60分钟期间时常搅拌，然后将该悬浮液在粗纸上过滤。过滤完成后，将保留的物质用新鲜的pH4.5的溶液冲洗数次(所使用的体积约500毫升)，共用2.5小时。
一天后，将所过滤的物质在68℃鼓风干燥，然后，让其达到与空气湿度均衡，获得24.57g和22.62g相应物质，等于每100g原始种子70g和64.4g。浓缩物的己烷可提取脂质含量测定为约5.3g/100g。
空气干燥物质中的异黄酮水平分别为268mg/100g，和305mg/100g，或相等于每100g原始种子188mg和196mg。
从粉碎发芽gungurru狭叶羽扇豆，干燥并用甲醇提取，通过质子核磁共振和与紫外线光谱法结合的高压液相色谱分析过的所提取的酸不溶的异黄酮苷元的分析表明多数(约三分之二)是伴有较少量2’-羟基染料木黄酮的染料木黄酮，和少量的7-羟基-4’-甲氧异黄酮，及单独地和双重地异戊(间)二烯酯化的(prenylated)异黄酮。
实施例5A从新鲜的(非冷藏的)发芽大豆生产异黄酮富集浓缩物从大型食物成分商店购买未知栽培品种的大豆(Glycine max)，将未区分大小的种子(平均种子重量0.175g)浸泡24小时，伴2次1小时的空气中断，然后在其后每12小时浸泡约1小时。
在约25℃的室温让大豆发芽并暴露于低强度间接的太阳光下。6天半后，大部分苗芽从它们的种壳中长出，子叶为绿色并在垂直的茎上向水平弯曲，部分子叶张开但没有出现首批叶。根达6cm长，茎达8cm长。
将苗芽在厨房掺和机(Panasonic model Super Blender)中处理。将重189.5g的269个脱离外壳的苗芽以相同重量的水掺和超过3分钟。在掺和结束的时候，其温度为35.4℃。
从掺和结束预留1小时后，为酶水解异黄酮苷，将所获得的泥浆在另外400ml水中进一步稀释并将其pH调节为pH4.5。在5℃过夜后，将该悬浮液在粗纸上过滤。过滤完成后，将保留的物质用新鲜的pH4.5的溶液冲洗3次(所使用的体积约400毫升)，共用2小时。
一天后，将所过滤的物质在68℃鼓风干燥，然后，让其达到与空气湿度均衡，获得等于每100g原始种子54.7g的24.57g物质。浓缩物的己烷可提取脂质含量测定为约21.6g/100g。
在空气干燥物质中的异黄酮水平为680mg/100g，或相等于每100g原始种子370mg。
实施例5B从冷藏的发芽大豆生产异黄酮富集浓缩物与在实施例5A中相同的植物物质，即从大型食物成分商店购买的未知栽培品种的大豆(Glycine max)，将未区分大小的种子，平均种子重量0.175g，浸泡24小时，伴2次1小时的空气中断，然后在其后每12小时浸泡约1小时。
在约25℃的室温让大豆发芽并暴露于低强度间接的太阳光下。6天半后，将苗芽从没有萌发的种子中分离并放置在浸湿的纸围成的容器中在6℃储存6天半。
在温度允许调节到室温(25℃)后，将苗芽从容器中移出，并在厨房掺和机(Panasonic model Super Blender)中处理。在这一阶段，大部分子叶刚刚开始分离但在外末端保持压合在一起，一小部分有首批叶从两片子夜之间长出。茎长达到11cm，根长达到8cm。
将重253.7g的298个脱离外壳的苗芽以相同重量的水掺和超过3分钟。在掺和结束的时候，其温度为35℃。
从第二次掺和结束预留1小时零1刻钟后，为酶水解异黄酮苷，将所获得的泥浆在另外400ml水中进一步稀释并将其pH调节为pH4.5。在放置1小时后，将该悬浮液在粗纸上过滤。过滤完成后，将保留的物质用新鲜的pH4.5的溶液冲洗一次(所使用的体积约200毫升)，共用2小时。
一天后，将所过滤的物质在68℃鼓风干燥，然后，让其达到与空气湿度均衡，获得等于每100g原始种子47.3g的24.64g物质。浓缩物的己烷可提取脂质含量测定为约13.3g/100g。
在空气干燥物质中的异黄酮水平为450mg/100g，或相等于每100g原始种子236mg。
从粉碎发芽的大豆，干燥并用甲醇提取，通过质子核磁共振和与紫外线光谱法结合的高压液相色谱分析过的所提取的酸不溶的异黄酮苷元的分析表明异黄酮为少数的染料木黄酮(28％)和剩余，约72％，伴7-羟基-4’-甲氧异黄酮的黄豆苷原。
实施例6从发芽的Kabuli鹰嘴豆生产异黄酮富集浓缩物将从地中海食物成分商店购买的未知栽培品种(平均重量0.51g)的Kabuli或gabanzo纲鹰嘴豆(Cicer arietinum)浸泡24小时，伴2次1小时的空气中断，然后在其后每12小时浸泡约1小时。
在约25℃的室温让鹰嘴豆发芽并暴露于低强度间接的太阳光下。10天半后，苗芽处于在茎上有3到4个嫩叶之间的阶段。子叶没有全部张开，种壳是过度限制性的。新芽达到4.5cm长，根达到8cm长，伴良好发育的侧根达到1.7cm长。
将苗芽在厨房掺和机(Panasonic model Super Blender)中处理。将重130g的99个脱壳的苗芽以相同重量的水掺和3分钟。
从掺和结束预留1小时后，为酶水解异黄酮苷，将所获得的泥浆在另外260ml水中进一步稀释并将其pH调节为pH4.5。将所得泥浆在室温放置约2小时，然后于粗纸上过滤前在0℃另外储存1个半小时，在过滤后，将保留的固体用大量的pH4.5的水溶液冲洗，总的体积约500毫升。
一天后，将所过滤的物质在65℃鼓风干燥，然后，让其达到与空气湿度均衡，获得等于每100g原始种子72g的36.81g物质。浓缩物的己烷可提取脂质含量测定为约9.9％。
在空气干燥物质中的异黄酮水平为915mg/100g，或相等于每100g原始种子660mg。
从粉碎发芽的Kabuli鹰嘴豆，干燥并用甲醇提取，通过质子核磁共振和与紫外线光谱法结合的高压液相色谱分析过的所提取的酸不溶的异黄酮苷元的分析表明异黄酮基本上是在约65∶35比率的7-羟基-4’-甲氧异黄酮和鹰嘴豆素A，伴微量pratensein和染料木黄酮。
实施例7从发芽的Desi鹰嘴豆生产异黄酮富集浓缩物将从地中海食物成分商店购买的未知栽培品种的Desi纲鹰嘴豆(Cicer arietinum)，未区分大小等级但伴随平均重量0.121g，浸泡24小时，伴2次1小时的空气中断，然后在其后每12小时浸泡约1小时。
在约25℃的室温让鹰嘴豆发芽并暴露于低强度间接的太阳光下。7天半后，苗芽处于在茎顶部有第3个叶插入(bracket)的阶段，根和苗具有改变的长度，但根最高达7.2cm长且茎达到4.1cm长。
将苗芽在厨房掺和机(Panasonic model Super Blender)中处理。将重183g的410个脱壳的苗芽以相同重量的水掺和3分钟。
从掺和结束预留1小时后，为酶水解异黄酮苷，将所获得的泥浆以另外376ml水进一步稀释并将其pH调节为pH4.5。经过另外2.25小时后，将所得泥浆于粗纸上过滤，其后，将保留的固体用大量的pH4.5的水溶液冲洗，总的冲洗的体积约350毫升。
一天后，将所过滤的物质在68℃鼓风干燥，然后，让其达到与空气湿度均衡，获得33.67g物质，等于每100g原始种子68g。浓缩物的己烷可提取脂质含量测定为约6.4g/100g。
在空气干燥物质中的异黄酮水平为428mg/100g，或相等于每100g原始种子290mg。
从粉碎发芽的Desi鹰嘴豆，干燥并用甲醇提取，通过质子核磁共振和与紫外线光谱法结合的高压液相色谱分析过的所提取的酸不溶的异黄酮苷元的分析表明异黄酮基本上是在约55∶45比率的7-羟基-4’-甲氧异黄酮和鹰嘴豆素A，伴微量7-羟基-4’-甲氧异黄酮。
其他对本领域技术人员显而易见的修改或改编包括在本发明的范围内。
在本说明书的上下文中，除非另有说明，将术语“包括”或其变化形式理解为包含所述的整体或整体组，但不排除任何其它的整体或整体组。


从含有合适的类黄酮苷和/或其复合物的植物物质生产类黄酮苷元的浓缩物的方法，该方法包括下列步骤(i)以酶促方式将类黄酮苷或其复合物转化成类黄酮苷元；和(ii)调节pH以使类黄酮苷元变得相对不溶并形成含有它们的浓缩物。