专利名称：禽传染性法氏囊病与巴氏杆菌病二价基因工程疫苗的制作方法 传染性法氏囊病病毒(IBDV)，属双链RNA病毒科，能引起鸡和火鸡发生传染性法氏囊病或Gumboro病。它通过破坏鸡法氏囊的B淋巴细胞引起3～12周龄雏鸡的免疫抑制。IBDV的基因组由2段双链RNA组成。较小的那段(A)编码VP1，是双链RNA依赖的RNA聚合酶。较大的那段(B)含有2个开放性阅读框。框1为VP5蛋白编码。框2为一个多聚蛋白质编码，此多聚蛋白可被蛋白水解酶自动加工成3个病毒蛋白，即VP2，VP4，VP3。其中VP2和VP3是该病毒的主要结构蛋白质。VP2是IBDV主要的宿主保护性抗原。它至少含有3个独立的可诱导综合性抗体的单抗原决定簇。由于本病至今仍无很好的治疗方法，而免疫接种提高鸡的特异抵抗力，一直是防治IBD的最佳方法。目前对鸡进行免疫的疫苗多为活疫苗，根据其毒力可分为弱毒型、中毒型和强毒型3种。弱毒型疫苗易被母源抗体中和，强毒型疫苗则因毒力强而很少使用。现在较为普遍使用的是中毒型疫苗。无论是弱毒型或中毒型疫苗在进行减毒过程中其免疫作用力就逐渐失去。现在经常见到的疫苗免疫失败就是由于这些减毒活疫苗的质量不稳定，变异株和超强毒株的出现等原因所造成的。另外，也有可能是减毒疫苗重新返强毒，导致强毒散播。随着对IBDV分子生物学特性研究的不断深入，对其变异机理和毒力决定因素的认识也在不断深化。许多科学家致力于使用基因工程的方法来改善和加强对IBDV的预防免疫工作。最近几年，在使用重组技术表达IBDV的结构蛋白方面已有以下几个方面的报道1)亚单位疫苗的研究报道；2)在大肠杆菌中表达的VP2蛋白；3)在酵母菌体内表达的VP2重组蛋白；4)IBDV的核酸疫苗研究；5)表达IBDV VP2蛋白的重组火鸡疱疹病毒(HVT)vHVT001，vHVT002。
我们通过基因工程的方法克隆了在湖北荆州发病的IBDV超强野毒株的VP2基因，构建了原核表达质粒pGEX-KG-VP2，并成功地在Pasteurells multocida C48-16(简称P.multocida C48-16)中实现了表达。表达产物为胞液中可溶性蛋白质，可直接用该菌诱导鸡产生针对IBDV的抗体，并对鸡提供保护作用。此基因工程疫苗具有广泛的应用前景。P.multocida C48-16是一种弱毒的禽霍乱菌株。此菌株是黑龙江兽药一厂将多杀性巴氏杆菌强毒株通过豚鼠培养190代后再通过鸡胚40代育成的弱毒菌株。它是一种非常安全有效的预防禽巴氏杆菌病的活疫苗。从1972年培养成功至今一直是我国首选的预防禽多杀性巴氏杆菌病的活菌疫苗。通过我们的研究发现它是一个比较理想的基因工程疫苗活载体菌，除可应用于传染性法氏囊病以外，还可应用于其它疾病的基因工程疫苗的研究制备。此外，我们克隆的IBDV强野毒株的VP2基因在基因数据库(GenBank)中未发现与之序列完全相同的病毒株，因此可以肯定它是一种新的变异毒株。
因此，本发明的目的是克服现有技术存在的缺点和不足，提供一种禽传染性法氏囊病和巴氏杆菌病的二价基因工程疫苗。具体地说1)提供一种可以预防禽传染性法氏囊病和巴氏杆菌病的二价基因工程疫苗；2)提供一种用P.multocida C48-16菌株制备活载体基因工程疫苗的方法；3)提供一种新的IBDV病毒株VP2基因序列。
本发明的目的是这样实现的1、IBDV VP2基因的克隆方法1)病料RNA的提取取IBD病鸡法氏囊组织病料约1克，加液氮磨碎，用sangon UNIQ-10Trizol RNA抽提试剂盒进行RNA提取。
2)RT-PCR扩增IBDV的VP2基因设计套式PCR引物，用外套引物进行反转录和第一次PCR，用第一次PCR产物稀释1000倍后用内套引物进行第二次扩增。扩增产物电泳结果见图1。
3)构建pGEX-KG-VP2质粒将扩增产物进行电泳并使用上海华舜生物工程有限公司生产的小量胶回收试剂盒进行回收。将凝胶回收产物连接到pMD18-T质粒载体上，转化大肠杆菌DH5α。
提取转化子质粒DNA。用限制性核酸内切酶Bam HI和Hind III酶切已回收的质粒DNA和pGEX-KG质粒。电泳回收VP2基因和片段化的pGEX KG质粒。将VP2基因与片段化pGEX-KG相连。完成pGEX-KG-VP2质粒的构建。用该菌转化大肠杆菌DH5α，培养大肠杆菌后提纯质粒DNA。
2、P.multocida C48-16感受态细胞的制备和转化P.multocida C48-16感受态细胞的制备1)挑取禽多杀性巴氏杆菌C48-16单菌落于LB+2％血浆的培养液中，37℃振荡培养过夜。
2)取饱和培养的P.multocida C48-16LB培养液400微升，加于40毫升LB培养液中37℃振荡培养3小时左右，至培养液出现较明显絮状物，置冰上冷却。转入50毫升离心管中，5000g×10min离心收集菌体沉淀。
3)用0.1mol/L mops漂洗一次。
4)加4毫升含50mmol/L CaCl2的0.1mol/L mops溶液重悬菌体，冰上放置20小时。
5)次日，将菌液在5000g×5min，离心。去上清，用含50mmol/L CaCl2的0.1mol/Lmops重悬菌体，此为P.multocida C48-16感受态细胞。
P.multocida C48-16菌株的转化实验1)取P.multocida C48-16感受态细胞200微升，加pGEX-KG-VP2 1微克，冰浴3小时，加入LB培养液400微升，42℃水浴2分钟，冷却后28℃振摇2小时。
2)将复苏液100微升，涂布于LB-AMP-2％血浆的平板上，37℃培养过夜。次日见有菌落生长。
用PCR鉴定含有目的基因的菌落。
该菌株命名为Pasteurella multocida C48-16/pGEX-KG-VP2。
3、传染性法氏囊病病毒新型变异株VP2测序分析结果本毒株为具有很强致病性的超强毒株，其cDNA序列和推断的氨基酸序列为atg aca aac ctg caa gat caa acc caa cag att gtt ccg ttc ata cgg48Met Thr Asn Leu Gln Asp Gln Thr Gln Gln Ile Val Pro Phe Ile Arg
1 5 10 15agc ctt ctg atg cca aca acc gga ccg gcg tcc att ccg gac gac acc 96Ser Leu Leu Met Pro Thr Thr Gly Pro Ala Ser Ile Pro Asp Asp Thr20 25 30cta gag aag cac act ctc agg tca gag acc tcg acc tac aat ttg act 144Leu Glu Lys His Thr Leu Arg Ser Glu Thr Ser Thr Tyr Asn Leu Thr35 40 45gtg ggg gac aca ggg tca ggg cta att gtc ttt ttc cct ggt ttc cct 192Val Gly Asp Thr Gly Ser Gly Leu Ile Val Phe Phe Pro Gly Phe Pro50 55 60ggc tca att gtg ggc gct cac tac aca ctg cag agc aat ggg aac tac 240Gly Ser Ile Val Gly Ala His Tyr Thr Leu Gln Ser Asn Gly Asn Tyr65 70 75 80aag ttc gat cag atg ctc ctg act gcc cag aac cta ccg gcc agc tac 288Lys Phe Asp Gln Met Leu Leu Thr Ala Gln Asn Leu Pro Ala Ser Tyr85 90 95aac tac tgc agg cta gtg agt cgg agt ctc aca gtg agg tca agc aca 336Asn Tyr Cys Arg Leu Val Ser Arg Ser Leu Thr Val Arg Ser Ser Thr100 105 110ctc cct ggt ggc gtt tat gca cta aat ggc acc ata aac gcc gtg acc 384Leu Pro Gly Gly Val Tyr Ala Leu Asn Gly Thr Ile Asn Ala Val Thr115 120 125ttc caa gga agc ctg agt gaa ctg aca gat gtt agc tac aat ggg ttg 432Phe Gln Gly Ser Leu Ser Glu Leu Thr Asp Val Ser Tyr Asn Gly Leu130 135 140atg tct gca aca gcc aac atc aac gac aaa att ggg aac gtc cta gta 480Met Ser Ala Thr Ala Asn Ile Asn Asp Lys Ile Gly Asn Val Leu Val145 150 155 160ggg gag ggg gta acc gtc ctc agc tta ccc aca tca tat gat ctt ggg 528Gly Glu Gly Val Thr Val Leu Ser Leu Pro Thr Ser Tyr Asp Leu Gly165 170 175tat gtg aga ctc ggt gac ccc att ccc gct ata ggg ctc gac cca aaa 576Tyr Val Arg Leu Gly Asp Pro Ile Pro Ala Ile Gly Leu Asp Pro Lys
180 185 190atg gta gca aca tgt gac agc agt gac agg ccc aga gtc tac act ata 624Met Val Ala Thr Cys Asp Ser Ser Asp Arg Pro Arg Val Tyr Thr Ile195 200 205act gca gcc gat gat tac caa ttc tca tca cag tac caa gca ggt ggg 672Thr Ala Ala Asp Asp Tyr Gln Phe Ser Ser Gln Tyr Gln Ala Gly Gly210 215 220gta aca atc aca ctg ttc tca gct aat atc gat gcc atc aca agc ctc 720Val Thr Ile Thr Leu Phe Ser Ala Asn Ile Asp Ala Ile Thr Ser Leu225 230 235 240agc atc ggg gga gaa ctt gtg ttt caa aca agc gtc caa ggc ctt ata 768Ser Ile Gly Gly Glu Leu Val Phe Gln Thr Ser Val Gln Gly Leu Ile245 250 255ctg ggt gct acc atc tac ctt ata ggc ttt gat ggg act gcg gta atc 816Leu Gly Ala Thr Ile Tyr Leu Ile Gly Phe Asp Gly Thr Ala Val Ile260 265 270acc aga gct gtg gcc gcg gac aat ggg cta acg gcc ggc act gac aac 864Thr Arg Ala Val Ala Ala Asp Asn Gly Leu Thr Ala Gly Thr Asp Asn275 280 285ctt atg cca ttc aat att gtg att cca acc agc gag ata acc cag cca 912Leu Met Pro Phe Asn Ile Val Ile Pro Thr Ser Glu Ile Thr Gln Pro290 295 300atc aca tcc atc aaa ctg gag ata gtg acc tcc aaa agt ggt ggt cag 960Ile Thr Ser Ile Lys Leu Glu Ile Val Thr Ser Lys Ser Gly Gly Gln305 310 315 320gcg ggg gat cag atg tca tgg tca gca agt ggg agc cta gca gtg acg 1008Ala Gly Asp Gln Met Ser Trp Ser Ala Ser Gly Ser Leu Ala Val Thr325 330 335atc cac ggt ggc aac tat cca ggg gcc ctc cgt ccc gtc aca cta gta 1056Ile His Gly Gly Asn Tyr Pro Gly Ala Leu Arg Pro Val Thr Leu Val340 345 350gcc tac gaa aga gtg gca aca ggg tct gtc gtt acg gtc gcc ggg gtg 1104Ala Tyr Glu Arg Val Ala Thr Gly Ser Val Val Thr Val Ala Gly Val
355 360 365agc aac ttc gag ctg atc cca aat cct gaa cta gca aag aac ctg gtc 1152Ser Asn Phe Glu Leu Ile Pro Asn Pro Glu Leu Ala Lys Asn Leu Val370 375 380aca gaa tac ggc cga ttt gac cca ggg gcc atg aac tac aca aaa ttg 1200Thr Glu Tyr Gly Arg Phe Asp Pro Gly Ala Met Asn Tyr Thr Lys Leu385 390 395 400ata ctg agt gag agg gac cgt ctt ggc atc aag acc gta tgg cca aca 1248Ile Leu Ser Glu Arg Asp Arg Leu Gly Ile Lys Thr Val Trp Pro Thr405 410 415agg gag tac act gac ttt cgc gag tac ttc atg gag gtg gcc gac ctc 1296Arg Glu Tyr Thr Asp Phe Arg Glu Tyr Phe Met Glu Val Ala Asp Leu420 425 430aac tct ccc ctg aag att gca gga gca ttt ggc ttc aaa gac ata atc 1344Asn Ser Pro Leu Lys Ile Ala Gly Ala Phe Gly Phe Lys Asp Ile Ile435 440 445cgg gcc ata agg 1356Arg Ala Ile Arg450在GenBank中与此序列最相近的IBDV序列有gi|6519813|dbj|AB024076.1|Identities＝1347/1356(99％)gi|9230678|gb|AF240686.1|AF240686 Identities＝1346/1356(99％)gi|1669530|dbj|D49706.1|Identities＝1345/1356(99％)gi|2262071|gb|L42284.1|IBDVKS Identities＝1344/1356(99％)gi|13957668|gb|AF262030.1|AF262030 Identities＝1340/1351(99％)gi|28629198|gb|AF533670.1|Identities＝1343/1356(99％)gi|1296812|emb|X92760.1|IBDVVP523 Identities＝1343/1356(99％)gi|20805925|gb|AF508176.1|Identities＝1342/1356(98％)4、Pasteurella multocida C48-16/pGEX-KG-VP2的诱导表达1)取Pasteurella multocida C48-16/pGEX-KG-VP2单菌落，接种于含2％鸡血清的LB-AMP培养液中。28℃培养20小时。使菌体达到饱和。
2)取1％饱和菌液转接于含2％鸡血清的10毫升LB-AMP培养液中，28℃振荡培养至出现明显混浊物，加400微升0.5mol/L乳糖28℃培养16小时。
5、诱导表达产物的抗原性检测1)将培养液转入10毫升离心管中，5000g×10分钟离心收集菌体。加1毫升TE重悬菌体。加50mg/ml溶菌酶20微升，1％Triton X-100，100微升，置37℃水浴1小时。
2)-70℃和室温冻融3次。超声波破碎10次，每次30秒。
3)4℃1000g×10分钟，取上清液进行抗原蛋白活性的检测。
a、琼脂免疫扩散法检测表达产物结果见图2。
b、ELISA检验结果使用中国农业科学院哈尔滨兽医研究所的标准IBDV阳性抗血清，对表达产物进行了间接ELISA检测，结果见下表

根据样品OD值/空白对照OD值≥2.1为阳性的判断标准，样品1在1/12800稀释倍数时为阳性(P/N＝2.50)；样品2在1/12800稀释倍数时为阳性(P/N＝2.35)；样品3在1/6400稀释倍数时为阳性(P/N＝2.87)。
6、攻毒保护实验1)材料试验鸡，1日龄本地鸡。IBDV标准强毒BC6/85株，购自中国兽药监察所。IBD活疫苗，FATRO S.P.A生产，购自荆州市兽医站。IBD琼脂扩散免疫沉淀试验(AGP)诊断抗原及阳性血清，哈尔滨兽医研究所研制。
2)方法a、试验鸡饲养至9日龄，对每只鸡采血，以AGP检测血清中IBDV抗体。试验鸡只IBD琼扩抗体应为阴性。将健康、无IBD琼扩抗体的40只鸡，随机分为4个组，每组10只。A组，口服载有IBDV VP2重组质粒的多杀性巴氏杆菌弱毒菌，2亿个/只；B组，皮下注射口服载有VP2重组质粒的多杀性巴氏杆菌弱毒菌，5千万个/只；C组，口服IBD活疫苗；D组，为空白对照组。在10日龄及20日龄各免疫两次。
b、采血，在翅膀内侧针刺放血，以0.5ml塑管收集。在以IBDV标准强毒BC6/85株攻击试验鸡之前，对每只鸡采血一次，析出血清供作AGP。
c、30日龄时，对全部试验鸡感染IBDV标准强毒BC6/85株，口服，0.1ml/只(0.1gIBDV标准强毒BC6/85株稀释为10ml)。IBDV标准强毒BC6/85株攻击后72小时，剖杀全部试验鸡，观察法氏囊的异常变化。
d、免疫保护作用大小的判定，以法氏囊的病变程度为直接相关依据，以IBDV的AGP抗体的产生为间接相关依据。法氏囊的异常变化，在色泽上，有不同程度的黄色或红色；在大小上，有不同程度的肿大，囊内皱褶边缘变圆；外表面浆膜下及囊腔内有胶冻样或干酪样渗出物，或出血性炎症。
.3)结果表I攻毒后剖检法氏囊的变化组别试验鸡明显病变轻微病变正常只只％只％只％A 101 109 90B 102 208 80C 101 102 207 70D 105 503 302 20表I中，经t检验，A组与D组，B组与D组之间差异极显著；C组与D组之间差异显著。
表II IBD琼脂扩散免疫沉淀试验检测AGP抗体的结果组别试验鸡血样阳性血样阴性血样份份％份％A 1010100 0 0B 1010100 0 0C 109 901 10D 100 0 10100表I和表II中结果表明，将载有IBDV VP2重组质粒的多杀性巴氏杆菌弱毒菌给鸡口服和皮下注射，均可产生显著的免疫保护作用，且可刺激鸡的免疫系统产生AGP抗体。
本发明具有以下优点和积极效果1、本基因工程菌可以预防鸡传染性法氏囊病和鸡巴氏杆菌病，预防免疫效果好，且安全性非常好。
2、阐明了一种新型超强毒株的抗原蛋白基因序列，该序列可进行基因工程抗原的应用开发。
3、可用本方法将Pasteurella multocida C48-16菌株开发成其它基因工程疫苗。因为该菌株在我国已经开发应用了三十多年，到目前一直被认为是非常安全低毒的活菌疫苗，作为疫苗开发生产具有生产成本低的优点。


中国典型培养物保藏中心用于专利程序的培养物保藏受理通知书(收据)分类命名Pasteurella multocida C48-16/pGEX-KG-VP2保藏日期2003年6月19日保藏单位中国武汉武汉大学邮编430072保藏编号CCTCC NOM203056图1为IBDV VP2基因扩增电泳图，其中1-扩增IBDV VP2基因电泳显色；2-200bp ladder电泳显色；图2为P.multocida C48-16/pGEX-KG表达产物琼脂免疫扩散实验图，其中3-IBDV琼扩阳性血清(哈尔滨兽医研究所)4-未稀释表达产物；5-2倍稀释表达产物；6-4倍稀释表达产物；7-8倍稀释表达产物；8-16倍稀释表达产物；9-32倍稀释表达产物。

本发明的应用有
(1)用于鸡传染性法氏囊病和鸡巴氏杆菌病的预防。用于鸡传染性法氏囊病的预防时应按前述方法用乳糖进行诱导后，收取细胞洗几次后通过饮水方式或皮下注射方式进行。饮水剂量相当于饱和诱导菌液的1/3～1/2ml。皮下注射剂量相当于饱和诱导菌液的1/10～1/20ml。
(2)用本发明的IBDV VP2基因序列进行其它基因工程疫苗和基因工程抗原研究制备。
(3)可用P.multocida C48-16菌株作为其它基因工程疫苗的活载体菌进行研究开发。


本发明公开一种禽传染性法氏囊病与巴氏杆菌病二价基因工程疫苗；涉及禽基因工程新疫苗。本新疫苗为一种加载了禽传染性法氏囊病VP2蛋白基因的多杀性巴氏杆菌弱毒株，即Pasteurella multocida C