法氏囊活性五肽bp5特异性结合肽及其应用的制作方法 【技术领域】 [0001]本发明涉及一种法氏囊活性五肽BP5特异性结合肽，以及法氏囊五肽BP5特异性结合肽的应用，属于蛋白质多肽【技术领域】。 [0002]法氏囊(bursa of Fabricus, BF)是禽类特有的中枢淋巴器官,是B细胞发育的最早发生场所，B细胞发育成熟后由此迁移到外周淋巴器官定居和繁衍，执行免疫功能。法氏囊微环境中含有多种促进B淋巴细胞发育的生物活性物质，除了囊素三肽(bursin，BS)作为法氏囊组织中第一个化学结构明确的生物活性因子之外，近年来，有多条生物活性肽从法氏囊组织中被分离鉴定。 研究发现，法氏囊活性肽大多具有免疫调节功能，有些还具有抗肿瘤潜能。 [0003]法氏囊活性五肽BP5是从法氏囊中新分离出来的一种活性五肽，其氨基酸组成为Cys-Lys-Arg-VaL-Tyr，分子量为626.27Da。学者们对BP5的生物学功能进行了一系列研究，证实BP5能够促进T淋巴细胞和B淋巴细胞增殖，增强机体体液免疫和细胞免疫反应，且在活细胞系统中具有较强的抗氧化能力，而且能够抑制杂交瘤细胞、MCF-7细胞及Hela细胞等肿瘤细胞的增殖，是一种多功能生物活性因子。 [0004]噬菌体展示技术是近年来兴起的一项研究蛋白质分子间相互作用的有效手段，具有快捷、高效、表型和基因型一致等特点，广泛应用于生物活性肽、肽类药物筛选、抗原模拟表位筛选等研究领域。有资料证实，具有生物学功能的免疫因子大多是通过与细胞膜受体相互作用或通过受体介导而发挥生物学功能，如生长因子、胸腺五肽TP5等。BP5作为一种多功能免疫因子，其发挥生物学功能的机制尚不清晰。因此利用噬菌体展示技术筛选BP5特异性结合肽，并研究BP5结合肽是否对BP5的生物学功能有所影响。对BP5抑制剂的研究开发及应用具有重要意义。


[0005]本发明的目的是提供一种法氏囊活性五肽BP5特异性结合肽。
[0006]同时，本发明还提供一种法氏囊活性五肽BP5特异性结合肽的应用。
[0007]为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是:
[0008]一种法氏囊活性五肽BP5特异性结合肽，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1、SEQ IDN0.2 或 SEQ ID N0.3 所示。
[0009]上述三条均为短肽，其中短肽1:PINMQTLNCMAA，短肽2:GCTLNPMSDLLG,短肽3:MSSTLNGMLNSL，保守序列为 TLNXM。
[0010]一种法氏囊活性五肽BP5特异性结合肽的应用，具体的，法氏囊活性五肽BP5特异性结合肽在制备抑制法氏囊活性五肽BP5抗肿瘤细胞增殖的药物方面的应用。
[0011]所述的肿瘤细胞为淋巴瘤细胞，具体为鸡DT40细胞。
[0012]本发明的有益效果:
[0013]本发明以BP5-BSA融合蛋白作为靶分子，通过噬菌体随机12肽库筛选，结合ELISA鉴定和竞争抑制试验，获得与BP5特异性结合的噬菌体，进行序列测定，人工合成BP5特异性结合肽。由此筛选得到的结合肽能与法氏囊活性五肽BP5特异性结合，且在一定浓度下抑制BP5抗鸡DT40细胞增殖活性。标准MTT法检测BP5特异性结合肽对BP5抗鸡DT40细胞增殖功能的影响，分析结果发现，短肽1、2、3本身对鸡DT40细胞的增殖均无明显影响；短肽I在0.2 μ g/mL、2 μ g/mL、20 μ g/mL浓度下能够抑制BP5抗鸡DT40细胞增殖功能，在20 μ g/mL浓度下时抑制作用最为显著(P〈0.01);短肽2在2 μ g/mL和20 μ g/mL浓度下能够显著抑制BP5抗鸡DT40细胞增殖功能(Ρ〈0.05);短肽3在0.2 μ g/mL、2 μ g/mL、20 μ g/mL浓度下能够抑制BP5抗鸡DT40细胞增殖功能(P〈0.05);表明3个BP5特异性结合肽在一定浓度下均可抑制BP5抗鸡DT40细胞增殖活性，为BP5抑制剂的研究开发及应用奠定了基础，具有良好的应用前景。




[0014]图1为本发明实施例1中ELISA检测噬菌体展示肽对靶分子的结合活性；
[0015]图2为实施例1中噬菌体阳性克隆竞争抑制试验结果；
[0016]图3为试验例中BP5对鸡DT40细胞增殖的影响；
[0017]图4为试验例中BP5特异性结合肽对鸡DT40细胞增殖的影响；
[0018]图5为试验例中BP5特异性结合肽对BP5抗鸡DT40细胞增殖功能的影响；
[0019]图6为试验例中无关G-G-G-G-S五肽对BP5抗鸡DT40细胞增殖功能的影响。


[0020]下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
[0021]实施例1
[0022]本实施例中BP5特异性结合肽的筛选，包括以下步骤:
[0023]I)噬菌体随机12肽库的亲和筛选
[0024](I)包被纯化的 BP5-BSA
[0025]将BP5-BSA (BP5-BSA融合蛋白由BP5和BSA参照常规化学方法偶联制备，由上海科肽生物有限公司合成，纯度95%以上)以TBS稀释为10(^8/!^，同倍稀释854，分别取稀释后的BP5-BSA和BSA包被酶标板，100 μ L/孔，放置湿盒中4°C过夜；次日倾弃包被液，加入含0.05% Tween20的TBST洗涤3次(每次静置3min)，扣干，然后以含5 %脱脂奶粉的TBS按100 μ L/孔加入各孔，置湿盒中37°C封闭2h ;倾弃封闭液，以含0.05% Tween20的TBST溶液洗涤3次，叩干，将包被好的酶标板封口，于4°C保存待用。
[0026](2)预筛选
[0027]以TBST稀释噬菌体随机12肽库(购于美国New England B1labs, NEB公司)至I X 10npfu/mL,取稀释后的文库液100 μ L加入到预先包被BSA的酶标板孔内，于湿盒中37°C放置2h，吸出孔内液体，并用100 μ L TBS清洗微孔一次，合并吸出的孔内液和清洗液为预筛选液。
[0028](3)亲和筛选
[0029]将100 μ L的预筛选液加入到预先包被BP5-BSA的酶标板孔内，放置湿盒中4°C过夜，弃孔内液体，并用TBST清洗10次，向微孔中加入100 μ L0.2Μ Glycine-HCl (ρΗ2.2)，于室温温和摇动lOmin，洗脱液吸入另一干净微量离心管中，加入15 μ LlM Tris-HCl (pH9.1)中和上述洗脱液。测定少量(~I μ L)洗脱物的滴度，剩余洗脱物加入到20mL ER2738培养物中(菌体应当处于对数前期)，37°C剧烈摇动培养4.5h。将培养物转入离心管中，4°C 12，OOOrpm离心10min。上清液转入另一离心管中，再离心。取80%上清转入新管中，加入1/6体积的PEG/NaCl，4°C沉淀过夜。次H，4°C 12，OOOrpm离心PEG沉淀15min。弃上清，再短暂离心，弃去残留上清。沉淀物重悬于ImL TBS中，悬液转入微量离心管中，4°C离心5min使残余细胞沉淀。上清转入另一新鲜微量离心管，用1/6体积的PEG/NaCl再沉淀。冰上孵育30min (或15_60min)。4°C离心1min,弃上清,再短暂离心,用微量移液器吸弃残余上清。沉淀物重悬于200 μ L TBS0.02% NaN3中。离心lmin，沉淀任何残余的不溶物。上清转入新的离心管中，即为第一轮扩增后的噬菌体洗脱物。根据常规M13方法用LB/IPTG/Xgal平板测定扩增后洗脱物的滴度。将第一轮扩增后的噬菌体液以TBS稀释为I X 111Pfu/mL,取100 μ L加入到预先包被BP5-BSA的酶标板孔中进行第二轮筛选，37°C温育2h，弃孔内液，并用含0.05% Tween20的TBST溶液清洗10次，同上进行筛选后噬菌体的扩增和滴度的测定，重复以上步骤进行第三轮和第四轮筛选。
[0030]在筛选过程中，将每轮投入筛选的噬菌体量记为Input，洗脱得到的噬菌体量记为Output,分析比较每轮产出/投入比(Input/Output)情况,来反映特异性结合卩遼菌体的富集程度。经过4轮筛选发现:淘选获得的噬菌体越来越多，特异性越来越强，其中第四轮噬菌体滴度为2.2X 106pfu/mL。噬菌体产出投入比逐轮提高(见表1)，表明具有特异性结合作用的噬菌体显示较好的富集效果。
[0031]表1四轮亲和筛选对噬菌体的富集