专利名称：五肽类似物,其制备及其用途的制作方法多肽类化合物具有结构新颖，活性显著，作用专一的特点，其生物活性主要集中于抗肿瘤和抗真菌方面。Dolastatin 15是源自西印度洋软体动物海兔Dolabella auricularia的一个线性天然多肽，经美国国家癌症研究所(NCI)筛选发现具有很强的抑制细胞生长的活性，对多种恶性肿瘤细胞有抑制作用。作用机制的初步探讨发现，其可作用于微管蛋白，抑制有丝分裂，阻断细胞周期。因此有必要寻找新的具有抗肿瘤活性的多肽化合物。发明目的本发明的目的是寻找新的具有抗肿瘤活性的多肽化合物或其先导化合物。发明简述本发明人经研究现已发现式(I)的五肽类似物X-Y-Z-L-M-N(I)或其立体异构体具有良好的抗肿瘤活性，因此式(I)五肽类似物或其立体异构体可作为药物用于治疗癌症。本发明涉及式(I)五肽衍生物或其立体异构体，X-Y-Z-L-M-N(I)其中X为L-或D-α-型-N-端单烷基或双烷基取代的亲脂性氨基酸，四氢异喹啉-3-羧酸，3，4-二氢异喹啉-3-羧酸，烷基为C1-C5的直链或支链或C3-C7元环状烷基，亲脂性氨基酸选自Gly、Ala、Val、Leu、Nle、Ile、Pro、Tle、MeVal等；Y为L-或D-α-型亲脂性天然或非天然氨基酸，如Gly、Ala、Val、Leu、Nle、Ile、Pro、Tle、MeVal等；Z为L-或D-α-型N-端单烷基取代的亲脂性氨基酸，烷基为C1-C5的直链或支链或C3-C7元环状烷基，亲脂性氨基酸为Gly、Ala、Val、Leu、Nle、Ile、Pro、Tle、MeVal等；L和M为下列L-或D-α-型氨基酸中的任意两个或部分自身组合N原子在四～七元环上的氨基酸，3，4-二氢异喹啉-3-羧酸，四氢异喹啉-3-羧酸，反式或顺式-4-取代-脯氨酸，取代基为羟基、卤素、硝基、氨基、C1-C6直链或支链烷基、C3-C7环烷基、C1-C5烷氧基、氨基、C1-C5酰胺基、二(C1-C6直链或支链烷基)胺基、C3-C7环烷胺基、含氧、硫、氮原子的C3-C7环烷胺基；N为脂肪胺或芳香胺衍生物，取代或未取代的肼或肟。本发明涉及含至少一个式(I)五肽衍生物或其立体异构体，及药用载体或赋形剂的药物组合物。X-Y-Z-L-M-N(I)其中X为L-或D-α-型-N-端单烷基或双烷基取代的亲脂性氨基酸，四氢异喹啉-3-羧酸，3，4-二氢异喹啉-3-羧酸，烷基为C1-C5的直链或支链或C3-C7元环状烷基；亲脂性氨基酸为Gly、Ala、Val、Leu、Nle、Ile、Pro、Tle、MeVal等；Y为L-或D-α-型亲脂性天然或非天然氨基酸，Gly、Ala、Val、Leu、Nle、Ile、Pro、Tle、MeVal等；Z为L-或D-α-型N-端单烷基取代的亲脂性氨基酸，烷基为C1-C5的直链或支链、C3-C7元环状烷基，亲脂性氨基酸为Gly、Ala、Val、Leu、Nle、Ile、Pro、Tle、MeVal等；L和M为下列L-或D-α-型氨基酸中的任意两个或部分自身组合N原子在四～七元环上的氨基酸，3，4-二氢异喹啉-3-羧酸，四氢异喹啉-3-羧酸，反式或顺式-4-取代-脯氨酸，取代基为羟基、卤素、硝基、氨基、C1-C6直链或支链烷基、C3-C7环烷基、C1-C5烷氧基、氨基、C1-C5酰胺基、二(C1-C6直链或支链烷基)胺基、C3-C7环烷胺基、含氧、硫、氮原子的C3-C7环烷胺基；N为脂肪胺或芳香胺衍生物，取代或未取代的肼或肟。本发明还涉及制备式I五肽衍生物或其立体异构体的方法，其包括1)将化合物Boc-L-OH与M-OP在DMF，DCM，TEA，DIC-HOBt中反应，其中L，M如权利要求2中定义，P为C1-5烷基，生成Boc-L-M-OP；2)将1)中所得产物在盐酸/二氧六环中脱去氨基保护基，生成L-M-OP；3)将2)中产物L-M-OP与Boc-Z-OH在DMF，DCM，TEA，DIC-HOBt中反应，生成Boc-Z-L-M-OP，所得产物如2)中所述进行反应，生成脱去氨基保护基的Z-L-M-OP；4)将3)中产物Z-L-M-OP与Boc-Y-OH在DMF，DCM，TEA，DIC-HOBt中反应，生成Boc-Y-Z-L-M-OP；5)将4)中产物Boc-Y-Z-L-M-OP在氢氧化钠/甲醇溶液中皂化，然后用柠檬酸酸化，生成Boc-Y-Z-L-M-OH；6)将5)中产物Boc-Y-Z-L-M-OH与N-NHR在DCM，DIC-HOBt中反应，生成Boc-Y-Z-L-M-N；7)将6)中产物Boc-Y-Z-L-M-N如2)中所述进行反应，生成脱去氨基保护基的Y-Z-L-M-N；8)将7)中产物与X-OH在DCM，TEA，DEPC中反应，生成式IX-Y-Z-L-M-N。本发明还涉及式(I)五肽类似物或其立体异构体在制备用于治疗癌症的药物中的用途。涉及的肿瘤细胞如成纤维细胞MRC5CV1、膀胱癌细胞T24、鼠白血病细胞L1210、鼠白血病细胞P388、人肺癌细胞A549、人结肠癌细胞HT29、人结肠癌细胞LOVO、猴肾成纤维细胞CV1、人乳腺癌细胞MCF7、人恶性胶质瘤/星形细胞瘤细胞U373、人卵巢癌细胞HEY、表皮样瘤细胞系KB、黑素瘤细胞B16、MDA-MB-435乳腺癌细胞、HeLa S3子宫颈癌细胞、人红白血病细胞K562、人卵巢癌细胞OVCA2780、人胃印戒癌细胞Kato-III等。
发明详述在本发明中使用的缩写具有下面的含义Ala-丙氨酸，Gly-甘氨酸，Ile-异亮氨酸，Leu-亮氨酸，Val-缬氨酸，MeVal-甲基缬氨酸，Phe-苯丙氨酸，Pro-脯氨酸，BA-苯甲胺，BEA-苯乙胺，DEA-二乙胺，DCHA-二环己胺，Mpl-吗啡啉，Prd-哌啶，TEA-三乙胺，Thp-四氢吡咯，DCM-二氯甲烷，DMF-二甲基甲酰胺，DIC-二异丙基碳二亚胺，HOBt-1-羟基苯并三唑，Boc-叔丁氧羰基，DEPC-氰基磷酸二乙酯，THF-四氢呋喃。
术语“C1-5烷基”指含1-5个碳原子的直链或支链烷基，如甲基，乙基，丙基，异丙基，丁基，仲丁基，异丁基，叔丁基。
本发明所用术语“式(I)五肽类似物立体异构体”是指其相应的D-或L-立体构型。
根据本发明，式(I)五肽类似物或其立体异构体可按本领域已知方法、文献方法或下面所示的反应路线1制备反应路线1 i.DMF，DCM，TAA，DIC-HOBt ii.4N HCl/1，4-Dioxane iii.1N NaOH/MeOHiv.DCM，DIC-HOBtv.DCM，TAA，DEPC在反应路线1中，化合物Boc-L-OH(L如上定义)与M-OP(M如上定义，P为C1-4烷基，其可选自甲基，乙基，异丙基，丁基，仲丁基，异丁基，叔丁基，优选甲基和乙基)在DCM，DMF，TEA，DIC-HOBt中反应，生成Boc-L-M-OP(其中L，M，P如上定义)。将Boc-L-M-OP经4摩尔盐酸/二氧六环脱保护基，生成Z-M-OP。将L-M-OP与Boc-Z-OH在DCM，DMF，TEA，DIC-HOBt中反应，生成Boc-Z-L-M-OP。将Boc-Z-L-M-OP经4摩尔盐酸/二氧六环脱保护基，生成Z-L-M-OP。将Z-L-M-OP与Boc-Y-OH在DCM，DMF，TEA，DIC-HOBt中反应，生成Boc-Y-Z-L-M-OP。将Boc-Y-Z-L-M-OP经1摩尔氢氧化钠/甲醇皂化，生成Boc-Y-Z-L-M-OH。将Boc-Y-Z-L-M-OH与N-NHR在DCM，DIC-HOBt中反应，生成Boc-Y-Z-L-M-N。将Boc-Y-Z-L-M-N经4摩尔盐酸/二氧六环脱保护基，生成Y-Z-L-M-N。将Y-Z-L-MN与X-OH在DCM，TEA，DEPC中反应生成X-Y-Z-L-M-N。
根据本发明，式(I)五肽类似物的立体异构体包括D-和/或L-构型。
根据本发明，式(I)五肽类似物及其立体异构体在人癌症细胞筛选中显示较好的抑制细胞生长的活性。
本发明涉及含有作为活性成分的有效剂量的至少一种式(I)五肽类似物和/或其立体异构体以及常规药物赋形剂或辅剂的药物组合物。通常本发明药物组合物含有0.1～90％的式(I)五肽类似物和/或其立体异构体。药物组合物可根据本领域已知的方法制备。用于此目的时，如果需要，可将式(I)五肽类似物和/或其立体异构体与一种或多种固体或液体药物赋形剂和/或辅剂结合，制成可作为人用的适当的施用形式或剂量形式。
本发明式(I)五肽类似物及其立体异构体或含有它的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔粘膜、皮肤、腹膜或直肠等。给药剂型例如片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、脂质体、透皮剂、口含片、栓剂、冻干粉针剂等。可以是普通制剂、缓释制剂、控释制剂及各种微粒给药系统。为了将单位给药剂型制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子，如稀释剂与吸收剂，如淀粉、糊精、乳糖、甘露醇、蔗糖、葡萄糖、硫酸钙、氯化钠、尿素、碳酸钙、白陶土、微晶纤维素、硅酸铝等；湿润剂与粘合剂，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、紫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂，如干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等；崩解抑制剂，如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氢化油等；吸收促进剂，如季铵盐、十二烷基硫酸钠等；润滑剂，如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡、聚乙二醇等。还可以将片剂进一步制成包衣片，如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。为了将给药单元制成丸剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、Gelucire、高岭土、滑石粉等；粘合剂如阿拉伯胶、黄蓍胶、明胶、乙醇、蜂蜜、米糊或面糊等；崩解剂，如琼脂粉、干燥淀粉、海藻酸盐、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等。为了将给药单元制成栓剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如聚乙二醇、卵磷脂、可可脂、高级醇、高级醇的酯、明胶、半合成甘油酯等。为了将给药单元制成胶囊，将有效成分式I五肽衍生物或其立体异构体与上述的各种载体混合，并将由此得到的混合物置于硬胶囊或软胶囊中。也可将有效成分式I五肽衍生物或其立体异构体制成微囊剂，混悬于水性介质中制成混悬剂，亦可装入硬胶囊中或制成注射剂应用。为了将给药单元制成注射用制剂，如溶液剂、乳剂、冻干粉针剂和混悬剂，可以使用本领域常用的所有稀释剂，如水、乙醇、聚乙二醇、1，3-丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧基化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，为了制备等渗注射液，可以向注射用制剂中添加适量的氯化钠、葡萄糖或甘油，此外，还可以添加常规的助溶剂、缓冲剂、pH调节剂等。
此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或其它材料。
实施例下面的实例及生物活性实验用来进一步说明本发明，但这并不意味着对本发明的任何限制。
实施例化合物熔点由RY-1型熔点仪测定，温度未经校正；1H NMR图谱由Bruker ARX 400型或US Varian Unity Inova 600型核磁仪测定；FAB质谱由Zabspect高分辨磁质谱仪测定；元素分析由CarloErba 1106型元素分析仪测定；紫外光谱由UV-260紫外可见分光光度计测定；红外光谱由Magna IRTM 550红外仪测定。实施例制备所用反应试剂均为商品化产品。
非天然氨基酸的制备N，N-五亚甲基-L-缬氨酸盐酸盐(HCl·PMI-L-Val)的制备L-缬氨酸甲酯盐酸盐3.35克(20mmol)，加入叔丁醇300毫升，溶解，加入三乙胺8.35毫升(60mmol)，混浊，加入1，5-二溴戊烷3.0毫升(22mmol)后，补加叔丁醇100毫升，油浴45℃，36小时。浓缩，加入二氯甲烷20毫升，滤除固体。滤液分别用饱和碳酸氢钠、饱和氯化钠洗一次，二氯甲烷层用无水硫酸钠干燥。滤除干燥剂，浓缩，得棕黄色油状物，加入10毫升盐酸乙醇，溶解，浓缩，用无水乙醇-无水乙醚重结晶，室温放置，析出针状结晶1.7克，m.p.137～139℃。加入4mol/L盐酸溶液，回流4小时，浓缩得白色固体，得约1.4克，m.p.222～225℃，MS[M+H]+＝186。
N，N-六亚甲基胺甲酰-L-亮氨酸(HIM-L-Leu)的制备L-亮氨酸甲酯盐酸盐7.26克(40mmol)，加入二氯甲烷50毫升，溶解，冷却至-10℃，搅拌加入吡啶8毫升(100mmol)，滴加氯甲酸苯酯6.50克(41.5mmol)/20毫升二氯甲烷，搅拌1小时后，倾入冰水中，分出有机相，水相用二氯甲烷提取两次(15毫升×2)，合并有机相，以饱和氯化钠洗两次(20毫升×2)，无水硫酸钠干燥后，减压蒸干，得无色油状物，加入六亚甲基亚胺32毫升(280mmol)、三乙胺80毫升(575mmol)和氯仿20毫升，50～55℃搅拌反应2小时，减压浓缩，加入乙酸乙酯40毫升和水40毫升，乙酸乙酯层分别用1摩尔盐酸(20毫升×2)、饱和碳酸氢钠溶液30毫升和饱和氯化钠溶液洗，无水硫酸钠干燥，浓缩，得无色油状物，加入甲醇80毫升和2摩尔氢氧化钠溶液50毫升，室温搅拌90分钟，以2摩尔盐酸调pH至8.0，减压浓缩至40毫升，乙醚萃取(20毫升×2)，水相在冷却条件下用浓盐酸酸化至pH2～3，析出白色颗粒状晶体，滤集干燥，用乙酸乙酯-环己烷重结晶，得7.4克(72％)，m.p.92～94.5℃，MS[M+H]+＝242。
N-叔丁氧羰基-N-甲基-L-缬氨酸(Boc-N-Me-L-Val)的制备Boc-L-Val 4.35克(20mmol)，加入无水THF/DMF(10∶1)的混合溶液55毫升，溶解，加入碘甲烷10毫升(160mmol)，氢化钠固体2.88克(50％，60mmol)，油浴80℃，24小时。浓缩，加入乙醚和水，振摇分液，水相再用乙醚提取三次(40毫升×3)，乙醚层用无水硫酸钠干燥4小时。滤除干燥剂，浓缩，得黄色分界不明显的油状混合物。加入THF 40毫升，溶解，冰浴搅拌下，滴加1N NaOH 40毫升，冰浴30分钟后，室温反应12小时。浓缩除THF，加入乙醚萃取两次(25毫升×2)，水相加入乙酸乙酯5毫升，于冰浴搅拌下用柠檬酸调pH～2，用乙酸乙酯萃取四次(50毫升×4)，合并乙酸乙酯层，无水硫酸钠干燥4小时。滤除干燥剂，浓缩，得黄色油状物4.2克(90％)，MS[M+H]+＝232。
N-乙酰基-N-甲基-L-缬氨酸(N-Ac-N-Me-L-Val)的制备L-Val 11.7克(0.1mol)，溶于2N NaOH 110毫升(0.22mol)溶液中，冰浴搅拌下，滴加醋酐11.34毫升，温度控制在0～5℃，反应40分钟。加入浓盐酸，调pH～2，析出白色固体12.7克(80％，80mmol)。取出该固体3.2克(20mmol)，加入无水THF/DMF(10∶1)的混合溶液55毫升，溶解，加入碘甲烷10毫升(160mmol)，氢化钠固体2.88克(50％，60mmol)，油浴80℃，24小时。浓缩，加入乙醚和水，振摇分液，水相再用乙醚提取三次(40毫升×3)，乙醚层用无水硫酸钠干燥4小时。滤除干燥剂，浓缩，得黄色分界不明显的油状混合物。加入THF 40毫升，溶解，冰浴搅拌下，滴加1N NaOH 40毫升，冰浴30分钟后，室温反应12小时。浓缩除THF，加入乙醚萃取两次(25毫升×2)，水相加入乙酸乙酯5毫升，于冰浴搅拌下用柠檬酸调pH～2，用乙酸乙酯萃取四次(50毫升×4)，合并乙酸乙酯层，无水硫酸钠干燥4小时。滤除干燥剂，浓缩，得白色针状结晶2.77克(80％)，m.p.112～114℃，MS[M+H]+＝160。
N-甲基-L-脯氨酸(N-Me-L-Pro)的制备
L-Pro 1.0克(8.68mmol)，溶于40毫升水，加入甲醛水溶液(37～40％)0.7毫升(8.68mmol)，钯炭0.25克，通氢气450毫升(20mmol)。吸氢完全后，将反应液加热至微沸，趁热过滤，浓缩滤液，无水乙醇-丙酮重结晶，4℃冰箱过夜，得白色针状结晶1.11克(99％)，m.p.109～112℃，MS[M+H]+＝130。
N，N-二甲基-L-缬氨酸(N，N-Me2-L-Val)的制备方法和途径同N-甲基-L-脯氨酸。产品为白色针状结晶，m.p.152～154℃，MS[M+H]+＝146。
N-叔丁氧羰基-四氢异喹啉-3(R)-羧酸((R)-Boc-Tic)的制备L-Phe 5.0克(33mmol)，加入甲醛水溶液(37～40％)11.5毫升和浓盐酸38毫升，油浴90℃，3小时后，再加入浓盐酸10毫升和甲醛水溶液(37～40％)5毫升，油浴95℃，3小时。室温放置过夜，析出固体。固体在冰浴中用氨水/水(2∶3)溶解，浓盐酸调pH～9.0，有白色固体析出，滤集固体5.72克(98.0％)。取该固体3.90克(22mmol)，冰浴搅拌下加入二氧六环90毫升，水45毫升，1N NaOH45毫升，溶解，加入叔丁氧酸酐5.28克(24.2mmol)，冰浴1.5小时后，室温反应2.5小时。浓缩除二氧六环，乙醚提取两次(30毫升×2)，水相冰浴搅拌下用稀硫酸氢钾溶液调pH～3，水相用乙酸乙酯萃取三次(40毫升×3)，合并有机相，饱和氯化钠洗一次，无水硫酸钠干燥4小时。滤除干燥剂，浓缩，得油状物。加入石油醚冰浴研磨，得到白色固体5.3克(87.0％)，m.p.76～80℃，MS[M+H]+＝278。
N-叔丁氧羰基-顺式-4-(N-四亚甲基胺基)-N-苄基-L-脯氨酰胺(cis-Boc-Thp-L-Pro-BA)的制备反式-4-羟基-L-脯氨酸5.24克(40mmol)，冰浴搅拌下加入二氧六环80毫升，水40毫升，1N NaOH 40毫升，溶解，加入叔丁氧酸酐9.5克(44mmol)，冰浴1小时后，室温反应6小时。浓缩至30毫升，加入乙酸乙酯10毫升，冰浴搅拌下用柠檬酸调pH～2，水相用乙酸乙酯萃取四次(40毫升×4)，合并有机相，饱和氯化钠洗一次，无水硫酸钠干燥4小时。滤除干燥剂，浓缩，得白色结晶。取出该结晶1.15克(5mmol)，二氯甲烷溶解，冰浴搅拌下，加入HOBt 0.74毫克(5.5mmol)的DMF溶液3.72毫升，DIC 0.87毫升(5.5mmol)，冰浴30分钟后，加入苄胺0.55毫升(5.0mmol)。冰浴1小时后，室温反应10小时。浓缩，加入乙酸乙酯10毫升，水洗一次，分别用10％柠檬酸、饱和碳酸氢钠和饱和氯化钠各洗三次，乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥3小时。滤除干燥剂，浓缩滤液，得白色固体1.54克(97％)，m.p.97～101℃。取该白色固体0.64克(2.0mmol)，二氯甲烷溶解，冰盐浴冷却，加入甲磺酰氯0.39毫升(4.0mmol)，三乙胺0.56毫升(4.4mmol)，冰盐浴30分钟。反应液(二氯甲烷)用饱和氯化钠洗后，无水硫酸钠干燥3小时，浓缩，得白色固体0.70克(88％)，m.p.151～156℃。取该白色固体0.1克(0.25mmol)，加入THF 35毫升，溶解，加入四氢吡咯82.7微升(1.0mmol)，氢化钠50毫克，室温反应8小时。反应液(二氯甲烷)用饱和碳酸氢钠、饱和氯化钠各洗两次，有机相用无水硫酸钠干燥2小时。滤除干燥剂，浓缩，得黄色油状物。
N-叔丁氧羰基-顺式-4-(N-二乙基胺基)-N-苄基-L-脯氨酰胺(cis-Boc-Dea-L-Pro-BA)方法和途径同N-叔丁氧羰基-顺式-4-(N-四亚甲基胺基)-N-苄基-L-脯氨酰胺。产品为油状物。
N-叔丁氧羰基-顺式-4-(1-吗啉基)-N-苄基-L-脯氨酰胺(cis-Boc-Mpl-L-Pro-BA)方法和途径同N-叔丁氧羰基-顺式-4-(N-四亚甲基胺基)-N-苄基-L-脯氨酰胺。产品为油状物。
N-叔丁氧羰基-顺式-4-(N-五亚甲基胺基)-N-苄基-L-脯氨酰胺(cis-Boc-Prd-L-Pro-BA)方法和途径同N-叔丁氧羰基-顺式-4-(N-四亚甲基胺基)-N-苄基-L-脯氨酰胺。产品为油状物。
实施例1Me2Val-Val-MeVal-Tic-Pro-NHCH2C6H5(QPP-024)的制备将L-脯氨酸甲酯盐酸盐3.32克(20mmol)，溶于20毫升二氯甲烷中，冰浴搅拌下加入三乙胺2.78毫升(20mmol)，10分钟后，加入Boc-(R)-四氢异喹啉-3-羧酸5.54克(20mmol)，溶解。加入HOBt2.84克(21mmol)的DMF溶液6ml，冰浴10分钟后，加入DIC3.3毫升(21mmol)。继续保持冰浴2小时后，室温反应12小时。浓缩，加入乙酸乙酯50毫升，水洗一次后，分别用10％柠檬酸、饱和碳酸氢钠和饱和氯化钠各洗三次，乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥3小时。滤除干燥剂，浓缩滤液，得黄色油状物7.3克。经硅胶柱层析(乙酸乙酯-石油醚，1∶1，Rf＝0.62)，得到白色结晶5.34克(68.8％，13.8mmol)。取该结晶3.25克(10mmol)，加入4N HCl/二氧六环约20毫升，溶解，室温搅拌1小时。浓缩，得黄色油状液体。二氯甲烷溶解，冰浴搅拌下，加入三乙胺1.39毫升(10mmol)，10分钟后，加入Boc-N-甲基-L-缬氨酸2.30克(10mmol)，溶解。加入HOBt 1.49克(11mmol)的DMF溶液3毫升，冰浴10分钟，加入DIC 1.73毫升(10mmol)。冰浴2小时后，室温反应12小时。浓缩，加入乙酸乙酯40毫升，水洗后，分别用10％柠檬酸、饱和碳酸氢钠和饱和氯化钠各洗三次，乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥3小时。滤除干燥剂，浓缩滤液，得黄色油状物。加入石油醚20毫升，冰浴条件下研磨，得类白色固体2.51克(50％，5mmol)。加入4N HCl/二氧六环约20毫升，溶解后，室温搅拌1小时。浓缩，得黄色粘稠状液体。
所得三肽1.60克(3.2mmol)，二氯甲烷5毫升溶解，冰浴搅拌下加入三乙胺0.45毫升(3.2mmol)，10分钟后，加入Boc-L-缬氨酸0.70克(3.2mmol)，溶解。HOBt 0.45克(3.36mmol)用少量DMF溶解后，加入反应液中。冰浴10分钟后，加入DIC 0.53毫升(3.36mmol)。冰浴2小时后，室温反应7小时。浓缩，加入乙酸乙酯10毫升，水洗一次后，分别用10％柠檬酸、饱和碳酸氢钠和饱和氯化钠各洗三次，乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥。滤除干燥剂，浓缩滤液，得黄色油状物1.5克(86.2％，2.75mmol)。加入甲醇溶解，冰浴搅拌下逐滴加入2N NaOH 2.8毫升(5.6mmol)，冰浴反应30分钟后，保持反应液pH9～10，室温反应3小时。浓缩，加入乙醚和饱和碳酸氢钠，振摇分液，水相再用乙醚提取一次，于冰浴搅拌下加入柠檬酸调pH～4，用乙酸乙酯萃取三次(25毫升×3)，合并乙酸乙酯层，饱和氯化钠洗后，无水硫酸钠干燥。滤除干燥剂，浓缩，得黄色油状物1.08克(2.05mmol)。
所得四肽黄色油状物0.216g(0.41mmol)，二氯甲烷10毫升溶解，冰浴搅拌下，加入HOBt 60毫克(0.451mmol)的DMF溶液0.3毫升，DIC 71微升，冰浴30分钟后，加入苯乙胺51.7微升。冰浴1小时后，室温反应11小时。浓缩，加入乙酸乙酯10毫升，水洗后，分别用10％柠檬酸、饱和碳酸氢钠和饱和氯化钠各洗三次，乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥4小时。滤除干燥剂，浓缩滤液，得黄色油状物0.22克(0.35mmol)。加入4N HCl/二氧六环约5毫升，溶解，室温搅拌1小时。浓缩，得黄色油状液体0.22克(0.35mmol)。
上述四肽酰胺0.11克(0.175mmol)，二氯甲烷5毫升溶解，冰盐浴搅拌下加入三乙胺60.9微升(0.44mmol)，10分钟后，加入N，N-二甲基缬氨酸25.4毫克(0.175mmol)，DEPC 40.0微升(0.26mmol)。冰盐浴1小时后，室温反应24小时。浓缩，加入二氯甲烷10毫升，水洗，分别用饱和碳酸氢钠和饱和氯化钠各洗两次，二氯甲烷层用无水硫酸钠干燥4小时。滤除干燥剂，浓缩滤液，得淡黄色油状液体。MS[M+H]+＝703，纯度85％。
实施例2Me2Val-Val-MeVal-Pro-ThpPro-NHCH2C6H5(QPP-018)的制备将L-脯氨酸甲酯盐酸盐2.48克(15mmol)，溶于20毫升二氯甲烷中，冰浴搅拌下加入Boc-甲基缬氨酸二环己胺盐6.18克(15mmol)，溶解。10分钟后，加入HOBt 2.23克(17.5mmol)的DMF溶液3ml，冰浴10分钟后，加入DIC 2.60毫升(17.5mmol)。继续保持冰浴2小时后，室温反应12小时。浓缩，加入乙酸乙酯50毫升，水洗一次后，分别用10％柠檬酸、饱和碳酸氢钠和饱和氯化钠各洗三次，乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥3小时。滤除干燥剂，浓缩滤液，得淡黄色油状物。经硅胶柱层析(乙酸乙酯-石油醚，1∶1，Rf＝0.50)，得到白色固体2.46克(48％，7.2mmol)。加入4N HCl/二氧六环约15毫升，溶解，室温搅拌1小时。浓缩，得白色固体。二氯甲烷溶解，冰浴搅拌下，加入三乙胺0.98毫升(7.0mmol)，10分钟后，加入Boc-L-缬氨酸1.52克(7.0mmol)，溶解。加入HOBt 1.04克(7.7mmol)的DMF溶液3毫升，冰浴10分钟，加入DIC 1.22毫升(7.7mmol)。冰浴2小时后，室温反应12小时。浓缩，加入乙酸乙酯20毫升，水洗后，分别用10％柠檬酸、饱和碳酸氢钠和饱和氯化钠各洗三次，乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥3小时。滤除干燥剂，浓缩滤液，得淡黄色油状物3.06克(6.94mmol)。加入4N HCl/二氧六环约20毫升，溶解后，室温搅拌1小时。浓缩，得黄色油状液体。加入甲醇溶解，冰浴搅拌下逐滴加入2N NaOH 6.94毫升(13.88mmol)，冰浴反应30分钟后，保持反应液pH9～10，室温反应5小时。加入柠檬酸调pH～7，浓缩，加入乙酸乙酯5毫升，水相于冰浴搅拌下加入柠檬酸调pH～4，用乙酸乙酯萃取三次(25毫升×3)，合并乙酸乙酯层，饱和氯化钠洗后，无水硫酸钠干燥。滤除干燥剂，浓缩，得淡黄色油状物2.30克(5.39mmol)。
所得三肽0.11克(0.25mmol)，二氯甲烷5毫升溶解，冰浴搅拌下加入三乙胺69.6微升(0.25mmol)，10分钟后，加入Boc-顺式-4-(N，N-四亚甲基胺基)-L-脯氨酸-苄酰胺93.7毫克(0.25mmol)，溶解。HOBt 37.1微克(0.275mmol)用少量DMF溶解后，加入反应液中。冰浴10分钟后，加入DIC 43.3微升(0.275mmol)。冰浴2小时后，室温反应7小时。浓缩，加入二氯甲烷10毫升，水洗一次后，分别用饱和碳酸氢钠和饱和氯化钠各洗三次，二氯甲烷层用无水硫酸钠干燥。滤除干燥剂，浓缩滤液，得黄色油状物。加入4N HCl/二氧六环约20毫升，溶解后，室温搅拌1小时。浓缩，得淡黄色油状液体。
所得四肽酰胺淡黄色油状物40毫克(0.059mmol)，二氯甲烷10毫升溶解，冰盐浴搅拌下，加入三乙胺41.0微升(0.35mmol)，10分钟后，加入N，N-二甲基缬氨酸8.6毫克(0.295mmol)，DEPC 27微升(0.177mmol)。冰盐浴1小时后，室温反应24小时。浓缩，加入二氯甲烷5毫升，水洗，分别用饱和碳酸氢钠和饱和氯化钠各洗三次，二氯甲烷层用无水硫酸钠干燥4小时。滤除干燥剂，浓缩滤液，得淡黄色油状液体。MS[M+H]+＝710，纯度80％。
依据与实施例1或实施例2相同或相似的方法制备得到了以下化合物PMI-Val-Val-MeVal-Pro-Pro-NHCH2Ph(QPP-001)分子量680纯度85％PMI-Val-Ala-MeVal-Pro-Pro-NHCH2Ph(QPP-002)分子量652纯度90％PMI-Val-Leu-MeVal-Pro-Pro-NHCH2Ph(QPP-003)分子量694纯度85％PMI-Val-Ile-MeVal-Pro-Pro-NHCH2Ph(QPP-004)分子量694纯度85％HIM-Leu-Val-MeVal-Pro-Pro-NHCH2CH2Ph(QPP-005)分子量766纯度80％HIM-Leu-Ala-MeVal-Pro-Pro-NHCH2CH2Ph(QPP-006)分子量738纯度80％HIM-Leu-Leu-MeVal-Pro-Pro-NHCH2CH2Ph(QPP-007)分子量780纯度90％HIM-Leu-Ile-MeVal-Pro-Pro-NHCH2CH2Ph(QPP-008)分子量780纯度95％HIM-Leu-Val-MeVal-Pro-Pro-NHCH2Ph(QPP-009)分子量752纯度90％HIM-Leu-Ala-MeVal-Pro-Pro-NHCH2Ph(QPP-010)分子量724纯度90％HIM-Leu-Leu-MeVal-Pro-Pro-NHCH2Ph(QTP-011)分子量766纯度90％HIM-Leu-Ile-MeVal-Pro-Pro-NHCH2Ph(QTP-012)分子量766纯度90％Ac-N-MeVal-Val-MeVal-Pro-Pro-NHCH2Ph(QPP-013)分子量668纯度95％Boc-MeVal-Val-MeVal-Pro-Pro-NHCH2Ph(QPP-014)分子量726纯度95％HCl·MeVal-Val-MeVal-Pro-Pro-NHCH2Ph(QPP-015)分子量762.5纯度95％Me2Val-Val-MeVal-Pro-Tic-NHCH2Ph(QPP-016)分子量702纯度80％Me2Val-Val-MeVal-Pro-DeaPro-NHCH2Ph(QPP-017)分子量711纯度85％Me2Val-Val-MeVal-Pro-ThpPro-NHCH2Ph(QPP-018)分子量709纯度85％CMe2Val-Val-MeVal-Pro-MplPro-NHCH2Ph(QPP-019)分子量725纯度80％Me2Val-Val-MeVal-Pro-PrdPro-NHCH2Ph(QPP-020)分子量707纯度82％N-MePro-Val-MeVal-Pro-Pro-NHCH2Ph(QPP-021)分子量624纯度95％N-MePro-Val-MeVal-Pro-DeaPro-NHCH2Ph(QPP-022)分子量695纯度80％N-MePro-Val-MeVal-Pro-ThpPro-NHCH2Ph(QPP-023)分子量693纯度80％Me2Val-Val-MeVal-Tic-Pro-NHCH2C6H5(QPP-024)分子量702纯度95％
其余各化合物可依据上述方法和途径制备而成。
实施例3MTT显色法检测体外抗癌活性。
肿瘤细胞悬液的制备取传代培养72小时的K562、OVCA2780、Kato-III细胞株，用0.4％台盼兰与细胞悬液1∶1(50μl加50μl)混匀，立即按白细胞计数法计数活细胞数，每毫升的活细胞数＝计数值×5000。然后用10％小牛血清RPMI1640液将细胞浓度调整到3.125×105个/毫升，备用。
加样培养在无菌条件下，向96孔细胞培养板中每孔加入以调整好的3.125×105个/毫升K562细胞悬液80μl和已设定好的本发明化合物浓度20μl，每个化合物浓度设3～6个复孔，然后置37℃，5％CO2，饱和湿度孵温箱中培养48小时，加0.25％MTT液20μl/孔，继续培养4小时，然后加入10％SDS100μl/孔，置孵温箱培养过夜。
OD值测定将上述含有培养物加入SDS在孵温箱中培养过夜的96孔板置多孔扫描分光光度计Multiskan MCC/340 MKII中，选用单波长570nm测定OD值，计算OD值的百分率及化合物IC50。
OD值(％)＝给化合组OD/溶剂对照组OD×100％IC50值是以化合物浓度对OD百分率的对数值做线性回归后得出的。化合物号OD值(x±s)K562OVCA2780 Kato-IIIQPP-0010.8063±0.0609* 0.5713±0.0040* 0.9523±0.0327*QPP-0021.3020±0.00350.6473±0.05911.0975±0.0542QPP-0031.0557±0.08790.3513±0.07350.9887±0.0139QPP-0041.3570±0.07310.6927±0.03981.1170±0.0165QPP-0050.9370±0.04060.4080±0.00890.8840±0.0056QPP-0060.9670±0.04790.3886±0.00550.9007±0.0193QPP-0070.8667±0.01880.4223±0.01960.8440±0.0271QPP-0080.8967±0.02110.4303±0.00970.8583±0.0323QPP-0090.9517±0.02910.6267±0.01100.9720±0.0426QPP-0100.9483±0.01530.5693±0.02750.9853±0.0133QPP-0110.7923±0.07920.6247±0.07131.0207±0.0753QPP-0120.8380±0.02880.6267±0.02041.0793±0.0392QPP-0130.7953±0.0110* 0.6572±0.1308* 0.9670±0.0118*QPP-0140.7613±0.01510.5230±0.00820.9377±0.0457QPP-0150.6933±0.02150.5853±0.00400.8610±0.0101QPP-0161.0653±0.01800.6413±0.00931.0007±0.0250QPP-0170.7290±0.03600.4953±0.01990.8350±0.0240QPP-0180.6743±0.0290* 0.6423±0.0475* 0.7327±0.0121*QPP-0191.3343±0.02810.6980±0.05441.1840±0.0225QPP-0201.2533±0.07650.6560±0.01051.2130±0.0216QPP-0250.6713±0.03220.4803±0.01270.6340±0.0248*p＜0.05，显示抑制肿瘤细胞生长的活性。


本发明涉及具有抗肿瘤活性的五肽衍生物，其制备方法，含它们的药物组合物及它们在治疗癌症中的用途。