表达传染性法氏囊病毒vp2蛋白的重组火鸡疱疹病毒疫苗及应用的制作方法【技术领域】，具体涉及一种重组有传染性法氏囊病毒VP2蛋白的火鸡疱疹病毒疫苗及其在预防传染性法氏囊病中的用途。[0002]传染性法氏囊病(Infect1usbursal disease, IBD)是由鸡传染性法氏囊病毒(Infect1us bursaldisease virus, IBDV)引起的禽类急性、高度接触性免疫抑制性传染病，可以通过导致法氏囊损伤、免疫抑制和引起雏鸡高死亡率对家禽养殖造成巨大的经济损失[I]。目前商品化的传染性法氏囊病活毒疫苗分为弱毒、中毒和强毒三类。弱毒活疫苗对SPF鸡安全，但对有母源抗体鸡群的免疫保护力效果不理想。中等毒力和强毒疫苗的免疫保护力虽然要高很多，但由于具有一定的致病力而损伤法氏囊。同时，由于母源抗体的干扰以及IBDV的特点，在实际应用中传统疫苗可形成不可避免的免疫空白期。因此，安全有效的法氏囊基因工程疫苗是近些年的研究热点之一。VP2蛋白是IBDV的构象保护性抗原，VP2中和抗体可以引发机体对于法氏囊强毒攻 击的保护[2]，构建表达IBDV VP2基因的重组活载体疫苗具有潜在的应用价值。[0003]HVT Fc-126株作为原型马立克疫苗自1970年以来一直使用，该疫苗无致瘤性，保护效果良好，可以冻干，使用方便，已成为世界各国普遍使用的疫苗[3-5]。火鸡疱疹病毒(HVT)作为病毒载体携带外源保护性抗原基因方面，与其它病毒载体相比具有许多优势:其对鸡及其它动物均无致病性，使用安全；接种鸡体后病毒在鸡体内形成长达数周的病毒血症,可刺激机体产生较高的抗体水平并维持终身，接种一次即可获得终生免疫；HVT疫苗不仅生产成本低，而且可以冻干，易于贮存和运输。同时，近些年来以HVT为载体的基因工程疫苗一直是国内外学者研究的热点。新城疫病毒(NDV)、血清I型MDV、传染性法氏囊病病毒(IBDV)、传染性喉气管炎病毒(ILTV)、禽白血病病毒(ALV)以及艾美尔球虫病(Eimeria)的保护性抗原都已在HVT载体中获得表达，而且能抵抗致死剂量病原的感染[6-8，16-19]。因而以HVT为载体的基因工程疫苗的研究具有广阔的应用前景。
[0004]本研究以实验室构建的连续覆盖火鸡疱疹病毒(HVT)全基因组的Fosmid文库为基础，利用Red ET同源重组技术和Gateway LR克隆技术，将携带Pec复合启动子的VP2基因插入到火鸡疱疹病毒复制非必需区HVT053与HVT054位点处，获得了表达VP2蛋白的重组HVT(rHVT-VP2)。动物实验结果表明rHVT_5354VP2能够提供针对传染性法氏囊病毒的完全保护力，具有潜在的推广应用价值。[0005]具体的，本发明提供以下各项:[0006]1.一种表达传染性法氏囊病毒VP2蛋白的重组火鸡疱疹病毒(HVT)，其特征在于，所述VP2蛋白的编码基因插入HVT基因组的复制非必需区。[0007]2.如I所述重组火鸡疱疹病毒，其中，所述复制非必需区为HVT基因组HVT053与HVT054 之间。
[0008]3.如I或2所述重组火鸡疱疹病毒，其中，所述VP2蛋白的编码基因处于强启动子下游。
[0009]4.如3所述重组火鸡疱疹病毒，其中，所述启动子可以是复合启动子，优选Pec启动子，所述Pec启动子包括一个CMV增强子和一个β -actin启动子。
[0010]5.一种表达传染性法氏囊病毒VP2蛋白的重组火鸡疱疹病毒(Meleagridherpesvirusl)rHVT-5354VP2，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:V201327。
[0011]6.一种构建表达传染性法氏囊病毒VP2蛋白的重组火鸡疱疹病毒的方法，包括以下步骤:
[0012]I)从HVT基因组的Fosmid文库中筛选出可共转染拯救病毒的粘粒组；
[0013]2)在所述粘粒组的一个粘粒中引入VP2蛋白的编码基因；
[0014]3)拯救重组病毒。
[0015]7.如6所述的方法，其中，所述粘粒组的粘粒共同覆盖整个HVT基因组。
[0016]8.如6或7所述的方法，其中，所述引入VP2蛋白的编码基因为使用同源重组引入，优选使用Red ET同源重组技术和Gateway LR克隆技术。
[0017]9.如6或7所述的方法，其中，引入VP2蛋白的编码基因的粘粒具有HVT基因组的复制非必需区。
[0018]10.1-5任一项所述的重组病毒和/或6-9任一项所述方法制备的重组病毒用于制备预防传染性法氏囊病疫苗的用途。
[0019]发明详述
[0020]以下对本发明的技术方案做进一步详细阐述。应当指出，本发明的各实施方案可以根据需要以任何方式组合。
[0021]本发明的第一个方面，提供一种表达传染性法氏囊病毒VP2蛋白的重组火鸡疱疹病毒(HVT)，具体是所述VP2蛋白的编码基因插入HVT基因组的复制非必需区中。
[0022]在一个具体的实施方案中，所述复制非必需区可以但不限于是HVT基因组HVT053与HVT054，只要该区域在基因组的复制中不是必不可少，即可用来作为插入区。
[0023]由于已有实验证明VP2在火鸡疱疹病毒(HVT)载体上的表达量与禽法氏囊病(IBD)的保护呈正相关[7]。因此，在本发明的一个具体的实施方式中，所述VP2蛋白的编码基因处于强启动子下游以强化对禽法氏囊病。所述强启动子可以但不限于是复合启动子，只要能够增强下游目的蛋白的合适的启动调控序列均包含在本发明的范围内。所述复合启动子优选Pec启动子，Pec启动子作为一种新型的启动子包含了一个CMV增强子和一个β — actin启动子，其在鸡胚成纤维细胞上的启动能力是CMV的三倍之多。
[0024]本发明的第二个方面，提供一种构建表达传染性法氏囊病毒VP2蛋白的重组火鸡疱疹病毒的方法，其中用到fosmid文库技术。
[0025]fosmid文库技术是分子生物学领域的一项新技术，广泛地用于基因组测序和筛选新基因等。
[0026] 因此，在本发明的一个具体实施方案中，所述构建表达传染性法氏囊病毒VP2蛋白的重组火鸡疱疹病毒的方法包括以下步骤:
[0027]I)从HVT基因组的Fosmid文库中筛选出可共转染拯救病毒的粘粒组；
[0028]2)在所述粘粒组的一个粘粒中引入VP2蛋白的编码基因；
[0029]3)拯救重组病毒。
[0030]在一个进一步的实施方案中，所述可共转染拯救病毒的粘粒组为从Fosmid文库中大量的粘粒中筛选出的组合，这些粘粒组可以共同覆盖整个HVT基因组区域，从而能够在共转染细胞后出现HVT病毒典型病变，即病毒拯救。也即只要是能够拯救产生病毒的粘粒组均可以用于本发明的重组病毒的构建，而不限于以下实施例中具体的粘粒组合。
[0031]在另一个进一步的实施方案中，所述向一个粘粒中引入VP2蛋白的编码基因可以但不限于采用同源重组的方式进行，只要能使VP2蛋白表达于病毒表面，且不影响病毒拯救的任何引入方法均在本发明的范围内。
[0032]在优选的实施方案中，所述引入VP2蛋白的编码基因为使用同源重组引入，优选使用Red ET同源重组技术和Gateway LR克隆技术，通过该方法，将VP2蛋白编码基因与重组载体上的元件同源取代。
[0033]在进一步的优选的实施方案中，所述VP2蛋白编码基因处于如前所述的强启动子控制下。
[0034]此外，本发明的第三个方面，提供如前所述的重组病毒和/或所述方法制备的重组病毒用于制备预防传染性法氏囊病疫苗的用途。
[0035]综上所述，本研究以HVT反向遗传操作系统为基础，采用Gateway LR克隆技术，将IBDV保护性抗原基因VP2插入到HVT基因组HVT053与HVT054基因之间的复制非必需区，成功构建了表达传染性法氏囊病毒VP2基因的重组火鸡疱疹病毒。此种构建策略是对传统的构建重组活载体疫苗方法的简化和改良，省去了转移载体的构建和反复地对转染细胞进行加压筛选等冗长步骤，为重组活载体疫苗的构建提供了新思路和新方法。VP2作为IBDV的主要宿主保护性抗原已经在多种活病毒载体表达过(包括HVT)，但都存在着不能有效诱导中和抗体的产生或诱导保护率较低的问题，已有的研究包括包含SV40早期启动子表达VP2的重组MDV结果证明对鸡是安全的但是只能产生部分保护并且持续时间短[5，6];包含CMV启动子的表达VP2的重组HVT(rHVT)进行一次免疫时只能产生部分保护，由此可见VP2表达系统的选择对疫苗保护效力有着至关重要的影响。已有实验证明VP2在火鸡疱疹病毒(HVT)载体上的表达量与禽法氏囊病(IBD)的保护呈正相关[7]。由此我们选择了 Pec启动子，Pec启动子作为一种新型的启动子包含了一个CMV增强子和一个β — actin启动子，其在鸡胚成纤维细胞上的启动能力是CMV的三倍之多。本实验的研究结果表明以5000PFU剂量的rHVT-VP2接种I日龄鸡能够提供针对传染性法氏囊病的完全保护力。



[0036]图1.pEntr-VP2的构建过程。
[0037]用引物VP2CU和VP2CD扩增VP2，利用EcoR I和Bgl II将扩增获得的VP2基因与PCAGGS质粒连接形成PCAGG-VP2，其次，利用Sal I和Hind III将VP2表达框架Pec-VP2-P0LYA 切下并与 pEntrMCS (Invitrogen)相连接形成 pEntr_VP2。
[0038]图2.pFosC DEST 质粒图谱[0039]图3.pFosCVP2 质粒图谱
[0040]图4.重组病毒rHVT_5354VP2的拯救示意图。
[0041]图5.重组病毒rHVT-5354VP2的PCR鉴定结果。
[0042]M: Marker
[0043]l:rHVT5354VP2
[0044]2: HVT
[0045]图6.重组病毒rHVT5354VP2的免疫印迹鉴定鉴定结果。
[0046]M: Marker
[0047]l:rHVT5354VP2
[0048]2: HVT
[0049]3: CEF
[0050]图7.重组病毒rHVT5354VP2的间接免疫荧光鉴定结果。
[0051]A:rHVT5354VP2
[0052]B: HVT

[0053]材料方法
[0054]材料
[0055]HVT为FC126株购自中国兽医药品监察所，IBDV HLJ-0504株，由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所禽传染病研究室提供。9~10日龄SPF鸡胚由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供。pCAGGs[20]、pENTR(购自invitrogen公司)质粒由本实验室保存。反转录试剂盒、LR Clonase II enzyme、One Shot ccdBSurvival2TlR competentcells 均购自 invitrogen 公司，phus1n 高保真酶购自 NEB 公司，EcoR1、Bglll、Hindlll、Sail 核酸内切酶购自 NEB 公司，CounterSelect1nBAC modificat1n kit 购自 Gene Bridge公司，EPI300-Tlcells及其fosmid高拷贝诱导剂均购自Epicentre公司。
[0056]方法
[0057]IHVT基因组DNA的提取
[0058]用9-10日龄SPF鸡胚，按照常规方法进行原代及次代鸡胚成纤维细胞(CEF)的制备和培养。24h细胞长成单层后，按IX 1-4PFU/细胞接种HVT，接种72h后，在细胞出现80%病变时，收取细胞。如Morgan等所述的方法制备病毒DNA [16]。
[0059]2HVT基因组Fosmid文库构建
[0060]用物理方法将上述方法制备的病毒DNA随机剪切成约30_45Kb大小的片段。胶回收30-45Kb的DNA片段，回收产物进行末端修饰。末端修饰反应体系(所有试剂均购自 Takara 公司):10XEnd-Repair Buffer8ul, 2.5mM dNTP Mix8ul, 1mM ATP8ul,End-Repairenzyme Mix4ul,浓度为0.5ug/ul的剪切DNA20ug,最后无菌水补足80ul。室温孵育45分钟,70°C孵育10分钟灭活End-Repair enzyme (Takara)。精制修饰好末端的DNA,加上Sbf I接头。将回收后的DNA片段连接到pCClFOS (Epicentre)载体上，4°C过夜。连接液进行包装反应，包装好的混和液进行10倍梯度稀释，分别取10_2，?ο-4, ?ο-5,10_6四个稀释度的稀释液10 μ I感染100 μ I ΕΡΙ300菌株，将此菌涂于含12.5 μ g/ml氯霉素的LB平板，37°C过夜培养，统计菌落数量，并计算其滴度，结果为4.2xl04cfu/lib。即成功构建HVT的fosmid 文库。
[0061 ] 3拯救rHVT病毒粘粒的筛选
[0062]文库构建成功后，挑取288个克隆提取粘粒，用碱裂解法提取粘粒，送大连宝生物公司对插入pCClFos中的HVT DNA片段末端进行测序，测序引物序列如下:
[0063]FP:5’ -GGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGG-3’ (SEQ ID NO:1)
[0064]RP:5’ -CTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGC-3’ (SEQ ID NO:2)
[0065]经过末端测序的分析，共得到插入片段两端都连接有完整Fse 1-Sbf I接头的克隆246个。从这246个克隆中选取多组用于拯救HVT的5粘粒组合。其中每组中克隆的HVTDNA片段两端都含有Fse 1-Sbf I接头，能相互重叠，且能拼接覆盖全HVT基因组。
[0066]用Qiagen公司的中量提取试剂盒提取所选择的粘粒的DNA。用Fse 1、Sbf I内切酶(均购自New England B1labs)对所选择的粘粒进行线性化处理,反应条件如下:Sbf I内切酶20U，粘粒5 μ g，37°C作用2小时，酚/氯仿抽提，异丙醇沉淀制备转染用HVT DNA0参照Reddy SM (2002)的磷酸钙方法将5段HVT DNA共转染次代鸡胚成纤维细胞(CEF)，经多次重复，其中有I组5粘粒组合(分别命名为pFosA，pFosB, pFosC, pFosD, pFosE，其长度及在基因组中的位置如表1所示)转染6-8天后出现HVT病毒典型病变，收获此组5粘粒共转染拯救的病毒，命名为rHVT。
[0067]表1
[0068]