专利名称：用于降低甲状旁腺激素水平的治疗剂的制作方法图10为在急性肾机能不全大鼠(1K1C模型)中作为以小时计的时间的函数的以给药前基线值的百分比表示的甲状旁腺激素水平的图表，其中大鼠经由IV推注以0. 3mg/kg(正方形,三角形)和0. 5mg/kgO,菱形)的剂量给予化合物Ac-c (C)arrrar-NH2 (SEQ IDNO :3，正方形，* 记号)和 Ac-c (Ac-C) arrrar-NH2 (SEQ ID NO :146，三角形，菱形)；图11为在经由微孔促进的透皮递送Ac-Crrrrrr-NH2 (SEQ ID NO :6，两只动物,正方形和三角形)治疗或经由透皮递送用盐水(菱形)治疗的大鼠中，作为以小时计的时间的函数的以给药前基线值的百分比表示的甲状旁腺激素水平的图表；图12为在经由微孔促进的透皮递送Ac-c (Oarrrar-NH2 (SEQ ID NO 3)治疗的大鼠中，作为以小时计的时间的函数的以给药前基线值的百分比表示的甲状旁腺激素水平的图表；图13 为在正常 Sprague-Dawley 大鼠中 6 小时 IV 输注 Ac_c (C) arrrar_NH2 (SEQID NO 3)期间及之后的平均PTH(作为基线的百分比)的图表，其中化合物以Iu g/kg/小时(正方形)、3 ii g/kg/小时(圆形)和10 ii g/kg/小时(三角形)速率输注；图14A显示在急性肾机能不全IKlC大鼠模型中6小时IV输注Ac_c (C)arrrar-NH2 (SEQ ID NO :3)期间及之后的PTH(作为基线的百分比)，其中以30 y g/kg/小时(菱形)和IOOii g/kg/小时(正方形)给药速率静脉内输注大鼠；图14B为显示如在图14A中治疗的IKlC模型大鼠中以mg/dL计的血清钙的柱状图。通过参考以下本文包括的优选实施方案和实施例的详细说明，可更易于理解本发明主题。详细说明I.定义在本申请中，除非另外指出，否则本申请的术语定义和技术阐明可参考任何若干著名参考书，例如Sambrook, J.，等，Molecular Cloning A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) ；Goeddel, D.编辑，Gene ExpressionTechnology, Methods in Enzymology,185, Academic Press, San Diego, CA(1991)；“Guide to Protein Purification，，载于 Deutshcer,M. P.编辑,Methods in Enzymology,Academic Press, San Diego, CA(1989) ;Innis，等，PCR ProtocolsA Guide to Methodsand Applications, Academic Press, San Diego, CA(1990) ；Freshney, R. I. , Cultureof Animal Cell A Manual of Basic Technique,第 2 版，Alan Liss, Inc. New York,NY(1987) ；Murray,E. J.编辑，Gene Transfer and Expression Protocols,第 109-128 页，The Humana Press Inc. ;Clifton,NJ和 Lewin,B. , Genes VI,Oxford University Press, New York(1997)。除非另外指出，否则本文所用单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数提及物。例如，“一种”调节剂肽包括一种或多种调节剂肽。如本文所用的，在以下情况时，化合物具有“降低甲状旁腺激素水平的活性”或“降低PTH的活性”:化合物当给予受试者时相对于给予化合物之前的血浆PTH浓度降低血浆甲状旁腺激素(PTH)。在一个实施方案中，PTH水平的降低为在给予化合物后I小时比给予化合物之前的 PTH 水平低至少 20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或 95%。本文所用“不存在组胺反应”或“缺乏组胺反应”，意指产生在本文所述测定中在体外测量的小于15倍、14倍、13倍、12倍、11倍、10倍、9倍、8倍、7倍、6倍、5倍、4倍或3倍的组胺增加的化合物量，其中倍数变化基于与化合物孵育之前和与化合物孵育15分钟后的组胺水平来测定。本文所用“氨基酸”是指天然和非天然氨基酸。通过含前缀“L-”(非手性的甘氨酸除外)的三字母代码或通过大写字母的一字母代码来指明二十种天然存在的氨基酸(L-异构体)丙氨酸(“L-Ala”或“A”)、精氨酸(“L-Arg”或“R”)、天冬酰胺(“L_Asn”或“N”)、天冬氨酸(“L-Asp”或“D”)、半胱氨酸(“L-Cys”或“C”)、谷氨酰胺(“L_Gln”或“Q”)、谷氨酸(“L-Glu” 或“E”)、甘氨酸(“Gly” 或“G”)、组氨酸(“L_His” 或“H”)、异亮氨酸(“L-Ile”或“I”)、亮氨酸(“L-Leu”或“L”)、赖氨酸(“L_Lys”或“K”)、甲硫氨酸(“L-Met”或“M”)、苯丙氨酸(“L-Phe”或“F”)、脯氨酸(“L-Pto”或“P”)、丝氨酸(“ L-Ser ”或“S”)、苏氨酸(“L_Thr”或“T”)、色氨酸(“1^11)”或1”)、酪氨酸(“L_Tyr”或“Y”)和缬氨酸(“L-Val”或“V”)。L-正亮氨酸和L-正缬氨酸可分别表示为(NLeu)和(NVal)。十九种天然存在的手性氨基酸具有相应的D-异构体，其通过含前缀“D-”的三字母代码或通过小写字母的一字母代码来指明丙氨酸(“D-Ala”或“a”)、精氨酸(“D_Arg”或“r”)、天冬酰胺(“D-Asn”或“a”)、天冬氨酸(“D_Asp”或“d”)、半胱氨酸(“D_Cys”或“c”)、谷氨酰胺(“D-Gln”或“q”)、谷氨酸(“D_Glu”或“e”)、组氨酸(“D_His”或“h”)、异亮氨酸(“D-Ile”或“i”)、亮氨酸(“D-Leu”或“I”)、赖氨酸(“D_Lys”或“k”)、甲硫氨酸(“D-Met”或“m”)、苯丙氨酸(“D_Phe”或“f ”)、脯氨酸(“D-Pro”或“p”)、丝氨酸(“D-Ser”或“S”)、苏氨酸(“D_Thr”或“t”)、色氨酸(“D_Trp”或“w”)、酪氨酸(“D-Tyr”或“y”)和缬氨酸(“D_Val ”或“v”)。D-正亮氨酸和D-正缬氨酸可分别表示为(dNLeu)和(dNVal)。尽管通常关于肽、多肽或蛋白质单体亚单位使用“氨基酸残基”，通常关于游离分子使用“氨基酸”，但本领域中这些术语的使用重叠并变化。术语“氨基酸”和“氨基酸残基”可互换使用，视上下文而定可指游离分子或肽、多肽或蛋白质的单体亚单位。为了测定两个氨基酸序列的“同源性”百分比或“同一性”百分比，为最佳比较目的比对所述序列(例如为了与另一多肽的最佳比对可将空位引入一个多肽的序列中)。然后比较相应氨基酸位置的氨基酸残基。当一个序列中的位置被与另一序列中相应位置相同的氨基酸残基占据时，则分子在该位置同一。本文所用氨基酸或核酸“同源性”等同于氨基酸或核酸“同一性”。因此，两个序列之间的序列同一性百分比为所述序列共有的同一位置数目的函数(即序列同一性百分比=同一位置的数目/总位置数目X 100)。可用VectorNTI 软件包(Invitrogen Corporation, 5791 Van Allen Way, Carlsbad, CA 92008)测定两个多肽序列之间的序列同一性百分比。用空位开放罚分10和空位延伸罚分0. I来测 定两个多肽同一性的百分比。所有其它参数设置为缺省设置。“阳离子氨基酸”意指在生理pH(7. 4)下具有净正电荷的氨基酸残基，如例如在以下氨基酸残基中的情况，在所述氨基酸残基中侧链或“R基团”含有胺官能团或在生理PH下可接受质子而带正电荷的其它官能团(例如胍或咪唑部分)。阳离子氨基酸残基包括精氨酸、赖氨酸、组氨酸、2，3-二氨基丙酸(Dap)、2，4-二氨基丁酸(Dab)、鸟氨酸和高精氨酸。“阳离子亚单位”意指在生理pH(7. 4)下具有净正电荷的亚单位。本文所用“保守氨基酸取代”是不导致所选择的多肽或蛋白质的活性或三级结构显著改变的取代。所述取代通常涉及用具有相似物理化学性质的不同氨基酸残基置换所选择的氨基酸残基。根据物理化学性质来对氨基酸及氨基酸残基的分组为本领域技术人员所知。例如，在天然存在的氨基酸中，本领域定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族，包括碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。本文所用“化学交联”，是指两个或更多个分子共价键合。若肽或肽片段具有与母体肽或多肽的至少5个氨基酸残基、更优选8个氨基酸残基的邻接序列同一或同源的氨基酸序列，则所述肽或肽片段“源自”所述母体肽或多肽。除非另外指出，否则本文所用术语“甲状旁腺功能亢进”是指原发性、继发性和三发性甲状旁腺功能亢进。术语“皮内”意指在本文所述治疗方法中，将治疗有效量的拟钙化合物(calcimimetic compound)施用至皮肤以将所述化合物递送到角质层下的皮肤层，由此达到所期需的治疗效果。本文所用“分离的”或“纯化的”多肽或其生物学活性部分，当通过重组DNA技术产生时不含某些细胞材料，或当化学合成时不含化学前体或其它化学药品。表述“基本上不含细胞材料”包括这样的多肽制备物，其中所述多肽与天然或重组产生它的细胞的某些细胞组分分离。当多肽或其生物学活性部分为重组产生时，其亦优选基本上不含培养基，即培养基占多肽制备物体积的小于约20%、更优选小于约10%和最优选小于约5%。表述“基本上不含化学前体或其它化学药品”包括这样的多肽制备物，其中所述多肽与化学前体或在多肽合成中涉及的其它化学药品分开。在一个实施方案中，表述“基本上不含化学前体或其它化学药品”包括这样的多肽制备物，其具有小于约30% (干重)的化学前体或其它化学药品，优选小于约20%的化学前体或其它化学药品，更优选小于约15%的化学前体或其它化学药品，甚至更优选小于约10%的化学前体或其它化学药品，最优选小于约5%的化学前体或其它化学药品。在优选实施方案中，分离的多肽或其生物学活性部分没有来自结构域多肽所来源的同一生物体的污染多肽。本文所用“大分子”是指诸如肽、多肽、蛋白质或核酸等分子，其通常具有大于约900道尔顿的分子量。“非阳离子氨基酸”意指在生理pH(7. 4)下不带电荷或带净负电荷的氨基酸残基，如例如在以下氨基酸残基中的情况，在所述氨基酸残基中侧链或“R基团”为中性(中性极性和中性非极性)和酸性的。非阳离子氨基酸包括这样的残基其具有作为烃烷基或芳族部分的R基团(例如缬氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸)；中性极性R基团(天 冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸)；或中性非极性R基团(甘氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)。具酸性R基团的非阳离子氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。“聚合物”是指通过共价键连接的两个或更多个相同或不同亚单位的线性链。本文所用“肽”和“多肽”是指由通过肽键连接的氨基酸残基链构成的任何聚合物，而不管其大小。尽管通常关于相对大的多肽使用“蛋白质”，通常关于小多肽使用“肽”，但这些术语的使用在本领域重叠并变化。因此，为简单起见，本文将使用术语“肽”，但在一些情况下本领域可将同一聚合物称为“多肽”。除非另外指出，否则肽序列以从氨基末端到羧基末端的次序给出。本文所用“含巯基的基团”或“含巯基部分”意指包含硫-氢键(-SH)且在生理条件下能够与另一疏基反应形成~■硫键的官能团。能够与另一疏基形成~■硫键的疏基本文称为“活性巯基”。在优选实施方案中，含巯基的基团离化合物骨架少于6个原子。在更优选实施方案中，含巯基的基团具有结构(-SH-CH2-CH2-C (0) -0-) _。本文所用“小分子”是指大分子以外的分子，例如有机分子，其通常具有小于1000道尔顿的分子量。本文所用“受试者”是指人受试者或动物受试者。“亚单位”意指单体单位，其与不止一个其它单体单位连接以形成多聚化合物，其中亚单位是多聚化合物中要素的最短重复模式。例示性亚单位为氨基酸，其当连接时形成聚合物化合物，例如本领域称为肽、多肽或蛋白质的聚合物化合物。本文所用“治疗有效量”，是产生所期需治疗效果所需的量。例如，在用于降低高血钙受试者血清钙的方法中，治疗有效量为将血清钙水平降低至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20% 或 25%所需的量。钙可作为总钙或作为离子化钙测量。举另一个实例，在用于降低体内PTH的方法中，治疗有效量为降低PTH水平至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%或 25%所需的量。本文所用术语“透皮”，意即在本文所述治疗方法中，将治疗有效量的拟钙剂施用至皮肤以将所述化合物递送到全身循环，由此达到所期需治疗效果。除非另外规定，否则本文提及的所有文件都通过引用以其整体结合。II.化合物在一方面，提供包含亚单位的序列X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7的化合物，其中X1为包含巯基的亚单位；x5为阳离子亚单位；x6为非阳离子亚单位；x7为阳离子亚单位；x2、x3和中的至少两个独立为阳离子亚单位。化合物具有降低受试者血液中的甲状旁腺激素(PTH)水平和/或钙水平的活性。如以下所阐明，甲状旁腺激素水平的降低，意指相对于用化合物治疗前的血浆或血液PTH浓度，受试者血浆或血液PTH浓度的降低。在一个实施方案中，相对于给药前的血浆PTH，化合物达到在给药后I小时内降低血浆PTH浓度至少50%。所述化合物通过肽例示，但技术人员了解的是，可基于本文所述结构-活性研究设计具有所期需 活性的非肽化合物。本文所用甲状旁腺激素或PTH是由甲状旁腺产生的84个氨基酸的肽及其分解产物。除了全长PTH (其由残基I -84组成，有时称为“完整”的“生物活性” PTH)，血液中存在由蛋白水解及其它代谢途径产生的各种PTH片段。完整PTH分子的氨基末端1-34的区域具有生物活性。分子的该区域含有使PTH能够与靶标组织中的甲状旁腺激素受体结合的氨基酸序列。认为完整PTH分子的中间和羧基末端35-84的区域无生物学活性，但具有免疫学反应性。认为PTH 7-84发挥与1-84PTH相反的作用。业已开发了不同测定来测量PTH水平(包括各种分解产物)，这些测定由Souberbielle等，Kidney International,77 :93-100(2010)综述，该文献通过引用并入本文。在一个实施方案中，用验证过的检测PTH(1-84)的完整生物活性形式的PTH定量方法确定本文定义的具有降低PTH水平活性的化合物，市售试剂盒已为本领域所知(例如参见本文实施例3)。在第一个研究中，产生了含有4-7个阳离子(例如精氨酸)亚单位的化合物，并与基线PTH值和盐水治疗的动物相比测试其降低PTH的能力。具体而言，建立急性肾机能不全IKlC模型，用于在肾功能障碍环境中表征降低PTH的活性。在实施例IA中阐述了 IKlC模型，合成用于测试的化合物包括(i) Ac-Crrrr-NH2 (SEQ ID NO 4) > (ii) Ac-crrrrr-NH2 (SEQID NO :5)、(iii) Ac-crrrrrr-NH2 (SEQ ID NO :6)、(iv) Ac-crrrrrrr-NH2 (SEQ ID NO :7)和(V)盐水对照。如实施例IB所述，通过30分钟IV输注将鉴定为SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQID NO 6和SEQ ID NO :7的化合物各自给予IKlC模型动物。图I显示作为给药前(基线)水平的百分比的血浆PTH水平的降低。以3mg/kg给予的所有四种化合物导致血浆PTH显著降低，但PTH降低的效价及持续时间的差异提示净正电荷和降低PTH的活性之间的关系。例如，具有6个阳离子(精氨酸)亚单位的化合物Ac-Crrrrrr-NH2(SEQ ID NO 6 ;三角形)，与分别含有4个和5个阳离子(精氨酸)亚单位的化合物AC-Crrrr-NH2 (SEQ ID NO 4 ;菱形)和AC-Crrrrr-NH2 (SEQ ID N0:5;正方形)相比，具有提高的功效以及增加的作用持续时间。令人惊讶的是，与具有7个阳离子(精氨酸)残基的化合物Ac-Crrrrrrr-NH2 (SEQ IDNO :7，空心正方形)相比,具有6个阳离子(精氨酸)亚单位的化合物Ac-Crrrrrr-NH2 (SEQID N0:6;三角形)具有增加的作用持续时间，这表明化合物的活性或效价不仅仅与化合物的阳离子电荷的增加有关。也就是说，具有7个阳离子亚单位(精氨酸残基)的化合物Ac-crrrrrrr-NH2(SEQ ID NO :7)，产生与具有更少阳离子残基的化合物相似的初始PTH降低，但在给药后 24 小时内，效价不如 Ac-crrrrrr-NH2 (SEQ ID NO 6)和 Ac-crrrrr_NH2 (SEQID NO 5)。这些后两种化合物在24小时时间点，分别产生约40%和60%的平均PTH降低。PTH降低的程度和PTH持续时间二者都是获得对需要治疗的患者最佳治疗益处的重要标准。应该注意，在本研究中以相同mg/kg剂量给予化合物，但是，由于分子量不同，实际上给予不同摩尔数量的每一种化合物。因此，在每摩尔基础上，Ac-Crrrrrr-NH2(SEQ ID NO 6)比 Ac-Cmr-NH2 (SEQ ID NO 4)和 Ac-Crmr-NH2 (SEQ ID NO 5)明显更有效。为了探索化合物的结构-活性关系，进行了进一步研究。通过在每一 X2-X7亚单位位置用丙氨酸残基序贯置换精氨酸残基，来修饰化合物Ac-Crrrrrr-NH2 (SEQ ID NO :6)。在实施例2所述的体外人钙感受受体(CaSR)测定中表征化合物，其中用表达人钙感受受体的HEK 293细胞来测量例示性化合物的活性。不希望受理论的束缚,认为所述化合物体内降低PTH的机理是通过激活CaSR来进行的，CaSR在甲状旁腺中表达并控制PTH分泌。激活CaSR导致细胞内钙和肌醇-3-磷酸(IP3)的增加，并随后聚积肌醇-磷酸-I (IP1)。因此，在该体外测定中，测定化合物降低IP1产生达50%的半数最大有效浓度(EC5tl)。如实施例3所述，亦在体内检测同一化合物以测定其降低PTH的活性。结果示于表I中。表I中标题为“盐水对照的PTH AUC (1-4小时)％”的栏目中的数值，定义活性为作为得自盐水治疗的对照大鼠PTH AUC的百分比的在4小时内PTH的曲线下面积(AUC)的降低。例如，等于0的AUC (化合物治疗的)/AUC (盐水对照)*100，表示高活性的降低PTH的化合物，其在单次IV给予异氟烷(IF)麻醉的正常大鼠后完全抑制PTH (到不能检测的水平)持续4小时。与此相反，等于或大于100的AUC(化合物治疗的)/AUC(盐水对照)*100的值，表示无活性的化合物。表I例示件化合物的体外和体内活件本发明阐述具有降低甲状旁腺激素水平的活性的化合物。在一个实施方案中，所述化合物由亚单位的邻接序列X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7组成，其中X1亚单位包含含巯基部分，X2-X7亚单位上的电荷分布提供所期需活性。亦阐述使用所述化合物治疗甲状旁腺功能亢进、骨病和/或高血钙病症的方法，具体而言，提供用于降低血浆PTH和血清钙的方法。所述化合物可用于治疗具有例如以下疾病的受试者原发性、继发性或三发性甲状旁腺功能亢进；恶性肿瘤的高钙血症；转移性骨病；或骨质疏松症。