专利名称：检测或辅助检测ii类细菌素产生菌群体感应信号肽的方法微生物在生长的过程中能够自发产生、释放一些特定的信号分子，并能感知其浓度变化，调节其群体行为，这种现象称为群体感应(Quorum sensing, QS),产生的信号分子叫做自诱导物(autoinducer, Al)。目前已知很多种类的细菌可以通过群体感应来调控生理行为。目前对一些G-细菌群体感应信号分子——N-酰基高丝氨酸内酯(AHLs)的检测已有很多研究报道和相关专利，如储卫华等“群体感应信号分子及其抑制剂快速检测方法的建立”，郭秀春等“气质联用技术检测海绵共栖细菌中N-酰基高丝氨酸内酯类信号分子”，曹广霞等“细菌群体感应信号分子N-酰基高丝氨酸内酯的检测”，周志刚等“水产病原菌群体感应信号分子的检测方法及其专用试剂盒”。但对于许多产II类细菌素乳酸菌，其信号分子一般为寡肽，由于缺乏相关的遗传背景，对其结构和组成知之甚少，目前还没有群体感应信号肽的检测方法的专利。自诱导肽(AIP)类化合物是产II类细菌素乳酸菌群体感应中最重要的一类信号分子，调控包括其自身基因在内的一系列细菌素合成调控基因以及结构基因的表达。Saucier 等(Saucier L, Poon A, Stiles ME.1nduction of bacteriocin inCarnobacterium piscicola LV17.J Appl Mocrobiol, 1995, 78:684-690)的研究表明自诱导妝可以启动细菌素的合成，Schmitz 等(Schmitz S, Hoffmann A, Szekat C, et al.Thelantibiotic mersacidin is an autoinducing peptide.Appl Environ Microbiol,2006,72:7270-7277)认为自诱导肽可以诱发细菌素提早合成。快速、简便、有效地检测细菌能否产生AIP，成为深入研究和了解产II类细菌素乳酸菌群体感应的重要手段。脱脂乳培养基是适合大多数乳酸菌生长的培养基，但许多乳酸菌在脱脂乳培养基中生长缓慢，以此培养基来检测自诱导肽，周期长。
本发明的一个目的是提供一种检测或者辅助检测来源于II类细菌素产生菌代谢物的待检测肽是否含有II类细菌素产生菌群体感应信号肽或是否为II类细菌素产生菌群体感应信号肽的方法。该方法包括如下步骤:先将II类细菌素产生菌悬浮于无菌生理盐水中，接种于液体改良脱脂乳培养基中培养，在达 到稳定期之前的这一时间段中的任一时刻(上述培养体系此时不含有II类细菌素)，向所述液体改良脱脂乳培养基中添加待检测肽，继续培养至10-16h，如13h，得到培养物；检测所述培养物中是否存在所述II类细菌素，按照如下方法确定所述待检测肽是否含有II类细菌素产生菌群体感应信号肽或是否为II类细菌素产生菌群体感应信号肽:若所述培养物中存在所述II类细菌素，则所述待检测肽含有或候选含有所述II类细菌素产生菌的群体感应信号肽，或所述待检测肽为或候选为II类细菌素产生菌群体感应信号肽；反之，则所述待检测肽不含有或候选不含有所述II类细菌素产生菌的群体感应信号肽，或所述待检测肽不为或候选不为所述II类细菌素产生菌的群体感应信号肽。所述II类细菌素产生菌产生II类细菌素受群体感应系统调控；所述待检测肽来源于将所述II类细菌素产生菌在产生II类细菌素状态下进行发酵得到的发酵上清液；所述改良脱脂乳培养基是在脱脂乳培养基中添加酵母浸粉得到的培养基，在所述改良脱脂乳培养基中，所述酵母浸粉、脱脂乳与水的配比为0.5g: (8-12g): 100ml，如0.5g: Ilg: 100ml。在本发明的一个实施例中，所述将所述II类细菌素产生菌接种于液体改良脱脂乳培养基中培养，接种量为0.5% (体积比)，培养温度为37°C，培养至指数期，时间为0-12h，如 8h。在本发明的实施例中，所述待检测肽具体是通过包括如下步骤的方法制备得到的:用40% -80%，如60%饱和度的硫酸铵溶液过夜沉淀所述II类细菌素产生菌在产生II类细菌素状态下的发酵上清液，进而得到所述待检测肽。所述发酵上清液是按照包括如下步骤的方法获得的:将所述II类细菌素产生菌接种于能使所述II类细菌素产生菌产生II类细菌素的培养基中培养至稳定期这一时间段中的任一时刻，如稳定期末期(上述培养体系此时含有II类细菌素)，收集得到所述发酵上清液。在本发明的实施例中，所述能使所述II类细菌素产生菌产生II类细菌素的培养基具体为MRS培养基。实际操作中，所述发酵上清液的获得方法包括如下步骤:将所述II类细菌素产生菌以体积百分比0.5 I %，或体积百分比0.5 %的接种量接种到MRS培养基中，30 37°C培养10-48h，或37°C培 养10-48h，或37°C培养24h后，收集获得含有所述待检测肽的所述发酵上清液。所述液体MRS培养基的溶剂为水，溶质为蛋白胨、牛肉膏、酵母浸粉、K2HPO4.3Η20、柠檬酸三铵、NaAC、葡萄糖、MgSO4.7H20、MnSO4.H2O和吐温80 ;所述水、所述蛋白胨、所述牛肉膏、所述酵母浸粉、所述K2HPO4.3H20、所述柠檬酸三铵、所述NaAC、所述葡萄糖、所述MgSO4.7Η20、所述MnSO4^H2O和所述吐温80 的配比为 100ml: IOg: IOg: 5g: 2g: 2g: 5g:20g: 0.58g: 0.25g: lmL。所述方法中检测所述培养物中是否存在所述II类细菌素是通过检测所述培养物对指示菌的抑菌作用实现的，如果所述培养物对指示菌有抑菌作用，所述培养物中含有所述II类细菌素，如果所述培养物对指示菌无抑菌作用，所述培养物中不含有所述II类细菌素。所述指示菌为其生长能被所述II类细菌素抑制的菌株，如单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)54002。在本发明的实施例中，检测所述培养物对所述指示菌的抑菌作用的方法具体可包括如下步骤:首先，将经过所述待检测肽诱导培养10-16h，如13h的所述II类细菌素产生菌培养物的上清液过滤除菌，并调整pH至6.5 7.0。其次，取新鲜过夜培养的指示菌，用无菌生理盐水稀释至IO6 107CFU/mL，如106CFU/mL，取ImL与冷却至45 55°C，如50°C的15 20ml MRS固体培养基混匀倒平板。待平板凝固后，放入牛津杯，分为实验组和对照组。实验组按照50 200 μ I/杯，如100 μ I/杯的用量，加入上述处理过的上清液，对照组中不加入上述待测液体。37°C培养18 36h，如24h，观察抑菌效果。如果对照组无抑菌圈，而实验组出现抑菌圈，则所述培养物对所述指示菌有抑菌作用，如果对照组无抑菌圈，而实验组也未出现抑菌圈，则所述培养物对所述指示菌无抑菌作用。上述方法中的所述待检细菌为乳酸菌，如乳杆菌。在本发明的实施例中具体为戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus) 31-1。本发明的另一个目的是提供一种检测或辅助检测II类细菌素产生菌群体感应信号肽的培养基，为改良脱脂乳培养基。所述改良脱脂乳培养基是在脱脂乳培养基中添加酵母浸粉得到的培养基。在所述改良脱脂乳培养 基中，所述酵母浸粉、脱脂乳与水的配比为0.5g: (8-12g): 100ml，如 0.5g:1lg: 100ml。本发明所提供的改良的脱脂乳培养基以脱脂乳培养基为基础，添加酵母浸粉，力口快了乳酸菌的生长和产细菌素进程，使得自诱导的检测更加简便、快速。与MRS培养基相t匕，乳酸菌在此培养基中II类细菌素合成速度慢，在某一培养状态下，自诱导肽对细菌素合成的诱导效应能够被有效地监测。多数乳酸菌均可在此培养基上生长，当接种量小于某特定阈值时，控制培养时间，使乳酸菌不产生细菌素，当加入自诱导肽后可恢复其产II类细菌素的能力。将产II类细菌素乳酸菌接种于该培养基，通过控制接种量和培养时间，控制乳酸菌的细菌素合成行为，使之处于不产细菌素的状态，添加来自于该菌株自身的肽类提取物，控制培养时间，监测II类细菌素的产生。该体系的建立有助于大规模高通量筛选产II类细菌素乳酸菌群体感应自诱导肽。本发明方法准确率高，没有假阴性现象，易于定性定量分析，操作简便，成本低，获得结果迅速，适合大规模高效率检测。图1为检测或者辅助检测来源于II类细菌素产生菌代谢物的待检测肽是否含有II类细菌素产生菌群体感应信号肽或是否为II类细菌素产生菌群体感应信号肽的流程图。图2为自诱导肽诱导II类细菌素产生的抑菌活性实验结果。其中，A为对照组I(用等量MRS液体培养基代替待检测肽诱导的液体脱脂乳培养基培养物的抑菌效果)；B为实验组(经待检测肽F22诱导的液体脱脂乳培养基培养物的抑菌效果)；(:为对照组2(待检测肽F22的抑菌效果)山为对照组3 (培养物与待检测肽相加的抑菌效果，与实验组不同之处在于待检测肽F22是在培养完成之后加入的)。图3为利用液体脱脂乳培养基检测或辅助检测待检细菌产生II类细菌素是否存在群体感应调控现象的流程图。图4为自诱导物诱导II类细菌素产生的抑菌活性实验结果。其中，A实验组* (经自诱导物诱导的液体脱脂乳培养基培养物的抑菌效果)出为对照组I * (用等量MRS液体培养基代替自诱导物诱导的液体脱脂乳培养基培养物的抑菌效果)；(:为对照组3* (对照组I *与等量的自诱导物混合后的抑菌效果)山为对照组2 * (自诱导物的抑菌效果)。

7.0,121°C灭菌 20min。固体MRS培养基:为液体MRS培养基加入15g/L琼脂。实施例1、检测或辅助检测来源于II类细菌素产生菌L.pentosus 31-1的待检测肽是否是群体感应信号肽戍糖乳杆菌(Lactobacilluspentosus) 31-1 为 II 类细菌素产生菌(GuorongLiu, Yanni Lv,Pinglan Li,Kang Zhou,Jinglan Zhang.Pentocin 31-1,an anti—Listeriabacteriocin produced by Lactobacillus pentosus 31-1 isolated from Xuan-ffeiHam, a traditionalChina fermented meat product.Food Control,2008,19:353-359.Zhang Jinlan, Liu Guorong, Shang Nan, Cheng ffanpeng, Chen Shangwu, Li Pinglan二Purification and Partial Amino Acid Sequence of Pentocin 31-1,an Ant1-ListeriaBacteriocin Produced by Lactobacillus pentosus 31—1.Journal of FoodProtection, Volume 72，Number 12.2524-2529.)，经鉴定其II类细菌素的产生存在群体感应调控现象(具体鉴定方法参见本实施例结尾处)。本实施例将详述如何利用本发明的方法检测或辅助检测来源于II类细菌素产生菌L.pentosus 31-1的待检测肽是否是群体感应信号肽(实验流程如图1所示)。具体按照如下步骤进行:1、待检测肽的提取将悬浮于无菌生理盐水(109cfu/ml)中的L.pentosus 31-1以0.5% (体积比)的接种量接种到MRS培养基中，37°C培养24h(L.pentosus 31-1处于稳定期末期，IlOOOXg离心5min，收集上清液，调节pH至6.5 7.0，过滤除菌，制备发酵上清液。用60%饱和度硫酸铵过夜沉淀，IlOOOXg冷冻离心IOmin,收集沉淀,冷冻干燥。将上述样品用0.02M的Na2HPO4-NaH2PO4 (pH7.0)复溶至终浓度为0.5g/ml。用NMWL3000(截留相对分子质量为3000，美国Millipore，NMWL 3000), NMWL 1000(截留相对分子质量为1000，，美国Millipore，NMWL 1000)滤膜超滤，分别收集> 3000Da和1000 3000Da的组分。过辛基-琼脂糖凝胶(Octyl Sepharose 4FF)柱(北京瑞达恒辉科技发展有限公司HA-0670-01，层析柱规格30cm(柱长)X 1.0cm(内径))，进行疏水层析，具体按如下操作:用 0.02mol/L ρΗ7.0 的 Na2HPO4-NaH2PO4 加(NH4)2SO4 的平衡缓冲液(0.02mol/L ρΗ7.0的 Na2HPO4-NaH2PO4 溶液的配方为:61ml 浓度为 0.2mol/L 的 Na2HPO4, 39ml 浓度为 0.2mol/L的NaH2PO4，用蒸馏水定容至1000ml) ((NH4)2SO4在上述平衡缓冲液中的终浓度为lmol/L)平衡洗去杂质，以1.5ml/min的流速匀速上样，上样量为0.5ml，待样品上完后，再用0.02mol/L ρΗ7.0 的 Na2HPO4-NaH2PO4 洗脱液(配方为:61ml 浓度为 0.2mol/L Na2HPO4, 39ml 浓度为
0.2mol/L NaH2PO4，用蒸馏水定容至1000ml)洗下目标产品。测定OD22tl值(用HD-5型电脑紫外检测仪进行在线检测，上海青浦沪西仪器厂)，根据图形波峰波谷的情况，分别收集在220nm有吸收的各个洗脱峰，再把收集的每个洗脱峰对应的收集液用真空冷冻干燥机冷冻干燥(FD-1博医康冷冻干燥机，北京博医康实验仪器有限公司)，共得到2份粗品待检测肽(每一份粗品待检测肽对应所收集的一个洗脱峰)，分别命名为Fl和F2。将上述获得的粗品待检测肽(Fl和F2)分别用0.02mol/L的Na2HPO4-NaH2PO4 (配方为:61ml浓度为0.2mol/L的Na2HPO4, 39ml浓度为0.2mol/L的NaH2PO4,用蒸懼水定容至1000ml)复溶至终浓度为5mg/ml。再将其过Sephadex G-1O柱((0.7cmX 18.5cm)，柱填料购自北京拜尔迪生物公司(Pharmacia 17-0010-01)，进行凝胶过滤层析，上样量为0.5ml,流速为 0.3ml/min,用 0.02mol/L 的 Na2HPO4-NaH2PO4 洗脱。测定 OD220 值(用 HD-5 型电脑紫外检测仪进行在线检测，上海青浦沪西仪器厂)，根据图形波峰波谷的情况，分别收集在220nm有吸收的各个洗脱峰，再把收集的每个洗脱峰对应的收集液用真空冷冻干燥机冷冻干燥(FD-1博医康冷冻干燥机，北京博医康实验仪器有限公司)，共得到4份待检测肽(每一份待检测肽对应 所收集的一个洗脱峰)。由粗品待检测肽Fl得到的待检测肽分别命名为F11、F12 ；由粗品待检测肽F2得到的待检测肽分别命名为F21和F22。其中，一个待检测肽F22所对应的洗脱峰的保留时间是60min。2、诱导时间的确定将悬浮于无菌生理盐水中的L.pentosus 31-1 (109cfu/ml)以0.5% (体积比)的接种量分别接种到液体改良脱脂乳培养基、液体脱脂乳培养基中，37°C培养，每a检测上述两种液体培养基的培养物中是否存在II类细菌素，记录出现细菌素活性的时间。具体方法为:分别收集上述两种液体培养基的培养物，13800Xg离心5min，取上清液过滤除菌，调节pH至6.5 7.0,取100 μ I备用。以可被L pentosus 31-1所产II类细菌素抑制生长的植物乳杆菌(L.Plantarum) PL2 (武朋朋，刘国荣,畅晓渊，张香美，李平兰.抗猪链球菌戊糖乳杆菌素的纯化及特性研究.中国农业大学学报，2011，16 (5):121-126)为指示菌用杯碟法测定上述两种液体培养基培养物上清液的抑菌活性，从而判定所述培养物中是否含有II类细菌素。具体操作为:取过夜培养的新鲜指示菌植物乳杆菌(L.plantarum)PL2，用无菌生理盐水稀释至106CFU/mL，取Iml与冷却至50°C的20ml的MRS固体培养基混匀倒平板。待凝固后，放入牛津杯，按照100 μ I/杯的用量，加入经上述处理的上清液，37°C培养24h，观察抑菌效果。结果显示，加入了液体改良脱脂乳培养基中> 14h(指数期末期)培养物上清液的平板均产生了抑菌圈，而加入液体脱脂乳培养基中的直至72h的培养物上清液的平板也未产生抑菌圈。这一结果表明，所述两种培养基的培养物上清液在指数期中期(< 14h)这一时段均不存在II类细菌素，进而说明在指数期中期(< 14h)这一时段(L.pent0SUS31-l菌株未产生II类细菌素的时间段)均可用于检测自诱导肽。3、诱导将步骤I制备的共4份待检测肽分别添加到步骤2培养有L.pentosus 31-1 (L.pentosus 31-1处于指数期，培养8h)的上述两种液体培养基中进行诱导，使待检测肽的浓度为0.5 μ g/ml (实验组)，继续培养一段时间(脱脂乳培养基培养至13h或60h，改良脱脂乳培养基培养至13h)。同时，每种培养基均设置以等量液体MRS培养基替代待检测肽进行诱导的对照(对照组I)。4、检测收集步骤3中两种液体培养基的培养物，13800 Xg离心5min，取上清液过滤除菌，调节pH至6.5 7.0,以可被L.pentosus 31-1所产II类细菌素抑制生长的植物乳杆菌(Lplantarum)PL2为指示菌，用杯碟法测定上述两种液体培养基培养物上清液的抑菌活性，从而判定所述培养物中是否含有II类细菌素，进而判定所述L.pentosus 31-1经待检测肽处理后，是否恢复产生II类细菌素。具体操作为:取过夜培养的新鲜指示菌植物乳杆菌(L.plantarum)PL2，用无菌生理盐水稀释至106CFU/mL，取Iml与冷却至50°C左右的20ml的MRS固体培养基混匀倒 平板。待凝固后，放入牛津杯，按照100 μ I/杯的用量，加入经上述处理的上清液，同时以100 μ I待检测肽(所述待检测肽溶于MRS培养基中，使其终浓度与诱导所用浓度相同，即待检测肽终浓度为0.5 μ g/ml)(对照组2)，以及100 μ I L.pentosus31-1培养物(脱脂乳培养基培养至13h或60h，改良脱脂乳培养基培养至13h)与待检测肽(终浓度为0.5 μ g/ml)的混合物，与实验组不同之处在于待检测肽F22是在培养完成之后加入的(对照组3)作为对照，37°C培养24h，观察抑菌效果。结果显示:(I)对于脱脂乳培养基(加入待检测肽后继续培养至13h组)，添加了不同待检测肽的3个对照组和实验组均无抑菌圈出现；(2)对于脱脂乳培养基(加入待检测肽后继续培养至60h组)，添加了 F22的3个对照组无抑菌圈出现，而实验组出现抑菌圈；添加了 Fl1、F12、F21的3个对照组和实验组均无抑菌圈出现；(3)对于改良脱脂乳培养基(加入待检测肽后继续培养至13h组)，添加了 F22的3个对照组无抑菌圈出现，而实验组出现抑菌圈(图2);添加了 F11、F12、F21的3个对照组和实验组均无抑菌圈出现。本实施例的实验结果表明，加入待检测肽F22(保留时间为60min)继续培养(改良脱脂乳培养基继续培养至13h，脱脂乳培养基继续培养至60h)后使L.pentosus 31-1启动II类细菌素合成(相应的培养物上清中存在II类细菌素)，则说明待检测肽F22 (保留时间为60min)为L.pentosus 31_1菌株产生II类细菌素群体感应的自诱导肽。与脱脂乳培养基(加入自诱导肽后培养至60h)相比，选用改良脱脂乳培养基(加入自诱导肽后培养至13h)可以快速地甄别群体感应自诱导肽，缩短检测时间。上述实施例中，鉴定L pentosus 31_1产生II类细菌素存在群体感应调控现象的具体方法如下(实验流程如图3所示):具体按照如下步骤进行:I)制备自诱导物(发酵上清液)将悬浮于无菌生理盐水(109cfu/ml)中的戍糖乳杆菌(L.pentosus) 31-1以0.5% (体积比)的接种量接种到液体MRS培养基中，37 °C培养24h(戊糖乳杆菌(L.pentosus) 31-1处于稳定期末期)，13800 Xg离心5min,收集发酵上清液,作为自诱导物。2)获得具有不产II类细菌素细胞表型的L.pentosus 31-1将悬浮于无菌生理盐水(109cfu/ml)中的L.pentosus 31-1以0.5% (体积比)的接种量分别接种到液体脱脂乳培养基(同时设置如下四种液体培养基作为液体脱脂乳培养基的对照:液体MRS培养基、液体1/2MRS培养基、液体1/5MRS培养基和液体1/10MRS培养基)中，并在37°C条件下培养12h、24h、36h、48h、60h、72h后，分别检测此时五种液体培养基的培养物中是否存在II类细菌素。具体方法为:分别收集不同培养时间的五种液体培养基的培养物，13800 X g离心5min，取上清液过滤除菌，调节pH至6.5 7.0，取100 μ I备用。以可被所述待检细菌所产II类细菌素抑制生长的植物乳杆菌(L.plantarum)PL2为指示菌用杯碟法测定上述不同培养时间的五种液体培养基培养物上清液的抑菌活性，从而判定所述培养物中是否含有II类细菌素。具体操作为:取过夜培养的新鲜指示菌植物乳杆菌(L.plantarum)PL2，用无菌生理盐水稀释至106CFU/mL，取Iml与冷却至50°C的20ml的MRS固体培养基混匀倒平板。待凝固后，放入牛津杯，按照100 μ I/杯的用量，加入经上述处理的上清液，37°C培养24h，观察抑菌效果。结果显示，经过72h培养，加入了液体脱脂乳培养基培养物上清液的平板仍未产生抑菌圈，而加入作为对照的四种液体培养基(MRS培养基、1/2MRS培养基、1/5MRS培养基和1/10MRS培养基)平板均产生抑菌圈(表I)。这一结果表明，包括对照培养基在内的共五种培养基中，只有所述液体脱脂乳培养基的培养物上清液中不存在II类细菌素，进而说明利用所述液体脱脂乳培养基获得了不产II类细菌素细胞表型的L.pentosus 31_1。表I不同培养基对L.pentosus 31-1合成II类细菌素的影响


本发明公开了一种检测或者辅助检测来源于II类细菌素产生菌代谢物的待检测肽是否含有或为II类细菌素产生菌群体感应信号肽的方法。本发明所提供的方法包括如下步骤先将II类细菌素产生菌接种于液体改良脱脂乳培养基中培养，在到达稳定期之前这一时段中的任一时刻，向所述液体改良脱脂乳培养基中添加待检测肽，继续培养至10-16h，得到培养物；检测所述培养物中是否存在所述II类细菌素；若所述培养物中存在所述II类细菌素，则所述待检测肽含有或候选含有，或是或候选是所述II类细菌素产生菌的群体感应信号肽。本发明选用改良脱脂乳培养基可以甄别群体感应自诱导肽，且与脱脂乳培养基相比，更加快速，大大缩短了检测时间。