一种基于不对称膜的人体黑素细胞的培养方法[0005]本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种基于不对称的生物膜材料的黑素细胞的培养方法。[0006]本发明的目的是通过以下技术方案来实现的:一种基于不对称膜材料的黑素细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤: Cl)制备不对称的生物膜材料:将一种或两种生物相容性材料按1:50-50:1的重量比例混合后，配成质量浓度为1-10%的水溶液；将水溶液注入细胞培养板，鼓风条件下于30-70°C下烘0.1-5小时，使溶液表面水分挥发，形成1-10微米的致密膜；然后加入氢氧化钠-碳酸钠水溶液，浸泡24小时，使致密膜下层溶液发生相分离，形成多孔结构，所述氢氧化钠-碳酸钠水溶液中，氢氧化钠和碳酸钠的总质量与水的质量配比为1-10:90-99混合组成，且氢氧化钠与碳酸钠的质量配比为1:3-3:1 ;用去离子水清洗至溶液pH为中性，-6(T-40°C冷冻干燥8-24小时，得到不对称膜；然后用交联剂对不对称膜在20-50°C交联处理0.5-24小时，交联处理后用纯净水冲洗除净残留的交联剂，再在鼓风条件下于30-120°C 下烘 2-48 小时。[0007](2)构建细胞-不对称膜复合材料:不对称膜用于接种细胞前，用体积浓度为75%的酒精浸泡12小时，随后再用PBS洗净残留酒精，并置于紫外灯下照射3-24小时。完成消毒灭菌后，在细胞培养板里注入细胞培养液，置于细胞培养箱中于37° C、体积浓度为5%的C02、饱和湿度条件进行孵化。将按1-40:0-200: 0-100的细胞个数比例共培养的黑素细胞、成纤维细胞和角质形成细胞以5x103 - 5x105个细胞/cm2的密度接种在孵化过的不对称膜上，同时加入1_10毫升的细胞培养液，置于细胞培养箱于37°C、体积浓度为5%的CO2、饱和湿度条件下培养，每两天更换一次细胞培养液，培养时间为ι-?ο天，即获得细胞-不对称膜的复合材料。[0008]一种基于不对称膜的黑素细胞的培养方法，包括以下步骤: (O制备不对称的生物膜材料:1:50-50:1的重量比例混合后，配成质量浓度为1-10%的水溶液；将溶液注入细胞培养板，-60- _40°C冷冻干燥8-24小时，得到多孔支架；再将上述溶液注入细胞培养板，将多孔支架完全铺展置于溶液上，鼓风条件下于30-70° C烘0.1-5小时，使水分完全挥发，形成不对称膜；然后用交联剂对不对称膜在20-50°C交联处理0.5-24小时，交联处理后用纯净水冲洗除净残留的交联剂；然后0.01-0.3摩尔/升的氢氧化钠、碳酸钠或重量比例为3:1-1:3的氢氧化钠-碳酸钠水溶液浸泡24小时，用去离子水清洗至溶液PH为中性；再在鼓风条件下于30-120°C下烘2-48小时。[0009](2)构建细胞-不对称膜复合材料:不对称膜用于接种细胞前，用体积浓度为75%的酒精浸泡12小时，随后再用PBS洗净残留酒精，并置于紫外灯下照射3-24小时。完成消毒灭菌后，在细胞培养板里注入细胞培养液，置于细胞培养箱中于37°C、体积浓度为5%C02、饱和湿度条件进行孵化。将按1-40: 0-200: 0-100的细胞个数比例共培养的黑素细胞、成纤维细胞和角质形成细胞以5x103 - 5x105个细胞/cm2的密度接种在孵化过的不对称膜上，同时加入1-10毫升的细胞培养液，置于细胞培养箱于37°C、体积浓度为5%C02、饱和湿度条件下培养，每两天更换一次细胞培养液，培养时间为ι-?ο天，即获得细胞-不对称膜的复合材料。[0010]3、根据权利要求1和2所述的基于不对称膜的人体黑素细胞培养方法，其特征在于，所述的生物相容性材料包括壳聚糖、明胶、胶原蛋白、纤维蛋白、透明质酸、硫酸软骨素、
聚乙二醇等。
[0011]所述的生物相容性材料包括壳聚糖、明胶、胶原蛋白、纤维蛋白、透明质酸、硫酸软
骨素、聚乙二醇等。
[0012]所述的交联剂包括用于物理交联的硫酸钠、柠檬酸钠或三聚磷酸钠及用于化学交联的戊二醛、乙二醛、水杨醛或香草醛等。
[0013]所述细胞培养液含100毫升F12培养基、0.1-100毫升FBS、10-50000纳克CT、10-50000 微克 ΙΒΜΧ、0.1-100 毫升 Glutamine 和 100-500000 微克 Gentamicin 等成分。
[0014]本发明的有益效果是:通过对所得的生物相容性不对称膜进行表征，膜表面平整(图1)，适合细胞生长；多孔结构(图2)有益于细胞培养过程中的营养液储存与更新，促进了细胞的生长及活性的保持。载体材料的具有良好的机械性能，包括抗拉强度、抗撕强度、断裂伸长率和弹性模量等，在制备、负载、转移和移植过程不发生破碎和断裂，符合转移和移植的要求。细胞-不对称膜复合材料的构建过程中，细胞在生物相容性不对称膜材料上的形态良好，增殖趋势明显且保持良好活性(图4)。本发明中生物相容性不对称膜材料制备方法简单、操作容易、抗破损、撕裂和转移等性能优良，通过调节细胞的接种密度、培养时间和方法，保持细胞活性，同时满足不同个体对皮肤颜色的需求，适合色素脱失症和皮肤颜色的调节。



[0015]图1不对称膜致密层SEM扫描电镜照片；
图2不对称膜疏松多孔层SEM扫描电镜照片；
图3不对称膜截面SEM扫描电镜照片；
图4用不对称膜培养的黑素细胞照片。

[0016]本发明属生物医学领域，利用组织工程技术构建具有良好生物相容性不对称膜材料，用于黑素细胞或其与成纤维细胞、角质形成细胞的(共)培养，实现细胞的体外培养。具体涉及具有生物相容性不对称膜材料的制备、细胞-不对称膜复合材料的构建及其应用，满足色素脱失症(如白癜风)和皮肤颜色调节的要求。
[0017]本发明选用生物相容性良好的不对称膜材料，负载材料制备条件温和，易于细胞的培养及细胞活性的保持，生物安全。同时,本发明可在细胞培养板上直接构建载体材料，避免对载体材料再打孔、剪裁等繁琐的后处理及二次污染问题。经交联处理的载体材料，具有优越的机械性能，满足可直接从细胞培养板中取出用于细胞转移和移植的要求。此外，本发明通过调节细胞的接种密度、培养时间和培养方法，保持细胞活性，实现对不同个体皮肤颜色的调控，使黑素细胞的功效性在移植中得到成功的表达，具有实际的可操作性，为大面积色素脱失症和皮肤颜色的调节提供了极大的便利。
[0018]本发明的基于组织工程材料的细胞培养方法，包括以下步骤:
Cl)制备不对称的生物膜材料:将一种或两种生物相容性材料按1:50-50:1的重量比例混合后，配成质量浓度为1-10%的水溶液；将水溶液注入细胞培养板，鼓风条件下于30-70° C下烘0.1-5小时，使溶液表面水分挥发，形成1-10微米的致密膜；然后加入氢氧化钠-碳酸钠水溶液，浸泡24小时，使致密膜下层溶液发生相分离，形成多孔结构，所述氢氧化钠-碳酸钠水溶液中，氢氧化钠和碳酸钠的总质量与水的质量配比为1-10:90-99混合组成，且氢氧化钠与碳酸钠的质量配比为1:3-3:1 ;用去离子水清洗至溶液pH为中性，-6(T-40°C冷冻干燥8-24小时，得到不对称膜；然后用交联剂对不对称膜在20-50°C交联处理0.5-24小时，交联处理后用纯净水冲洗除净残留的交联剂，再在鼓风条件下于30-120°C 下烘 2-48 小时。
[0019](2)构建细胞-不对称膜复合材料:不对称膜用于接种细胞前，用体积浓度为75%的酒精浸泡12小时，随后再用PBS洗净残留酒精，并置于紫外灯下照射3-24小时。完成消毒灭菌后，在细胞培养板里注入细胞培养液，置于细胞培养箱中于37°C、体积浓度为5%的CO2、饱和湿度条件进行孵化。将按1-40: 0-200: 0-100的细胞个数比例共培养的黑素细
胞、 成纤维细胞和角质形成细胞以SxUf-SxWi个细胞/cm2的密度接种在孵化过的不对称膜上，同时加入1-10毫升的细胞培养液，置于细胞培养箱于37°c、体积浓度为5%的C02、饱和湿度条件下培养，每两天更换一次细胞培养液，培养时间为1-10天，即获得细胞-不对称膜的复合材料。
[0020]本发明还提供了另一种基于不对称膜的黑素细胞的培养方法，包括以下步骤:
(O制备不对称的生物膜材料:1:50-50:1的重量比例混合后，配成质量浓度为1-10%
的水溶液；将溶液注入细胞培养板，-60- _40°C冷冻干燥8-24小时，得到多孔支架；再将上述溶液注入细胞培养板，将多孔支架完全铺展置于溶液上，鼓风条件下于30-70° C烘
0.1-5小时，使水分完全挥发，形成不对称膜；然后用交联剂对不对称膜在20-50°C交联处理0.5-24小时，交联处理后用纯净水冲洗除净残留的交联剂；然后0.01-0.3摩尔/升的氢氧化钠、碳酸钠或重量比例为3:1-1:3的氢氧化钠-碳酸钠水溶液浸泡24小时，用去离子水清洗至溶液PH为中性；再在鼓风条件下于30-120°C下烘2-48小时。
[0021](2)构建细胞-不对称膜复合材料:不对称膜用于接种细胞前，用体积浓度为75%的酒精浸泡12小时，随后再用PBS洗净残留酒精，并置于紫外灯下照射3-24小时。完成消毒灭菌后，在细胞培养板里注入细胞培养液，置于细胞培养箱中于37°C、体积浓度为5%的CO2、饱和湿度条件进行孵化。将按1-40: 0-200: 0-100的细胞个数比例共培养的黑素细
胞、成纤维细胞和角质形成细胞以5xl0s-5x〗05个细胞/cm2的密度接种在孵化过的不对称膜上，同时加入1-10毫升的细胞培养液，置于细胞培养箱于37°c、体积浓度为5%的C02、饱和湿度条件下培养，每两天更换一次细胞培养液，培养时间为1-10天，即获得细胞-不对称膜的复合材料。
[0022]所述的生物相容性材料包括壳聚糖、明胶、胶原蛋白、纤维蛋白、透明质酸、硫酸软
骨素、聚乙二醇等。
[0023]生物相容性材料包括壳聚糖、明胶、胶原蛋白、纤维蛋白、透明质酸、硫酸软骨素、
聚乙二醇等。
[0024]交联剂包括用于物理交联的硫酸钠、柠檬酸钠或三聚磷酸钠及用于化学交联的戊
二醛、乙二醛、水杨醛或香草醛等。
[0025]细胞培养液含100毫升F12培养基、0.1-100毫升FBS (胎牛血清)、10-50000纳克CT (霍乱毒素)、 10-50000微克IBMX (异丁酰甲基黄嘌呤)、0.1-100毫升Glutamine (谷氨酰胺)和100-500000微克Gentamicin (庆大霉素)等成分。
[0026]下面根据实施例详细描述本发明，本发明的目的和效果将变得更加明显。
[0027]实施例1.壳聚糖不对称膜材料的制备
a、将壳聚糖用IM的乙酸溶液溶解，配成浓度为1.5 %的壳聚糖溶液；
b、将2.5ml壳聚糖溶液注入细胞培养板，将细胞培养板置于鼓风烘箱中，于65° C下干燥0.5小时；
C、加入氢氧化钠、碳酸钠和水以重量比例为2:1:47的氢氧化钠-碳酸钠水溶液,浸泡24小时，使致密膜下层溶液发生相分离，形成多孔结构；
d、用去离子水清洗至溶液pH为中性；
e、-55°C冷冻干燥12小时，得到不对称膜；
f、将干燥的壳聚糖不对称膜置于0.5M的Na2SO4溶液中浸泡30min，随后用大量纯净水冲洗；
g、将覆盖壳聚不对称膜的细胞培养板置于鼓风烘箱中，37°C条件下干燥24小时；h、得到可用于细胞培养的不对称膜材料。
[0028]实施例2.壳聚糖-明胶基复合不对称膜材料的制备
a、将壳聚糖用IM的乙酸溶液溶解，配成浓度为1.5 %的壳聚糖溶液；
b、将明胶用纯净水溶解,配成浓度为1%的明胶溶液；
C、将壳聚糖与明胶以20:1的重量比例混合，搅拌均匀，得到壳聚糖-明胶混合溶液；
d、将2.5 ml混合溶液注入细胞培养板，将细胞培养板置于鼓风烘箱中，于35° C条件下干燥4小时；
e、加入氢氧化钠、碳酸钠和水以重量比例为2:1:47的氢氧化钠-碳酸钠水溶液,浸泡24小时，使致密膜下层溶液发生相分离，形成多孔结构；
f、用去离子水清洗至溶液PH为中性；
g、-45°C冷冻干燥24小时，得到不对称膜；
h、将干燥的壳聚糖-明胶不对称膜置于0.5M的柠檬酸钠溶液中浸泡2h，随后用大量纯净水冲洗；
1、将覆盖壳聚糖-明胶不对称膜的细胞培养板置于鼓风烘箱中，80°C条件下干燥24小时；
j、得到可用于细胞培养的不对称膜材料。
[0029]实施例3.壳聚糖-聚乙二醇基复合不对称膜材料的制备
a、将壳聚糖用IM的乙酸溶液溶解，配成浓度为1.5 %的壳聚糖溶液；
b、将聚乙二醇用纯净水溶解，配成浓度为1%的聚乙二醇溶液；
C、将壳聚糖与聚乙二醇以20:1的重量比例混合，搅拌均匀，得到壳聚糖-聚乙二醇混合溶液；
d、将2.5 ml混合溶液注入细胞培养板，将细胞培养板置于鼓风烘箱中，于35° C条件下干燥4小时；
e、加入氢氧化钠、碳酸钠和水以重量比例为2:1:47的氢氧化钠-碳酸钠水溶液,浸泡24小时，使致密膜下层溶液发生相分离，形成多孔结构；
f、用去离子水清洗至溶液pH为中性；
g、-45°C冷冻干燥24小时，得到不对称膜；
h、将干燥的壳聚糖-聚乙二醇不对称膜置于0.5M的柠檬酸钠溶液中浸泡2h，随后用大量纯净水冲洗；
1、将覆盖壳聚糖-聚乙二醇不对称膜的细胞培养板置于鼓风烘箱中，80°C条件下干燥24小时；
j、得到可用于细胞培养的不对称膜材料。
[0030]实施例4.壳聚糖不对称膜材料的制备
a、将壳聚糖用IM的乙酸溶液溶解，配成浓度为1.5 %的壳聚糖溶液；
b、将2.5ml溶液注入细胞培养板，-45° C冷冻干燥18小时，得到多孔支架；
C、将上述溶液注入细胞培养板，将多孔支架完全铺展置于溶液上，鼓风条件下于60°C烘0.5小时，使水分完全挥发，形成不对称膜；
d、将干燥的壳聚糖不对称膜置于0.5M的Na2SO4溶液中浸泡30 min,随后用大量纯净水冲洗；e、用0.1 M的NaOH溶液浸泡壳聚糖不对称膜30 min以除去膜上残留的乙酸，再用大量纯净水冲至PH=7.2-7.4 ；
f、将覆盖壳聚糖不对称膜的细胞培养板置于鼓风烘箱中，50°C干燥36小时；
g、得到可用于细胞培养的不对称膜材料。
[0031]实施例5.壳聚糖-明胶不对称膜材料的制备
a、将壳聚糖用IM的乙酸溶液溶解，配成浓度为1.5 %的壳聚糖溶液；
b、将明胶用IM的乙酸溶液溶解，配成浓度为I%的明胶溶液；
C、将壳聚糖与明胶以5:1的重量比例混合，搅拌均匀，得到壳聚糖-明胶混合溶液；
e、将2.5ml溶液注入细胞培养板，-45° C冷冻干燥18小时，得到多孔支架；
f、将上述溶液注入细胞培养板，将多孔支架完全铺展置于溶液上，鼓风条件下于60°C烘0.5小时 ，使水分完全挥发，形成不对称膜；
g、将干燥的壳聚糖-明胶不对称膜置于0.5M的Na2SO4溶液中浸泡2小时，随后用大量纯净水冲洗；
h、用0.1 M的Na2CO3溶液浸泡壳聚糖-明胶不对称膜30 min以除去膜上残留的乙酸，再用大量纯净水冲至PH=7.2-7.4 ；
1、将覆盖壳聚糖-明胶不对称膜的细胞培养板置于鼓风烘箱中，50°C干燥36小时； j、得到可用于细胞培养的不对称膜材料。
[0032]实施例6.壳聚糖-聚乙二醇不对称膜材料的制备
a、将壳聚糖用IM的乙酸溶液溶解，配成浓度为1.5 %的壳聚糖溶液；
b、将聚乙二醇用IM的乙酸溶液溶解，配成浓度为I%的聚乙二醇溶液；
C、将壳聚糖与明胶以10:1的重量比例混合，搅拌均匀，得到壳聚糖-聚乙二醇混合溶
液；
d、将2.5ml溶液注入细胞培养板，-45° C冷冻干燥18小时，得到多孔支架；
e、将上述溶液注入细胞培养板，将多孔支架完全铺展置于溶液上，鼓风条件下于60°C烘0.5小时，使水分完全挥发，形成不对称膜；
f、将干燥的壳聚糖-聚乙二醇不对称膜置于0.5M的Na2SO4溶液中浸泡30 min,随后用大量纯净水冲洗；
g、用0.1 M的Na2CO3溶液浸泡壳聚糖-聚乙二醇不对称膜30 min以除去膜上残留的乙酸，再用大量纯净水冲至PH=7.2-7.4 ；
h、将覆盖壳聚糖-聚乙二醇不对称膜的细胞培养板置于鼓风烘箱中，50°C干燥36小
时；
1、得到可用于细胞培养的不对称膜材料。
[0033]实施例7.黑素细胞-壳聚糖不对称膜复合材料的构建
a、将实例I所述的壳聚糖不对称膜置于75%的医用消毒酒精中浸泡12小时后用PBS冲洗干净；
b、将覆盖壳聚糖不对称膜的细胞培养板置于紫外灯下照射6小时；
C、在细胞培养板里注入3毫升细胞培养液，置于细胞培养箱于37°C、体积分数为5%的CO2、饱和湿度下孵化4小时；
d、将黑素细胞以5x103-5x103个细胞/cm2的密度接种在壳聚糖不对称膜上，置于细胞培养箱于37°C、5% (体积)CO2、饱和湿度下培养；
e、每两天换一次细胞培养液，培养时间为6天；
f、得到黑素细胞-壳聚糖不对称复合材料，可进一步用于的移植。
[0034]实施例8.黑素细胞/成纤维细胞-壳聚糖-明胶不对称膜复合材料的构建
a、将实例2所述的壳聚糖-明胶复合不对称膜置于75%的医用消毒酒精中浸泡12小时后用PBS冲洗干净；
b、将覆盖壳聚糖-透明质酸复合膜的细胞培养板置于紫外灯下照射10小时；
C、在细胞培养板里注入3毫升细胞培养液，置于细胞培养箱于37°C、体积分数为5%的CO2、饱和湿度下孵化4小时；
d、将黑素细胞和成纤维细胞以比例为1:2，密度为5xIO3- 5XlO5个细胞/cm2接种在壳聚糖-明胶不对称膜上，置于细胞培养箱于37°C、5% (体积)CO2、饱和湿度下培养； e、每两天换一次细胞培养液，培养时间为5天；
f、得到黑素细胞-壳聚糖-明胶不对称膜复合材料，可进一步用于的移植。
[0035]实施例9.黑素细胞/成纤维细胞/角质形成细胞-壳聚糖-聚乙二醇不对称膜复合材料的构建
a、将实例3所述的壳聚糖-聚乙二醇不对称膜置于体积分数为75%的酒精中浸泡12小时后，用PBS冲洗干净；
b、将覆盖壳聚糖-聚乙二醇不对称膜的细胞培养板置于紫外灯下照射12小时；
C、在细胞培养板里注入3毫升细胞培养液，置于细胞培养箱于37°C、5% (体积)CO2、饱和湿度下孵化4小时；
d、将黑素细胞、成纤维细胞、角质形成细胞比例以1:2:1，密度为5乂103-5乂105个细胞/cm2接种在壳聚糖-聚乙二醇不对称膜上，置于细胞培养箱于37°C、体积分数为5%的C02、饱和湿度下培养；
e、每两天换一次细胞培养液，培养时间为8天；
f、得到黑素细胞-壳聚糖-聚乙二醇不对称膜复合材料，可进一步用于的移植。