专利名称：促黑素细胞激素抑制剂的制作方法(技术领域)本发明涉及具有促黑素细胞激素抑制能力的新型肽衍生物，促黑素细胞激素抑制剂，以及含有该抑制剂的美白剂、免疫机能调节剂、食欲调节剂、化妆品和皮肤外用剂。(背景技术)促黑素细胞激素与人和动物的皮肤、毛的颜色有关。我们知道人皮肤的变黑就是与该物质有关(例如，Nature(1961)189，176-179)。有报道认为其作用与促黑素细胞激素促进黑素细胞增殖、激活黑色素的生物合成酶-酪氨酸酶有关(Proc.Natl.Acad.Sci.(1995)92，1789-1793)；另一方面，人们已知促黑素细胞激素促进产生皮肤表皮细胞，其产生量随紫外线照射而增加(ACTH Relat.Pept.(1995)6，63-68)。因此，可以认为促黑素细胞激素是因紫外线照射导致日晒后色素沉积的重要原因。促黑素细胞激素除上述作用外，已知还有抑制巨噬细胞产生一氧化氮作用(Immunology Today(1997)18，140-145)、抑制IL-10介导的免疫作用及食欲调节作用(Am.J.Physio1.274Endocrinol.Metab.37(1998)E627-E633)。根据上述情况，如果能抑制促黑素细胞激素的生成或抑制其作用，则可以防止因紫外线作用引起的色素沉积，还可以预防、改善及治疗免疫异常或免疫功能缺陷症，或者通过调节食欲来控制体重。原先，作为促黑素细胞激素抑制剂，已知有His-D-Arg-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2(Peptides(1994)15，627-632)和D-Trp-Arg-Leu-NH2(Proc.Natl.Acad.Sci.(1995)92，2894-2898)等。但是，所有这些抑制剂的肽链中都含有色氨酸这种不稳定氨基酸，不利于保存。另外，人们知道爬虫类皮肤和两栖类动物的色素细胞会脱色；但作为人皮肤色素沉积原因的黑色素生成及酪氨酸酶的促黑素细胞激素活化是否有抑制作用，目前还未探明。我们知道其他促黑素细胞激素抑制剂，如アグウチタンパク质或其肽片段有抑制色素沉积作用(WO 97/00892)，但存在既不易制备又不易保存的问题。从细胞水平评价促黑素细胞激素抑制剂具有使色素细胞脱色的效果，其在实际的生物体使用时，有抑制色素沉积效果，或者，预防、改善、和治疗免疫异常及免疫缺陷症效果，或者，通过调节食欲来控制体重的功能的效果，其效果差，或效果的出现需要时间，这都是问题。(发明的公开)根据上述技术背景来看，本发明的第一课题是提供容易制备、保存稳定性优良的具有抑制促黑素细胞激素作用，进而防止色素沉积，或者，预防、改善或治疗免疫异常症及免疫缺陷症，或者，通过调节食欲，控制体重，并且可以用作化妆品、皮肤外用剂的新型肽衍生物。本发明的第二课题是提供适用于实际生物体且效果显著的具有色素沉积抑制效果，或者，有效预防、改善或治疗免疫异常症、免疫缺陷症，调节食欲，控制体重，并且可以用作化妆品、皮肤外用剂的促黑素细胞激素抑制剂。本发明者们通过对第一课题的锐意研究发现，采用以下述通式(1)表示的新型肽衍生物及其盐，可以解决上述第一课题，根据该发现，完成本发明。即，本发明涉及含萘基的二或三肽衍生物或其盐，其特征是以下列通式(1)表示。 (式中，Ar为可以有取代基的萘基；R1、R2及R3分别为独立的氢原子，或可以有取代基的碳原子数1～6的直链或支链烷基；R4是氢原子，可以有取代基的氨基酸侧链、氨基、脒基、胍基、碳原子数1～6的直链或支链氨基烷基、碳原子数1～6的直链或支链脒烷基、碳原子数1～6个的直链或支链胍基烷基、及碳原子数6～12的脒基芳基；X1，可以不存在，也可以代表碳原子数1～6个的亚烷基，含碳原子数1～6个直链或支链烷基作为取代基的碳原子数1～6的氨基亚烷基，或碳原子数1～6个的直链或支链氧代亚烷基，X2可以不存在，也可以代表碳原子数1～6个的直链或支链亚烷基；R6为氢原子或-NHY，Y是氢原子、碳原子数2～22个的酰基、碳原子数1～22个的烷基、碳原子数1～22个的羟基烷基、或含碳原子数1～22个烷氧基的3-烷氧基-2-羟丙基。n为0或1的整数，而R5为用下述通式(2)表示的基团 式中，X3表示是-O-或-NR10-；X4表示为-O-或-NR11-；R7表示氢原子、氨基酸侧链或碳原子数1～6个的直链或支链烷基；R8、R10及R11分别独立为氢原子，或碳原子数1～6个的直链或支链烷基；R9表示氢原子、碳原子数1～22的羟基烷基、含有取代基是碳原子数1～22烷氧基的3-烷氧基-2-羟丙基。m为0或1的整数。)上述式(1)表示的肽衍生物是文献未收载的新型化合物。
本发明者在对第二课题进行悉心研究后发现，在实际应用于生物体时，具有显著的色素沉着抑制剂等效果，得到一定的能阻碍cAMP产生作用的可抑制促黑素细胞激素作用的化合物，解决上述第二课题，完成本发明。这类化合物并不局限于以上述通式(1)表示的肽衍生物及其盐。
即，本发明涉及抑制cAMP产生50％浓度(IC50)在100nM以下的有抑制促黑素细胞激素能力化合物作为有效成分的促黑素细胞激素抑制剂。
另外，本发明涉及一种促黑素细胞激素抑制剂，其特征在于包括选自上述通式(1)表示的肽衍生物及其盐中的至少选一种作为有效成分。本发明涉及上述这类促黑素细胞激素抑制剂及含有至少一种抑制cAMP产生50％浓度在100nM以下的具有抑制促黑素细胞激素能力的化合物作为有效成分的美白剂、免疫机能调节剂、食欲调节剂、化妆品及皮肤外用剂。
以下，就本发明作详细说明。
通式(1)表示肽衍生物及其盐，R6的定义同前，当其为NHY时，Y的具体例子可以举出，例如，氢原子、乙酰基、丙酰基、异丙酰基、正丁酰基、异丁酰基、仲丁酰基、叔丁酰基、正戊酰基、仲戊酰基、叔戊酰基、异戊酰基、正己酰基、环己酰基、正庚酰基、正辛酰基、2-乙基己酰基、壬酰基、异壬酰基、癸酰基、异癸酰基、十一烷酰基、月桂酰基、十三烷酰基、异十三烷酰基、肉豆蔻酰基、棕榈酰基、异棕榈酰基、硬脂酰基、异硬脂酰基、油酰基、二十二烷酰基、甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、仲戊基、叔戊基、异戊基、正己基、环己基、正庚基、正辛基、2-乙基己基、壬基、异壬基、癸基、异癸基、十一烷基、月桂烷基、十三烷基、异十三烷基、肉豆蔻烷基、十六烷基、异十六烷基、十八碳酰基、异十八碳酰基、油烯基、二十二烷基、2-羟乙基、2-羟丙基、2-羟异丙基、2-羟正丁基、2-羟异丁基、2-羟仲丁基、2-羟叔丁基、2-羟正戊基、2-羟仲戊基、2-羟叔戊基、2-羟异戊基、2-羟正己基、2-羟环己基、2-羟正庚基、2-羟正辛基、2-羟基-2-乙基己基、2-羟基壬基、2-羟基异壬基、2-羟基癸基、2-羟基异癸基、2-羟基十一烷基、2-羟基月桂烷基、2-羟基十三烷基、2-羟基异十三烷基、2-羟基肉豆蔻烷基、2-羟基十六烷基、2-羟基异十六烷基、2-羟基十八碳酰基、2-羟基异十八碳酰基、2-羟基油烯基、2-羟基二十二烷基、3-甲氧基-2-羟丙基、3-乙氧基-2-羟丙基、3-丙氧基-2-羟丙基、3-异丙氧基-2-羟丙基、3-正丁氧基-2-羟丙基、3-异丁氧基-2-羟丙基、3-仲丁氧基-2-羟丙基、3-叔丁氧基-2-羟丙基、3-正戊氧基-2-羟丙基、3-仲戊氧基-2-羟丙基、3-叔戊氧基-2-羟丙基、3-异戊氧基-2-羟丙基、3-正己氧基-2-羟丙基、3-环己氧基-2-羟丙基、3-正庚氧基-2羟丙基、3-正辛氧基-2-羟丙基、3-(2-乙基己基)氧代-2-羟丙基、3-壬氧基-2-羟丙基、3-异壬氧基-2-羟丙基、3-癸氧基-2-羟丙基、3-异癸氧基-2-羟丙基、3-十一烷氧基-2-羟丙基、3-月桂氧基-2-羟丙基、3-十三烷氧基-2-羟丙基、3-异十三烷氧基-2-羟丙基、3-十四烷氧基-2-羟丙基、3-十六烷氧基-2-羟丙基、3-异十六烷氧基-2-羟丙基、3-硬脂酰氧基-2-羟丙基、3-异硬脂酰氧基-2-羟丙基、3-油烯氧基-2-羟丙基、3-二十二烷氧基-2-羟丙基等。
前述定义的Ar与X1的结合位置没有限定，可任意选择。因此，与这些基的芳香环结合的氢原子可以被一个或多个卤原子、碳原子数1～6个的烷基、羟基、碳原子数1～6的羟烷基、硝基、碳原子数1～6的烷氧基或羧基、或磺酸基取代。当氢原子被多个基团取代时，这多个取代基可以相同也可以不同。
作为Ar母体骨架，可以是1-萘基，或2-萘基。
对前面定义的R4具体举例如下谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、同型半胱氨酸等酸性氨基酸丙氨酸、β-丙氨酸、2-氨基丁酸、缬氨酸、戊氨酸、亮氨酸、己氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、苯基甘氨酸、苏氨酸、丝氨酸、高丝氨酸、酪氨酸、多巴、半胱氨酸、蛋氨酸、谷氨酸、天冬氨酸等中性氨基酸；赖氨酸、同型赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸、同型精氨酸、组氨酸等碱性氨基酸的侧链(从氨基酸除去C(COOH)NH2后的剩余基团)；也可以是氢原子。其中，碱性氨基酸的侧为更优选的。除氨基酸侧链外，还可以举出含脒基的脒乙基、脒丙基、脒丁基、脒戊基、脒己基、脒苯基等。
就上述通式(2)中定义的R7具体举例如下例如，谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、同型半胱氨酸等酸性氨基酸；丙氨酸、β-丙氨酸、2-氨基丁酸、缬氨酸、戊氨酸、亮氨酸、己氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、苯基甘氨酸、色氨酸、苏氨酸、丝氨酸、高丝氨酸、酪氨酸、多巴、半胱氨酸、蛋氨酸、谷氨酸、天冬氨酸等中性氨基酸；赖氨酸、同型赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸、同型精氨酸、组氨酸等碱性氨基酸的侧链；或者氢原子。其中，含有疏水性侧链的中性氨基酸侧链是更优选的。
对前面定义的R9具体举例如下例如，氢原子、甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、仲戊基、叔戊基、异戊基、正己基、环己基、正庚基、正辛基、2-乙基己基、壬基、异壬基、癸基、异癸基、十一烷基、月桂基、十三烷基、异十三烷基、肉豆蔻烷基、十六烷基、异十六烷基、十八碳酰基、异十八碳酰基、油烯基、二十二烷基、2-羟乙基、2-羟丙基、2-羟异丙基、2-羟正丁基、2-羟异丁基、2-羟仲丁基、2-羟叔丁基、2-羟正戊基、2-羟仲戊基、2-羟叔戊基、2-羟异戊基、2-羟正己基、2-羟环己基、2-羟正庚基、2-羟正辛基、2-羟基-2-乙基己基、2-羟基壬基、2-羟基异壬基、2-羟基癸基、2-羟基异癸基、2-羟基十一烷基、2-羟基月桂基、2-羟基十三烷基、2-羟基异十三烷基、2-羟基肉豆蔻烷基、2-羟基十六烷基、2-羟基异十六烷基、2-羟基十八碳酰基、2-羟基异十八碳酰基、2-羟基油烯基、2-羟基二十二烷基、3-甲氧基-2-羟丙基、3-乙氧基-2-羟丙基、3-丙氧基-2-羟丙基、3-异丙氧基-2-羟丙基、3-正丁氧基-2-羟丙基、3-异丁氧基-2-羟丙基、3-仲丁氧基-2-羟丙基、3-叔丁氧基-2-羟丙基、3-正戊氧基-2-羟丙基、3-仲戊氧基-2-羟丙基、3-叔戊氧基-2-羟丙基、3-异戊氧基-2-羟丙基、3-正己氧基-2-羟丙基、3-环己氧基-2-羟丙基、3-正庚氧基-2羟丙基、3-正辛氧基-2-羟丙基、3-(2-乙基己基)氧代-2-羟丙基、3-壬氧基-2-羟丙基、3-异壬氧基-2-羟丙基、3-癸氧基-2-羟丙基、3-异癸氧基-2-羟丙基、3-月桂氧基-2-羟丙基、3-十三烷氧基-2-羟丙基、3-异十三烷氧基-2-羟丙基3-十四烷氧基-2-羟丙基、3-十六烷氧基-2-羟丙基、3-异十六烷氧基-2-羟丙基、3-十八酰氧基-2-羟丙基、3-异十八酰氧基-2-羟丙基、3-油烯氧基-2-羟丙基、3-二十二烷氧基-2-羟丙基等。
上述通式(1)表示的肽衍生物的各氨基酸剩余基团可以是光学异物体也可以是消旋体。
上述通式(1)表示的化合物的盐具体举例如下钠、钾等碱金属盐；镁、钙等碱土金属盐；氨等无机盐；乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、2-氨基-2-甲基-1-丙醇、2-氨基-2-甲基-1，3-丙二醇、赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸等有机胺盐；氯、溴、碘等卤素盐，盐酸盐，硫酸盐，碳酸盐，磷酸盐等无机酸盐；醋酸盐，三氟醋酸盐，柠檬酸盐，对甲苯磺酸盐，羟基乙酸盐，苹果酸盐，乳酸盐，脂肪酸盐，酸性氨基酸盐，焦谷氨酸盐等有机酸盐等，这些都是生理学上允许使用的盐。这些盐也可以两种以上组合使用。
本发明中以上述通式(1)表示的肽衍生物可按下述方法合成。
首先，被保护的碱性氨基酸与羧基酰氨化中性氨基酸在二氯甲烷中经水溶性碳化二亚氨缩合后，经酸处理等仅除去主链保护基而得到保护二肽。其次，该保护二肽与侧链含萘甲基等芳基的N末端保护氨基酸衍生物在二氯甲烷中经水溶性碳化二亚氨缩合后，得到保护三肽，该保护三肽在钯-炭催化剂下经还原等过程除去保护基，得所需肽衍生物。另外，只脱去N末端保护的保护三肽在酸酐、酰氯、卤代烷基、环氧链烃或烷烃缩水甘油醚中反应后再于钯-炭催化剂中还原脱保护等，即得N末端酰化、烷基化、羟烷基化及3-烷氧基-2-羟丙基化的各类衍生物。
另外，用苄基保护羧基的中性氨基酸代替羧基酰氨化的中性氨基酸，按上述操作同样可得保护三肽，经接触还原，可得C末端是羧酸的三肽。其次，碱性氨基酸侧链保护基、羧基保护基(苄基)被除去以前，同理使N末端氨基酰胺化、烷基化、羟烷基化、或3-烷氧基-2-羟丙基化后经接触还原可得各类衍生物。这些肽衍生物进一步与醇在酸催化剂下脱水缩合可得各类C末端羧酸酯衍生物。
主链的氨基和碱性氨基酸侧链被保护、C末端为羧酸的三肽与烷基氨脱水缩合反应，或者再与还氧链烃或烷缩水甘油醚发生加成反应后，同样地经接触还原，得C末端羧基被酯化或酰胺化的衍生物。
具有促黑素细胞激素抑制功能的化合物的本发明所述的抑制cAMP产生50％的浓度IC50，按以下方法测定和定义。
即，将B16黑色素瘤细胞在12孔平板上按每孔1×104cells接种。37℃，5％CO2下培养48小时。培养后，每孔用1ml无血清培养基(不含血清的D-MEM培养基)清洗后，再按每孔1mL分别添加1mM3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、10nM促黑素细胞激素及含有各种浓度被检化合物的无血清培养基，37℃下恒温培养5分钟。之后，将培养基从平板上全部除去，往里正确添加经水冷却的2.5％的高氯酸1ml，原样于冰冷却下恒温培养30分钟，萃取细胞内的cAMP。培养后，每孔加入90ml 4.2M的氢氧化钾中和萃取液。
中和后的萃取液，4℃下以12,000rpm离心10分钟，上清夜中的cAMP量用Biotrak cAMP EIA System(アマシャムフアルマシア生物技术公司制造)用以下方法定量。全部操作在5℃以下进行。首先，配制0～3200fM的cAMP标准品，向96孔微孔平板中分别注入100μl。然后，向NSB小杯(Non-specific Binding Well)中注入0.05M醋酸缓冲液(pH5.8、0.02％血清、含有0.01％防腐剂)200μl，向空白杯中注入100μl。样品杯中注入样品100μl。除NSB杯和空白杯外，其余杯中加抗血清100μl。将96孔微孔平板盖好，轻微振荡，3～5℃下培养2小时。培养后，除空白杯外，其余杯加cAMP过氧化物酶50μl。加盖，于3～5℃下培养1小时后，所有杯用0.01M磷酸缓冲液(pH7.5，含有0.05％土温20)400μl冲洗4次。用平板将小杯口向下，用纸扣于杯口，将杯中残余液体除掉。
向所有杯中加入150μl的酶底物，15～30℃下振荡1小时，振荡后，分别向杯中加1M的硫酸100μl，于450nm处测吸光度，用cAMP标准品的吸光度作成标准曲线，定量样品的cAMP量。
用前面方法得到的10nM促黑素细胞激素，测定其抑制cAMP产生被检化合物50％的浓度，并用nM单位表示，该值被定义为cAMP产生50％的抑制浓度。
本发明的cAMP产生50％的抑制浓度(IC50)在100nM以下的促黑素细胞激素抑制化合物被用作美白剂，特别是对紫外线照射产生的色素沉积具有较好的抑制作用。
考虑到该化合物的经透皮吸收性、肠道吸收性、溶解性、制备的难易性，本发明的cAMP产生50％的抑制浓度(IC50)在100nM以下的促黑色细胞激素抑制化合物，优选的是分子量在800以下，更优选的分子量是200～600。
以上述通式(1)表示的肽衍生物及其盐作为有效成分的本发明的促黑素细胞激素抑制剂、美白剂、免疫机能调节剂、食欲调节剂、化妆品、皮肤外用剂等可制成适于口服或非口服品。在这种场合，通过使用cAMP产生50％抑制浓度(IC50)在100nM以下的有抑制促黑素细胞激素作用的化合物，具有显著效果。另外，在目的是用于皮肤时，可以配制直接涂抹的皮肤制剂，例如化妆品或皮肤外用剂配合本发明的肽及其盐中至少一种或cAMP产生50％抑制浓度(IC50)在100nM以下的具有抑制促黑素细胞激素作用的化合物而制成。
此时，从本发明的新型肽衍生物及其盐中选择的至少一种或cAMP产生50％抑制浓度(IC50)100nM以下的具有抑制促黑素细胞激素作用化合物在化妆品中的配合量通常占化妆品总量的0.01～10重量％，优选的是0.1～5重量％。在皮肤外用剂中该化合物的配合量通常在0.01～50重量％，优选的是0.1～20重量％。当不足0.1重量％时，效果发挥不好，超过50重量％时，会引起皮肤不适感。
用含有本发明肽及其盐中至少一种或抑制cAMP产生50％浓度(IC50)在100nM以下化合物配制化妆品或皮肤外用剂时，一般的作为化妆品或皮肤外用剂中使用的成分，在不影响本发明效果的范围内还可以添加。作为一般的在化妆品或皮肤外用剂中使用的成分，可以举出油性原料、表面活性剂、溶剂、保湿剂、高分子物质、粉末物质、色素类、香料及其他常用成分。
作为油性原料有动植物油等油脂类、羊毛脂等蜡类、石蜡等碳氢化合物、鲸蜡醇等高级醇、硬脂酸等高级脂肪酸、甾醇、卵磷脂等磷脂质类、肉豆蔻酸等合成酯类、金属皂、硅油等。
作为表面活性剂有阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性表面活性剂、非离子表面活性剂、乳化剂、增溶剂等。
作为溶剂有乙醇等低级醇、醚类、甘油类、液体非离子表面活性剂、液体油性原料及其他有机溶剂和水等。
作为保湿剂有甘油等多元醇、吡咯烷酮羧酸等有机酸盐类、尿素、透明质酸等粘多糖、脯氨酸等氨基酸盐类等。
作为高分子物质有胶原等天然高分子化合物、部分脱乙酰化甲壳质等半合成高分子化合物、羧甲基纤维素等合成高分子化合物等。
作为粉末物质有滑石等无机颜料、合成云母等功能性颜料、微粒子复合粉体(ハイブリッドフマインバウダ一)、二氧化钛被覆云母等珍珠光泽颜料、光致变色颜料、尼龙粉末等高分子粉末、Nε-月桂酰赖氨酸等有机粉末等等。
作为色素有法定焦油色素第一种、法定焦油色素第二种、法定焦油色素第三种、染发剂、天然色素、矿物性色素等。
作为香料有麝香等动物性香料、茉莉油等植物性香料、α-茉莉醛等合成香料、调和香料等。
在化妆品、皮肤外用剂中，其他的常用成分有防腐·杀菌剂、抗氧化剂、紫外线吸收剂、螯合剂、防褪色剂、缓冲剂、痤疮用药剂、去皮屑止痒剂、止汗抑臭剂、热伤用药剂、抗虱虫剂、角质软化剂、干皮症用药剂、抗病毒剂、经皮吸收促进剂、激素类、维生素类、氨基酸类·肽类、蛋白质类、收敛剂、抗炎剂、清凉·刺激剂、动植物提取成分、黑素合成抑制剂(美白剂)、抗菌素、抗真菌剂、生发剂等。
本发明的促黑素细胞激素抑制剂、美白剂、免疫机能调节剂、食欲调节剂、化妆品、及皮肤外用剂的剂型未作特别限制，可以是溶状、糊状、凝胶状、固体状、颗粒状、粉末状、胶囊状、气雾剂等。具体的如油、洗涤剂、雪花膏、乳液、凝胶胶、洗发剂、头发漂洗剂、头发调节剂、釉质、粉底、唇膏、香粉、粉底(パツク)、软膏、片剂、注射液、颗粒剂、胶囊、香水、粉、科露香水、牙膏、肥皂、气雾剂、洁面乳等剂型。
另外，本发明的促黑素细胞激素抑制剂、美白剂、免疫机能调节剂、食欲调节剂、化妆品及皮肤外用剂可用作皮肤防老化改善剂、防皮肤炎症改善剂、浴用剂、护发剂、皮肤美容剂、防晒剂、色素性干皮剂·防日光寻麻疹等防光过敏症改善剂、光变态防止改善剂、光免疫抑制的防止改善剂、或者，防外伤·冻疮·皱裂等肌肤皱裂改善剂。
本发明的促黑素细胞激素抑制剂或美白剂不但有防止、改善紫外线引起的色素沉积，还可用于肝性黄褐斑、雀斑和老年性色斑的预防及治疗。
本发明的促黑素细胞激素抑制剂可用于免疫异常、免疫缺陷等与促黑素细胞激素有关的各种疾病的预防、及治疗或者通过食欲调节来控制体重的药物。
(附图的简单说明)

图1是在生物体中促黑素细胞激素抑制实验的结果(实验例4)(实施发明的最佳方案)下面通过实施例更具体地说明本发明，但，本发明并非仅限于这些实施例。
以下实施例中，配合量％以重量％表示，萘基丙酰氨基或萘基丙氨酸用Nal表示。合成例1D-1-Nal-Arg-LeuNH2Boc-Arg(Z2)(5g、9.22mmol)溶解于75ml二氯甲烷中，在冰冷却下加入水溶性碳化二亚胺盐酸盐(1.77g、9.22mmol)HoBt(1-羟基苯并三唑，1.25g、9.22mmol)。然后，滴加LeuNH2盐酸盐及三乙胺(1.91g、18.9mmol)的二氯甲烷溶液75ml，10分钟滴完。滴完后，室温下反复搅拌一夜。将反应液减压浓缩后，往残渣添加醋酸乙酯，然后依次用5％柠檬酸、5％碳酸氢钠及饱和食盐水洗涤。再用硫酸镁干燥后，减压干燥得Boc-Arg(Z2)-LeuNH2(5.8g、8.86mmol)。
将得到的Boc-Arg(Z2)-LeuNH2(2g、3.1mmol)用三氟醋酸10ml处理，得Arg(Z2)-LeuNH2(1.28g、2.3mmol)。接着，将得到的Arg(Z2)-LeuNH2(1.28g、2.3mmol)和Z-D-1-Nal(0.803g、2.3mmol)同样操作缩合得Z-D-1-Nal-Arg(Z2)-LeuNH2(1.63g、1.84mmol)。将得到的Z-D-1-Nal-Arg(Z2)-LeuNH2(1.63g、1.84mmol)溶解在1000ml甲醇中，再用钯-炭催化剂还原，得到D-1-Nal-Arg-LeuNH2(0.80g、1.66mmol)。合成例2D-2-Nal-Arg-LeuNH2用Z-D-2-Nal代替Z-D-1-Nal，与合成例1一样，制得D-2-Nal-Arg-LeuNH2。合成例3L-1-Nal-Arg-LeuNH2除用Z-L-1-Nal代替Z-D-1-Nal外，与合成例1-样，得得L-1-Nal-Arg-LeuNH2。合成例4L-2-Nal-Arg-LeuNH2除用Z-L-2-Nal代替Z-D-1-Nal外，与合成例1-样，制得L-2-Nal-Arg-LeuNH2。
上述合成例所得化合物的质谱(ESI-MS)的结果示于下表1。
表1ESI质谱
试验例1cAMP产生50％抑制浓度(IC50)的测定按照前面所述的cAMP产生50％抑制浓度(IC50)测定方法，对下面表2所记载的药剂，即，D-1-Nal-Arg-LeuNH2、D-2-Nal-Arg-LeuNH2、L-1-Nal-Arg-LeuNH2和D-Trp-Arg-LeuNH2分别测定它们的IC50。
结果见表2，表2所示被检药剂具有有效抑制促黑素细胞激素的cAMP上升的作用。
表2促黑素细胞激素抑制试验
试验例2人黑素细胞的黑素生成抑制实验对数期的人黑素细胞经胰蛋白酶处理，在Medium 154s中(クラボウ制，有增殖因子(HMGS))，以1.5×105个接种到6孔平板。于37℃，5％CO2浓度的碳酸气体下恒温培养。1日后，用HBS(HepesBuffer Saline)冲洗培养基，并将培养基换成MCDB153(含有胎牛血清、胰岛素、b-FGF、转铁蛋白和生育酚)，继续培养2天。将美白剂(被检化合物)，用MCDB153和促黑素细胞激素调制使达到200μM、20μM、2μM浓度。另外，同时培养不含美白剂，只含MCDB153和促黑素细胞激素的6孔平板以及只含有MCDB153的6孔平板。2日2回，用含有上述美白剂的MCDB153(含有胎牛血清)交换培养基。
第1次添加美白剂后，在第6天进行黑素生成抑制效果的确认。即，将6孔平板中培养基吸掉，用HBS冲洗，之后风干，添加1/5M的NaOH 230μl将黑素细胞内黑素溶解。溶解液(200μl)用微孔平板测读器(475nm)测Abs吸光度。
被检化合物的黑素生成抑制率，按下式计算。结果见表3。黑素生成抑制率(％)＝{1-(A1-A3)/(A2-A3)}×100(1)A加有被检化合物和MSH的475nm处吸光度A不加被检化合物，加有MSH时的475nm处吸光度A不加被检化合物和MSH时的475nm处吸光度表3黑素生成抑制试验
表3所示，被检化合物通过添加促黑素细胞激素，上升的黑素细胞的黑素生成被有效抑制。因此，得知被检化合物对促黑素细胞激素诱发黑素生成有抑制作用。试验例3保存稳定性试验用本发明的D-2-Nal-Arg-LeuNH2和已知的促黑素细胞激素抑制剂D-Trp-Arg-LeuNH2，各配制0.1％水溶液，于4℃下保存6个月，着色程度用APHA(American Public Healthy Association)法的标准色进行比较，评价其保存稳定性。结果示于下表4。
表4保存稳定性
如表4所示，本发明的D-2-Nal-Arg-LeuNH2，其APHA值为20，几乎没有着色，与此相反，已知的MSH抑制剂D-Trp-Arg-LeuNH2其APHA值为200，着色严重。由此表明本发明的D-2-Nal-Arg-LeuNH2具有良好的稳定性。试验例4在生物体中的促黑素细胞激素抑制试验(褐色豚鼠色素沉淀抑制试验)以下内容是通过反复涂抹被检物质和紫外线照射，测定着色程度以进行促黑素细胞激素抑制试验。
1.被检化合物使用D-2-Nal-Arg-LeuNH2(溶解在50mM，50％乙醇水中)和D-Trp-Arg-LeuNH2(溶解在50mM，50％乙醇水中)，用50％乙醇水溶液作比较对照。
2.评价动物Weiser-Maples系褐色雄性豚鼠(4周龄)，以东京实验动物株式会社购入，预养7周备用。
3.褐色豚鼠的剃毛将褐色豚鼠在保定器内进行保定，其背部用理发推THRIVE MODEL6000AD(夏目制作所制作)、家用理发推ER722(National制)及电剃具DUALL500AC/RC(BRAUN制)剃出3cm×3cm的近似正方形的面积。剃后皮肤用沾水的脱脂棉擦拭，再用纸巾キムワイプ(クレシア制)将水分沾去。
4.胶带(剥取)在此，把胶带贴于皮肤表面，再将该粘胶带剥离时，使皮肤表面一部分角质层剥离，将此称为胶带剥取。
剃完毛的豚鼠背部皮肤用沾有乙醇的脱脂棉擦拭，再用胶胶带Scotch 313D(3M社制)粘取约2cm×2cm大面积的角质层5次，进行胶带剥取试验。1个月后再同样操作一次。
5.被检物质的涂抹进行胶带剥取试验后的第2天，按下述频率涂样品于皮肤评价部位。使用Pipetman(GILSON制)用吸液管尖将被检物质和对照品成放射状涂抹。
(1)紫外线照射期间前(胶带剥取后，5天后直至开始照射紫外之前的期间)样品1天1次，在给定部位涂抹10μl，涂5天。
(2)紫外线照射期间每次紫外线照射之后，给样品特定部位涂抹。样品涂抹每天2次(早晚各一次)，每次10μl，每周5天(星期一～星期五)，涂2周。
(3)紫外线照射之后每天2次(早晚各一次)，每次10μl，每周5天(星期一～星期五)，涂40天。为使样本在紫外线照射期间减少紫外线吸收，样品在紫外线照射前和紫外线照射期间除涂有50％乙醇，还涂有被检化合物D-2-Nal-Arg-LeuNH2或D-Trp-Arg-LeuNH2。紫外线照射结束以后，50％乙醇组涂抹50％乙醇。
6.紫外线照射紫外线照射在胶带剥取日起进行5天后，每天1次，每周三天(星期一、星期三、星期五)，共计6次。
紫外线照射前，每次同上述方法一样，剃去褐色豚鼠背部毛，用水清洗评价部位洗掉被检物质，再用纸巾沾掉水分。将豚鼠固定在保定器内，眼睛用铝箔保护后，照射UVB(紫外线照射装置デルマレィM-DMR-80型(临床提供)。照射条件为0.5mW×5分钟，紫外线强度用紫外线强度计UVR-305/365 D(II)(临床提供)测定。
7.评价评价，每周1～2次，用分光测色计CM-2002(ミノルタ制)测定L*进行评价。其中，L*值为L*a*b*表色系统的一个数值，表示亮度。L*a*b*表色系统是用来表示物体颜色的一个系统。1976年由国际照明委员会(CIE)规范化，日本采用JIS(JIS Z8729)。
每次评价前，同样将豚鼠背部毛剃去，用水洗评价部位去除被检物质，再用纸巾沾去多余水分。
结果见后面图1。在图1中，纵轴是涂有被检物质D-2-Nal-Arg-LeuNH2(或D-Trp-Arg-LeuNH2)的评价部位的L*值与涂50％乙醇的评价部位L*值的差用ΔL*表示。横轴表示天数。紫外线照射完之日计作0日。ΔL*值越大，表明色素沉积越少，即表明该物质具有抑制促黑素细胞激素的作用。
结果显示，cAMP产生50％的抑制浓度(LC50)在100nM以下的具有促黑素细胞激素抑制作用的化合物对实际生物体也显示充分的促黑素细胞激素的抑制效果有效。
以上实验结果示于下表5。
表5MSH抑制剂评价结果
表5的评价基准如下(1)MSH抑制能力 本试验中50％抑制浓度评价100nM以下 A1001～1000nM B1001nM以上C(2)黑素生成抑制能力 本试验中显示黑素生成评价抑制能力的最小浓度1～10μM A11～100μMB101μM以上C(3)保存稳定性实验本试验中着色程度评价(APHA标准色)20以下A21～100 B101以上 C未作试验 -(4)褐色豚鼠评价色素沉积抑制试验有色素沉积抑制效果 ○无色素沉积抑制效果 ×未作试验 -由上表可知，本发明的化合物综合起来是优良的。
以下列配合例1～11表示的配比，按通常的方法配制的促黑素细胞激素抑制剂、化妆品或皮肤外用剂。
配合例1片剂 重量％D-2-Nal-Arg-LeuNH210乳糖 50淀粉 20羧甲基纤维素 19硬脂酸镁 1配合例2注射剂 重量％D-2-Nal-Arg-LeuNH2好 0.1葡萄糖2.0注射用水 其余部分配合例3软膏剂 重量％N-月桂酰-D-2-Nal-Arg-LeuNH21.0尿素 20.0白色凡士林15.0轻质液体石蜡 6.0鲸蜡醇3.0硬脂醇5.0单硬脂酸甘油酯5.0香料 适量防腐剂适量缓冲剂1精制水其余部分配合例4雪花膏 重量％D-2-Nal-Arg-LeuOEt1.0曲酸 1.0硬脂酸2.0聚氧乙烯(25)十六烷基醚3.0单硬脂酸甘油酯 2.0辛基十二烷醇10.0鲸蜡醇 6.0还原羊毛脂 4.0三十碳烷9.01，3-丁二醇 6.0聚乙二醇(1500) 4.0防腐剂 适量香料适量精制水 其余部分配合例5雪花膏 重量％D-2-Nal-Arg-LeuOEt 1.0熊果苷 1.0硬脂酸 2.0聚氧乙烯(25)十六烷基醚 3.0单硬脂酸甘油酯 2.0辛基十二烷醇10.0鲸蜡醇 6.0还原羊毛脂 4.0三十碳烷9.01，3-丁-二醇6.0聚乙二醇(1500) 4.0防腐剂 适量香料适量精制水 其余部分配合例6乳液 重量％D-1-Nal-Arg-LeuNH22.0松香油 0.1蜂蜡0.5凡士林 2.0单硬脂酸甘油酯 1.0聚乙二醇单油酸酯 1.0甲基聚硅氧烷 2.0鲸蜡醇 1.0三十碳烷 6.0聚羧乙烯制剂 0.51，3-丁二醇 4.0乙醇 5.0防腐剂 适量香料 适量精制水 其余部分配合例7明胶重量％N-乙酰-D-1-Nal-Arg-LeuNH20.1液体石蜡 12.0三(2-乙基己酸)甘油 50.0山梨糖醇 10.0聚乙二醇(400)5.0酰甲基牛磺酸 5.0聚氧乙烯(20)异十六烷醚 10.0防腐剂 适量香料 适量精制水 其余部分配合例8美容液 重量％D-2-Nal-Arg-LeuNH20.5一缩二丙二醇 5.0聚乙二醇(400)5.0乙醇 10.0羧乙烯聚合物 0.5褐藻酸钠 0.5KOH 0.2单硬脂酸聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐 1.0单油酸山梨糖醇 0.5油醇0.5胎盘提取物 0.2dl-α-生育酚乙酸酯 0.2防腐剂 适量香料适量褪色防止剂 适量精制水 其余部分配合例9粉底(バツク) 重量％L-1-Nal-Arg-LeuNH23.0聚乙烯醇15.0羧甲基纤维素5.01，3-丁二醇 5.0乙醇12.0聚氧乙烯(20)油醚0.5防腐剂 适量香料适量缓冲剂 适量精制水 其余部分配合例10粉底 重量％N-月桂酰L-1-Nal-Arg-LeuNH25.0液体石蜡10.0单油酸聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐3.5丙二醇 3.0氧化钛 9.0陶土24.0滑石42.0着色颜料3.0防腐剂 适量香料 适量精制水 其余部分配合例11洗脸液 重量％L-1-Nal-Arg-LeuNH20.5N-月桂酰-谷氨酸三乙醇铵盐25.0月桂酸三乙醇胺 5.0聚氧乙烯(4)聚氧丙烯(11)丁基醚5.0乙醇 3.0防腐剂 适量香料 适量精制水 其余部分(工业上应用的可能性)本发明的肽衍生物及促黑素细胞激素抑制剂具有抑制黑素细胞激素的作用，进而防止色素沉积，或预防、改善或治疗免疫异常症、免疫缺陷症，或者通过调节食欲来控制体重，可用于化妆品及皮肤外用剂，具有容易制备、容易保存的优点。


本说明书公开了一种促黑素细胞激素抑制剂,其特征是含有特定的萘基的二或三肽衍生物及其盐或以cAMP产生50%的抑制浓度(IC50)在100nM以下的促黑素细胞激素抑制化合物为有效成分。该促黑素细胞激素抑制剂有防止色素沉淀作用,或者预防、改善、或治疗免疫异常症和免疫缺陷症,或通过调节食欲来控制体重,可以用做化妆品、皮肤外用剂,且具有容易制备,方便保存的优点。