专利名称：止血和免疫功能的抑制剂的制作方法血管损伤启动一系列事件以修复损伤并控制血液从血管流出。该过程被称作止血。血小板在止血的早期阶段起作用，其通过形成血栓或栓形物以暂时修复血管损伤。血小板正常是不与血管壁的被覆内皮相互作用的，但由于事故或在手术过程中引起的血管损伤会破坏内皮细胞。根据损伤的程度，将会有不同的内皮下成分例如胶原蛋白、弹性膜或具有相关原纤维胶原蛋白的平滑肌细胞暴露于流动的血液。当这些内皮下成分在血管损伤后被暴露时，在此局部血流中移动的血小板将与暴露的含有胶原蛋白的内皮下基质相互作用，并减慢下来。血小板表面受体与暴露的胶原蛋白层之间的进一步作用导致血小板的结合和激活，引起局部血流的阻滞。这些结合的血小板被激活，并通过在血小板间形成血纤蛋白原桥与流经的血流中的血小板形成聚集物(Moroi和Jung，生物科学前沿(Frontiers in Bioscience)3719-28，1998；Barnes等，动脉粥样硬化症(Atherosclerosis)XI，Jacotot等编，ElsevierScience，第299-306页，1998；和Barnes等，Curr.Opin.Hematol.5314-20，1998)。止血反应是分级的，该反应取决于损伤区域中血管的损伤程度、所暴露的具体血管成分以及血流情况(Rand等，血栓形成和止血(Thrombosisand Haemostasis)78445-50，1997)。内皮下基质(VI型胶原蛋白和冯·维勒布兰德氏因子)在例如轻微血管损伤期间的暴露促进了低血流状况区域中出现低程度的粘附和聚集。导致更大程度血管创伤和其它血管成分(例如内弹性膜和弹性蛋白相关的微丝)暴露的损伤将刺激形成更为强大的血小板聚集物。暴露原纤维胶原蛋白的严重血管创伤会激起血小板的血栓形成反应，该反应保护受伤害者不过度失血(Rand等，同上)。止血抑制剂对于增加血管损伤后的血流量和钝化胶原性表面将是有用的。补体因子Clq由3个相关多肽(A、B和C链)的6个拷贝组成，每个多肽大约长225个氨基酸并在近氨基端有一个胶原蛋白结构域而在羧基端有一个球形区域。由6个A、6个B和6个C链的胶原蛋白结构域形成6个三股螺旋区域，构成一个中心区域和6个柄。球形头部由一个A、一个B和一个C链的球形羧基端结构域相连形成。因此Clq由通过6个胶原样柄与一个中心纤维区域连接的6个球形头组成。Sellar等，生物化学杂志(Biochem.J.)274481-90，1991。该构象通常称为花束。Acrp30具有类似的花束结构，该结构由单一类型多肽链所形成。已经发现Clq刺激防御机制并引发能够造成组织损伤的毒性氧种类的产生(Tenner，Behring Inst.Mitt.93241-53，1993)。在血小板上可以发现Clq的结合位点。此外，补体和Clq还在炎症中起作用。补体的激活是通过Clq与免疫球蛋白的结合起始的。Clq和该补体途径的抑制剂对于抗炎症应用、补体激活和血栓形成活性的抑制将是有用的。本发明提供可用于这些用途和本领域技术人员从本文的解说中将明了的其它用途的多肤。发明概述一方面，本发明提供促进哺乳动物脉管系统中血流的方法，其包括给所述哺乳动物施用存在于可药用载体中的有效治疗量的脂肪细胞补体相关蛋白质；由此所述脂肪细胞补体相关蛋白质降低所述脉管系统中的血栓形成活性和补体活性．在一个实施方案中，该脂肪细胞补体相关蛋白质包含如下多肽，该多肽含有与SEq ID NO2第26-281位残基在氨基酸序列上有至少75％一致性的氨基酸残基序列，其中所述序列含有形成胶原结构域的Gly-Xaa-X砚或Gly-Xaa-Pro重复(其中Xaa是任何氨基酸)，以及羧基端的球形部分．在一个相关实施方案中，该多肽含有与SEQID NO2第22-281位残基在氨基酸序列上有至少90％一致性的氨基酸残基序列。在另一个实施方案中，该多肽含有与SEQ ID NO2第26-281位残基在氨基酸序列上有至少90％一致性的氨基酸残基序列。在又一实施方案中，所述多肽与SEQ ID NO2之间的任何差异均由保守氨基酸替代引起。在另一个实施方案中，该胶原蛋白结构域由13个Gly-Xaa-Xaa重复和1个Gly-Xaa-Pro重复组成。在又一实施方案中，该球形结构域由10个β折叠组成。在一个相关的实施方案中，该β折叠与相应于SEQ ID NO2的第147-151、170-172、178-181、191-203、207-214、219-225、227-239、244-250和269-274位的氨基酸残基相关。在又一实施方案中，该多肽含有SEQ ID NO2的第1-281位残基或SEQ ID NO44的第1-281位残基。
本发明还提供与第二个多肽复合形成寡聚体的多肽。在一个实施方案中，该多肽通过分子间二硫键复合。在另一个实施方案中，该寡聚体是三聚体。在又一实施方案中，该寡聚体是六聚体。在又一实施方案中，该多聚体是十八聚体。
在另一个实施方案中，该多肽通过抑制补体途径和抑制胶原蛋白介导的血小板粘附、激活或聚集，降低血栓形成活性和补体活性。在另一个实施方案中，在所述哺乳动物出现急性血管损伤之前、过程中或之后施用该多肽。在又一实施方案中，所述破损是由于血管重建引起的。在一个相关的实施方案中，该血管重建包括血管成形术、冠状动脉旁路移植、动脉内膜切除术、微血管修复或血管移植物的吻合。在另一个相关实施方案中，所述损伤是由于外伤、中风或血管瘤引起的。
另一方面，本发明提供钝化(pacify)哺乳动物中损坏的胶原性组织的方法，包括给所述哺乳动物施用有效治疗量的脂肪细胞补体相关蛋白质，籍此所述蛋白质使该损坏的胶原性组织对补体激活、血栓形成活性或免疫激活不起反应。在一个实施方案中，该损坏的胶原性组织是由于与缺血和再灌注相关的损伤造成的。在另一个实施方案中，该损伤包括外伤性损伤缺血、肠绞窄(intestinal strangulation)或与血流恢复之前或之后(pre-and post-establishment of blood flow)相关的损伤。在又一实施方案中，给患有心肺动脉旁路缺血和recesitation、心肌梗死或外伤后血管痉挛的哺乳动物施用该多肽。在一个相关实施方案中，该外伤后血管痉挛包括中风、经皮腔内血管成形术、动脉内膜切除术、意外性血管外伤或手术引起的血管外伤。
再一方面，本发明提供钝化用于哺乳动物的假体生物材料(prostaticbiomaterial)表面的方法，包括给所述哺乳动物施用有效治疗量的脂肪细胞补体相关蛋白质；籍此所述多肽使所述假体生物材料(prostheticbiomaterial)表面对补体激活、血栓形成活性或免疫激活不起反应。在一个实施方案中，所述假体生物材料的表面包被有胶原蛋白或胶原蛋白的片段、明胶、纤维蛋白或纤连蛋白。
本发明的另一方面提供在哺乳动物中调节伤口修复的方法，包括给所述哺乳动物施用有效治疗量的脂肪细胞补体相关蛋白质；籍此所述多肽加速伤口的愈合进程。
附图简要说明

图1图解了本发明zsig37多肽与HUMUPST2_1(Maeda等，Biochem.Biophys.Res.Comm.221(2)286-9，1996)；C1QA_HUMAN(Sellar等，生物化学杂志274481-90，1991；Reid，生物化学杂志179367-71，1979；和Reid等，生物化学杂志203559-69，1982)；HP25_TAMAS(Takamatsu等，分子细胞生物学(Mol.Cell Biol.)131516-21，1993和Kondo & Kondo，J.Biol.Chem.267472-8，1992)；HP27_TAMAS(Takamatsu等，和Kondo & Kondo参考文献同上)；和CERL_RAT(Wada& Ohtani，Brain Res.Mol.Brain Res.971-7，1991)的多序列比对。
图2是一个矩阵，显示了图1多序列比对中所示6个蛋白质相比较的氨基酸一致性百分数。
图3a显示了zsig37-FITC与VI型胶原蛋白的结合。
图3b显示了未标记的zsig37与FITC标记的zsig37对VI型胶原的竞争结合。
图4显示了补体Clq-FITC与zsig37的结合。
图5显示了zsig37对人类补体活性的抑制。
图6显示了在zsig37存在时血小板通过胶原聚集的百分数。
图7显示了在zsig37存在时SK5成纤维细胞的增殖。
发明详述在详细阐述本发明之前，定义以下术语可能对于本发明的理解是有帮助的。
术语“亲和标记物”在本文中用以指能够与多肽连接以利于该多肽的纯化或检测，或提供该多肽与底物结合的位点的多肽片段。原则上，任何可以获得其抗体或其它特异性结合剂的肽或蛋白质均可以用作亲和标记物。亲和标记物包括聚组氨酸序列片段、A蛋白(Nilsson等，EMBO J.41075，1985；Nilsson等，酶学方法(Methods Enzymol.)1983，1991)、谷胱苷肽S-转移酶(Smith和Johnson，基因(Gene)6731，1988)、P物质、FlagTM肽(Hopp等，生物技术(Biotechnology)61204-10，1988；可以从Eastman Kodak公司，New Haven，CT获得)、链霉亲和素结合肽、或其它抗原表位或结合域。一般参见Ford等，蛋白质表达和纯化(Protein Expression and Purification)295-107，1991。编码亲和标记物的DNA可以从供应商处获得(例如Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)。
术语“多核苷酸分子的互补体”是与参照序列相比具有互补的碱基序列和相反取向的多核苷酸分子。例如，序列5’ATGCACGGG 3’与5’CCCGTGCAT 3’互补。
术语“简并核苷酸序列”是指包括一个或多个简并密码子的核苷酸序列(与编码多肽的参照多核苷酸分子相比而言)。简并密码子含有不同的三联体核苷酸，但编码相同的氨基酸残基(例如，GAU和GAC三联体均编码Asp)。
术语“分离的”当应用于多核苷酸时，是指该多核苷酸已从其天然遗传环境中被取出，并因此不含有其它外来或不需要的编码序列，而且其存在形式适合用于遗传工程蛋白质制备系统。这些分离的分子是从其天然环境中分离出来的分子，包括cDNA和基因组克隆。本发明的分离DNA分子不含有通常与之相联的其它基因，但可以包括天然存在的5’和3’非翻译区例如启动子和终止子。相联区域的鉴定对于本领域普通技术人员是明了的(见例如Dynan和Tijan，自然(Nature)316774-78，1985)。
“分离的”多肽或蛋白质是指在非其天然环境的情况中例如在脱离血液和动物组织的情况中发现的多肽或蛋白质。在一种优选的形式中，该分离多肽基本不含有其它多肽，尤其是动物来源的其它多肽。优选提供高纯度形式的该多肽，例如具有大于95％的纯度、更优选大于99％的纯度。当用于本文时，术语“分离的”并不排除以其它物理形式存在的相同多肽，例如二聚体或其它糖基化形式或衍生形式。
术语“直向同源物(ortholog)”是指从一个物种获得的多肽或蛋白质，其是另一个物种的多肽或蛋白质的功能性对应物。直向同源物之间的序列差异是物种形成的结果。
术语“多核苷酸”是指从5’向3’末端进行阅读的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的单链或双链聚合物。多核苷酸包括RNA和DNA，并且可以是从天然来源分离的、体外合成的、或从天然和合成分子的组合制备的。多核苷酸的大小以碱基对(缩写“bp”)、核苷酸(“nt”)或千碱基(“kb”)表示。在上下文允许的地方，后两个术语可以描述单链或双链多核苷酸。当该术语应用于双链分子时，其用以指整个长度并应理解为与术语“碱基对”相同。本领域技术人员将知道，双链多核苷酸的两条链可以在长度上稍有不同，并且它们的末端可以由于酶切而是交错的；因此在双链多核苷酸分子中并非所有核苷酸都是配对的。这些非配对末端一般长度不超过20个nt。
“多肽”是通过肽键连接的氨基酸残基的聚合物，而不论其是天然产生的还是合成产生的。少于大约10个氨基酸残基的多肽通常称为“肽”。
本文所用“探针和/或引物”可以是RNA或DNA。DNA可以是cDNA或基因组DNA。多核苷酸探针和引物是单链或双链DNA或RNA，通常是合成的寡核苷酸，但也可以从克隆的cDNA或基因组序列或其互补体产生。分析探针一般长至少20个核苷酸，尽管有时可以使用更短的探针(14-17个核苷酸)。PCR引物至少长5个核苷酸，优选15个nt或更多、更优选20-30个nt。当基因的一个小区域是分析的靶标时，可以使用短多核苷酸。对于基因的整体分析，多核苷酸探针可以含有完整的外显子或更多。可以通过本领域熟知的技术用例如酶、生物素、放射性核素、荧光基团、化学发光物、顺磁颗粒等对探针进行标记以提供可检测信号，这些标记物可以从许多商业途径获得，例如Molecular Probes公司，Eugene，OR和Amersham公司，Arlington Heights，IL。
通过粗略的分析方法(例如，凝胶电泳)确定的分子量和多聚物的长度应理解为是大概值。当该值以“大约”X或“近似”X表示时，X的所述值应理解为准确到±10％。
本发明部分基于如下发现，即一种新的脂肪细胞补体相关蛋白质同系物抑制胶原蛋白介导的血小板激活和包括Clq的补体途径。该蛋白质命名为zsig37，并全面地描述于共同转让的公开PCT专利申请WO99/04000。
该zsig37的核苷酸序列(SEQ ID NO1)编码一个多肽(SEQ ID NO2)，该多肽具有一个氨基端信号序列、一个邻近的N-端非同源区域、一个由Gly-Xaa-Xaa或Gly-Xaa-Pro重复组成的截短胶原蛋白结构域和一个羧基端球形部分。该新多核苷酸序列还含有一个长的3’非翻译区。Acrp30和HUMUPST2_1共同具有以上给出的该通用多肽结构，只是这些蛋白的每一个的胶原蛋白样结构域都比zsig37的长。HUMUPST2_1 DNA序列的特征还在于有一个长的3’非翻译区。而且，Acrp30和图1比对的所有序列，除了CERL_RAT外，均在图1和SEQ ID NO2所示zsig37多肽的第187位具有一个保守半胱氨酸残基。而且，本发明的zsig37多肽包括一个推测的N-连接糖基化位点，该位点位于SEQ ID NO2的第93位(Asn)氨基酸。
zsig37的相应mRNA的组织分布分析显示，在心脏和胎盘中表达最高，在肾、卵巢、肾上腺和骨骼肌中信号相对较弱，而存在于Northern印迹上的许多其它组织中信号更弱。
zsig37与脂肪细胞补体相关蛋白质Acrp30(SEQ ID NO3)和脂肪细胞分泌蛋白apM1(图1和2中的HUMUPST2_1)的同系物关系已确立。还鉴定了与补体成分C1QA链、在冬眠的西伯利亚旱獭的活跃状态中所观察到的两个因子(HP25_TAMAS和HP27_TAMAS)和大鼠脑蛋白质(CERL_RAT)更远一些的同源关系，如图1和2所示。
zsig37的核苷酸序列描述于SEQ ID NO1中，其推导的氨基酸序列描述于SEQ ID NO2中。在SEQ ID NO23中提供了编码SEQ ID NO2之多肽的简并核苷酸序列。正如以上一般描述的，该zsig37多肽包括一个从第1位氨基酸(Met)至第21位氨基酸(Gly)的信号序列。可选择的另一个信号序列从第1位氨基酸(Met)至第25位氨基酸(Ser)。因此该成熟多肽从第22位氨基酸(Leu)或第26位氨基酸(Arg)延伸至第281位氨基酸(Pro)。在该成熟多肽中，N-端区域，即第22位氨基酸残基(Leu)和第98位氨基酸残基(Lys)之间未发现已知的同源性。此外，在第99位氨基酸(Gly)和第140位氨基酸(Arg)之间发现一个截短的胶原蛋白结构域。在该截短的胶原蛋白结构域中，观察到1个完全的Gly-Xaa-Pro和13个不完全的Gly-Xaa-Xaa重复。相反地，Acrp30含有22个完全或不完全重复。该zsig37多肽还包括一个羧基端球形结构域，从大约第141位氨基酸(Cys)延伸至第281位氨基酸(Pro)。Zsig39多肽、HUMUPST2_1和Acrp30表现出在胶原蛋白结构域和球形结构域中是同源的，而在成熟多肽的N端部分则不同源。
ACRP30的球形Clq结构域经测定具有一个10个β链的“涂果子冻的薄卷饼(jellyroll)”拓扑结构(Shapiro和Scherer，Curr.Biol.8335-8，1998)，该结构显示出与TNF家族具有显著的结构同源性，而且SEQ ID NO2所示zsig37序列含有该结构的所有10个β链(SEQ ID NO2的第147-151、170-172、178-181、185-188、191-203、207-214、219-225、227-238、244-250和269-274位氨基酸残基)。这些链分别称为“A”、“A’”、“B”、“B’”、“C”、“D”、“E”、“F”、“G”和“H”。
zsig37具有两个受体结合环，位于氨基酸第152-180位和第213-226位。在包括CD40、TNFα、TNFβ、ACRP30和zsig37的超家族中，第191位(Gly)、193位(Tyr)、238位(Leu)和272位(Gly)氨基酸残基表现出是保守的。
本发明的另一方面包括zsig37多肽片段作为止血和免疫功能的抑制剂的应用。优选的片段包括zsig37多肽的胶原蛋白样结构域(SEQ ID NO2的第99位氨基酸(Gly)至第140位氨基酸(Arg))、zsig37多肽的含有该胶原蛋白样结构域的部分、或该胶原蛋白样结构域的能够形成二聚体或寡聚体的部分。其它优选的片段包括zsig37多肽的球形结构域(SEQID NO2的第140位氨基酸(Arg)或第141位氨基酸(Cys)至第281位氨基酸(Pro))、zsig37多肽的含有该球形样结构域的部分、或该球形样结构域的活性部分。本发明的另一个zsig37多肽片段包括该胶原蛋白样结构域和从SEQ ID NO2第99位(Gly)至第281位(Pro)氨基酸残基的球形结构域两者。这些片段在抑制胶原蛋白介导的血小板激活中以及在对补体和Clq的抑制中尤其有用。
本发明还提供zsig37融合蛋白的用途。例如，本发明的融合蛋白包括(1)选自下组的多肽(a)含有SEQ ID NO2第1位(Met)、第22位(Leu)或第26位(Arg)氨基酸残基至第281位氨基酸残基(Pro)所示的氨基酸序列的多肽分子；(b)SEQ ID NO2第99位氨基酸(Gly)至第140位氨基酸(Arg)之间的多肽分子、zsig37多肽的含有胶原蛋白样结构域的部分、或能够形成二聚体或寡聚体的该胶原蛋白样结构域的部分；(c)SEQID NO2的第140位氨基酸(Arg)或第141位氨基酸(Cys)至第281位氨基酸(Pro)之间的多肽分子、zsig37多肽的含有所述球形样结构域的部分、或该球形样结构域的活性部分；或(d)第99位氨基酸(Gly)至第281位氨基酸(Pro)之间的多肽分子、zsig37多肽的包括所述胶原蛋白样结构域和所述球形结构域的部分；和(2)另一个多肽。该另一个多肽可以是一个可替代的或其它的球形结构域、一个可替代的或其它的胶原蛋白样结构域或利于该融合蛋白分泌的信号肽等等。
zsig37的拮抗剂和激动剂在本发明方法中也是有用的。鉴定拮抗剂的方法是本领域已知的。例如，zig37多肽的拮抗剂可以通过如下步骤进行鉴定提供响应zsig37多肽的细胞，将此细胞的第一部分在存在zsig37多肽时进行培养，将此细胞的第二部分在存在该zsig37多肽和测试化合物时进行培养，检测该细胞的第二部分相对该细胞的第一部分在细胞响应方面的降低。除了本文所公开的这些分析方法之外，还可以在多种设计成测量受体的结合或zsig37依赖性细胞响应的激活/抑制的分析方法中检测样品对zsig37活性的抑制。例如，可以用响应zsig37所刺激的细胞通路的报道基因结构转染zsig37效应细胞系。该类型的报道基因结构是本领域已知的，一般包含可操作地与编码可测定蛋白质例如荧光素酶的基因相连的zsig37-DNA效应元件。DNA效应元件可包括但不限于环AMP效应元件(CRE)、激素效应元件(HRE)、胰岛素效应元件(IRE)(Nasrin等，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)875237-7，1990)和血清效应元件(SRE)(Shaw等，细胞(Cell)56563-72，1989)。环AMP效应元件的综述见Roestler等，J.Biol.Chem.263(19)9063-6，1988和Habener，分子内分泌学(Molec.Endocrinol.)4(8)1087-94，1990。激素效应元件的综述见Beato，细胞(Cell)56335-44，1989。对于候选化合物、溶液、混合物或提取物，测试其抑制zsig37对靶细胞的活性的能力，这通过zsig37刺激的报道基因表达的降低来指示。此类分析将检测直接阻断zsig37与细胞表面受体结合的化合物，以及阻断受体-配体结合之后细胞通路中的过程的化合物。在可选择的另一种方法中，可以采用标记了可检测标记(例如125I、生物素、辣根过氧化物酶、FITC等)的zsig37，检测化合物或其它样品对zsig37与受体结合的直接阻断。在此类分析方法中，测试样品抑制标记的zsig37与受体结合的能力指示了抑制活性，该抑制活性可以通过第二种分析进行验证。用于结合分析方法的受体可以是细胞受体或分离的、固定化的受体。
特异与zsig37多肽表位、肽或多肽结合的抗体在本发明方法中也是有用的。制备多克隆和单克隆抗体的方法是本领域所熟知的(见例如Sambrook等，分子克隆实验室手册(Molecular CloningA LaboratoryManual)，第2版，Cold Spring Harbor，NY，1989；和Hurrell，J.G.R.编，单克隆杂交瘤抗体技术和应用(Monoclonal Hybridoma AntibodiesTechniques and Applications)，CRC Press公司，Boca Raton，FL，1982)。
本领域的普通技术人员将明了，多克隆抗体可以通过接种多种恒温动物例如马、奶牛、山羊、绵羊、狗、鸡、兔、小鼠、仓鼠、豚鼠和大鼠，以及转基因动物例如转基因绵羊、奶牛、山羊或猪来制备。还可以以经过修饰的形式在酵母和真菌中以及哺乳动物和昆虫细胞中表达抗体。zsig37多肽或其片段用作抗原(免疫原)接种动物或引发免疫应答。适合的抗原将包括由SEQ ID NO2的第22-281位氨基酸残基、SEQ ID NO2的第26-281位氨基酸残基、或SEQ ID NO2的连续的第9-281位氨基酸残基片段所编码的zsig37多肽。zsig37多肽的免疫原性可以通过使用佐剂例如明矾(氢氧化铝)或弗氏完全或不完全佐剂来增强。对于免疫有用的多肽还包括融合多肽，例如zsig37或其部分与免疫球蛋白多肽或与亲和标记物的融合物。多肽免疫原可以是全长的分子或其部分。如果该多肽部分是“类半抗原”，则可以有利地将该部分与高分子载体(例如匙孔血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)或破伤风类毒素)结合或连接用于免疫。
本文所用术语“抗体”包括多克隆抗体、亲和纯化的多克隆抗体、单克隆抗体、和抗原结合片段，例如F(ab’)2和Fab蛋白水解片段。基因工程化的完整抗体或片段例如嵌合抗体、Fv片段、单链抗体等，以及合成的抗原结合肽和多肽也包括在内。非人类抗体可以通过仅将非人类CDR嫁接到人类的构架和恒定区上，或通过掺入完整的非人类可变区(任选地通过取代暴露的残基用人类抗体样表面“覆盖”它们，其中所获得的结果是“表面经装饰的”抗体)来实现人源化。在一些情况中，人源化抗体可以在人的可变区构架结构域中保留非人类的残基以增强正确的结合特性。通过对抗体的人源化，可以增加生物学半衰期，并降低给人施用时产生不利免疫反应的潜在可能性。用于制备或筛选本文有用的抗体的另一些可选择技术包括将zsig37蛋白质或肽在体外暴露给淋巴细胞，并(例如通过使用固定化的或标记的zsig37蛋白质或肽)筛选噬菌体或类似载体的抗体展示文库(antibody display library)。
如果1)抗体表现出阈值水平的结合活性，和/或2)抗体与相关多肽分子没有显著的交叉反应，则该抗体被定义为具有特异结合性。首先，在本文中如果抗体与zsig37多肽、肽或表位的结合具有106mol-1或更高，优选107mol-1或更高，更优选108mol-1或更高，最优选109mol-1或更高的结合亲和力(Ka)，则该抗体具有特异结合性。抗体的结合亲和力可以容易地由本领域的普通技术人员根据例如Scatchard分析(Scatchard，Ann.NY Acad.Sci.51660-672，1949)进行测定。
其次，如果抗体与相关多肽没有显著的交叉反应，则该抗体具有特异结合性。例如，如果采用标准Western印迹分析(Ausubel等，同上)抗体仅检测zsig37多肽而不检测已知的相关多肽，则该抗体与相关多肽分子没有显著的交叉反应。已知相关多肽的例子包括蛋白质家族的其它成员例如Acrp30(SEQ ID NO3)、图1比对中所示的多肽等等。如果需要的话，它们还可以包括直向同源物和突变的人类zsig37多肽。而且，可以“筛选不与”已知相关多肽结合的抗体以分离特异与本发明多肽特异结合的群体。例如，将针对人类zsig37多肽所产生的抗体与附着在不溶性基质上的相关多肽吸附；在适合的缓冲液条件下特异结合人类zsig37多肽的抗体将会流过该基质。这种筛选方法使得可以分离不与密切相关的多肽发生交叉反应的多克隆和单克隆抗体(抗体实验室手册(AntibodyA Laboratory Manual)，Harlow和Lane(编)，Cold Spring HarborLaboratory Press，1988；当代免疫学实验指南(Current Protocols inImmunology)，Cooligan等(编)，National Institute of Health，JohnWiley and Sons公司，1995)。筛选和分离特异性抗体的方法是本领域所熟知的(见，基础免疫学(Fundamental Immunology)，Paul(编)，Raven Press，1993；Getzoff等，免疫学进展(Adv.in Immunol.)431-98，1998；单克隆抗体原理和实践(Monoclonal AntibodiesPrinciples andPractice)，Goding J.W.(编)，Academic Press公司，1996；Benjamin等，免疫学年评(Ann.Rev.Immunol.)267-101，1984)。这些分析方法的代表性例子包括并行免疫电泳(concurrentimmunoelectrophoresis)、放射免疫分析、放射免疫沉淀、酶连免疫吸附测定(ELISA)、斑点印迹或Western印迹分析、抑制或竞争分析和三明治分析(sandwich assay)。
zsig37多肽、片段、融合物、拮抗剂或激动剂对于止血的影响，尤其是对导致血小板聚集的血小板粘附和激活的影响，可以通过采用本文所提供的以及本领域所已知的方法和分析进行测定。胶原蛋白是血小板聚集的有效诱导剂。这就对从血管损伤康复的患者造成了危险。针对胶原蛋白诱导的血小板聚集的抑制剂对于该目的将是有用的。zsig37被发现可以与纤连蛋白以及I、II、III、V和VI型胶原蛋白结合。尤其是，zsig37可以以浓度依赖性方式与VI型胶原蛋白上的特定结构域结合。而且发现zsig37可以抑制胶原蛋白所介导的血小板激活。zsig37所诱导的抑制作用对于胶原蛋白的激活具有选择性，zsig37对由已知血小板激活剂ADP或凝血酶激活的血小板没有作用。这些结果在以下实施例部分中有更为详细的描述。预期对于阻止血小板与胶原蛋白包被表面的结合以及降低相关的胶原蛋白诱导的血小板聚集，zsig37多肽、片段、融合物、拮抗剂或激动剂将是有用的。
Clq是补体途径的一个成分，而且发现Clq可以刺激防御机制以及引发能够造成组织损害的毒性氧种类的产生(Tenner，Behring Inst.Mitt.93241-53，1993)。在血小板上发现有Clq的结合位点。已发现不依赖免疫结合配偶体的Clq可以抑制血小板的聚集但不抑制血小板的粘附或形状改变。Clq的氨基端区域与胶原蛋白具有同源性(Peerschke和Ghebrehiwet，免疫学杂志(J.Immunol.)1452984-88，1990)。zsig37以浓度依赖性方式与补体Clq结合。发现zsig37在有致敏和未致敏绵羊红细胞时可以有效地抑制包括Clq的补体途径。
本发明的zsig37多肽、片段、融合蛋白、抗体、拮抗剂或激动剂可以通过降低粘附和被激活的血小板数目以及血小板聚集物的大小用于促进哺乳动物脉管系统中血液流动的方法中。这些方法将包括给需要该治疗的哺乳动物使用有效治疗量的zsig37多肽、片段、融合物、抗体、拮抗剂或激动剂，籍此zsig37降低该哺乳动物脉管系统中的血栓形成活性和补体活性。正如以下描述的，zsig37多肽抑制胶原蛋白介导的血小板激活，并通过结合失活纤连蛋白和I、II、III、V和VI型胶原蛋白。施用zsig37可以通过减小血小板粘附、激活和聚集的形态(modes)，在血管损伤位置降低血栓形成活性。正如以下所描述的，zsig37还抑制补体途径和Clq，从而降低了脉管系统中的补体活性。用于这些方法的zsig37多肽、片段、融合物、抗体、拮抗剂或激动剂可以在哺乳动物的急性血管损伤之前、过程中或之后施用。
在一个优选的方法中，该血管损伤是由于血管重建引起的，该血管重建包括但不限于血管成形术、动脉内膜切除术、冠状动脉旁路移植、微血管修复或血管移植物的吻合。由于外伤、中风或血管瘤引起的血管损伤也在考虑之列。在其它优选方法中，该血管损伤是由于血小板破裂、脉管系统的降解、与糖尿病相关的并发症和动脉粥样硬化引起的。冠状动脉中血小板的破裂会引起心脏病发作，而脑动脉中血小板的破裂会引起中风。zsig37多肽、片段、融合蛋白、抗体、拮抗剂或激动剂在这些方法中的应用对于缓解与免疫系统相关的脉管系统全系统疾病，例如弥散性血管内凝血(DIC)和SID也将是有用的。此外，其补体抑制活性对于治疗非脉管系统免疫疾病例如小动脉硬化将是有用的。
已发现局部缺血心肌中Clq的存在与冠状动脉闭塞和再灌注之后的白细胞累积之间有相关性。组织损伤后细胞性成分的释放引发导致毒性氧产物的补体激活，这些毒性氧产物可能是心肌损伤的主要原因(Rossen等，Circ.Res.62527-84，1998和Tenner，同上)。发现阻断该补体途径可以保护缺血性心肌不受到再灌注的损害(Bureke等，J.Pharm.Exp.Therp.286429-38，1998)。zsig37多肽的补体抑制和Clq结合活性对于这些目的将是有用的。
zsig37的胶原蛋白和Clq结合能力可以用于钝化损坏的胶原性组织，防止血小板粘附、激活或聚集，以及导致毒性氧产物释放的炎症过程的激活。通过使暴露组织对补体活性、血栓形成活性和免疫激活等作用不起反应，zsig37多肽、片段、融合物、抗体、拮抗剂或激动剂可以用于降低缺血和再灌注的损伤性影响。具体地，这些损伤包括外伤性损伤缺血、肠绞窄以及与血流恢复前和恢复后相关的损伤。zsig37可以用于治疗心肺动脉旁路缺血和recesitation、心肌梗死和外伤后的血管痉挛，例如中风、经皮腔内血管成形术以及意外性血管外伤或手术引起的血管外伤。
zsig37多肽、片段、融合物、抗体、拮抗剂或激动剂也可以用于钝化假体生物材料和手术器械，使得这些材料的表面对于补体激活、血栓形成活性或免疫激活不起反应。这些材料包括但不限于胶原蛋白或胶原蛋白片段包被的生物材料、明胶包被的生物材料、纤维蛋白包被的生物材料、纤连蛋白包被的生物材料、肝素包被的生物材料、胶原蛋白和凝胶包被的斯滕特固定模、动脉移植物、合成的心脏瓣膜、人造器官或任何暴露于血液的以超过1×108的水平与zsig37结合的假器官应用物。对这些材料的包被可以采用本领域已知的方法进行，见例如Rubens，美国专利5,272,074。
补体和Clq在炎症中起作用。通过Clq与免疫球蛋白结合起始补体的激活(Johnson，Pediatr.Infect.Dis.J.12933-41，1993；Ward和Ghetie，治疗免疫学(Therap.Immunol.)277-94，1995)。Clq和补体的抑制剂作为抗炎症剂将是有用的。这些应用可以用于防止感染。此外，可以给患有补体激活和免疫复合物与Clq结合所介导的炎症的个体，施用这些抑制剂。zsig37多肽、片段、融合蛋白、抗体、拮抗剂或激动剂可以通过克服损伤性伤口的愈合在调节伤口的修复、加快伤口愈合的进程的方法中应用。伤口愈合进程包括，例如炎症的减轻、成纤维细胞的恢复、伤口的收缩和感染的减轻等要素。
肿瘤细胞结合胶原蛋白的能力可能促成肿瘤转移。胶原蛋白结合的抑制剂对于调节肿瘤的粘附相互作用和转移扩散也是有用的(Noeske-Jungbult等，美国专利5,723,312)。
已发现采用Dainty等，药物学杂志(J.Pharmacol.)100767，1990和Rhee等，Neurotox.16179，1995的方法，zsig37可以在去甲肾上腺素收缩的主动脉环中诱导血管舒张，下文将作更为详细的描述。
可以采用本文所描述的方法或本领域已知的方法，例如血小板的聚集分析(Chiang等，血栓形成研究(Thrombosis Res.)37605-12，1985)和血小板粘附分析(Peerschke和Ghebrehiwet，免疫学杂志144221-25，1990)评价血小板的粘附、激活和聚集。可以采用本文所公开的方法或本领域已知的方法，例如Suba和Csako，免疫学杂志117304-9，1976中所描述的方法，确定Clq和补体途径的抑制。可以采用描述于Keller等，J.Biol.Chem.2685450-6，1993；Waxman和Connolly，J.Biol.Chem.2685445-9，1993；Noeske-Jungblut等，J.Biol.Chem.2695050-3，1994；或Deckmyn等，血液(Blood)85712-9，1995中的方法，测定血小板与胶原蛋白的粘附以及胶原蛋白诱导的血小板聚集的抑制。
为了评价zsig37多肽、片段、融合蛋白、抗体、拮抗剂和激动剂对缺血和再灌注损伤的影响，有多种体外和体内模型。见例如Shandelya等，血液循环(Circulation)882812-26，1993；Weisman等，科学(Science)249146-151，1991；Buerke等，血液循环91393-402，1995；Horstick等，血液循环95701-8，1997；和Burke等，J.Phar.Exp.Therp.286429-38，1998。Deckmyn等(同上)描述了离体仓鼠血小板聚集分析。在注射zsig37多肽之后可以采用Deckmyn等(同上)所描述的模型测定仓鼠和狒狒的出血次数。可以采用Deckmyn等(同上)所提供的仓鼠股静脉血栓形成模型测量响应本发明蛋白质的施用而产生的血栓形成。施用zsig37之后在流动情况下血小板粘附的改变可以采用Harsfalvi等，血液85705-11，1995中所述的方法来测定。
可以分析单独zsig37多肽、片段、融合蛋白、抗体、拮抗剂或激动剂，或者是分析它们与胶原蛋白诱导的血小板激活和聚集的其它抑制剂例如palldipin、moubatin或calin等之组合的补体抑制和伤口愈合作用。
zsig37多肽、片段、融合蛋白、抗体、拮抗剂或激动剂的评价可以采用本文所述的方法或本领域已知的方法进行，例如猪的皮层愈合(healing of dermal layer)(Lynch等，美国国家科学院院刊847696-700，1987)和遗传性糖尿病小鼠中全厚度皮肤损伤(Greenhalgh等，美国病理学杂志(Am.J.Pathol.)1361235-46，1990)等。可以单独分析本发明多肽，或结合上述的其它已知补体抑制剂一起进行分析。
此外，zsig37多肽、片段、融合物、其拮抗剂或激动剂在治疗上对于抗微生物应用可能是有用的。例如，补体成分Clq在宿主对感染物例如细菌和病毒的防御中起作用。已知Clq表现出几种特化功能。例如，Clq通过与结合的抗体或C-反应蛋白(CRP)的相互作用触发补体级联反应。而且，Clq可以直接与某些细菌、RNA病毒、支原体、尿酸结晶、细菌内毒素的A脂质成分和某些胞内细胞器成员相互作用。Clq与Clq受体的结合被认为可以促进吞噬。Clq还表现出增强宿主防御系统的抗体形成方面。见例如Johnston，Pediatr.Infect.Dis.J.12(11)933-41，1993。因此，可溶性Clq样分子可以用作抗微生物剂，促进对感染物的裂解或吞噬。
Clq和巨噬细胞消除受体中的带正电荷细胞外三股螺旋胶原蛋白性结构域被确定在配体结合中起作用，并表现出对于聚阴离子具有广泛的结合特异性(Acton等，J.Biol.Chem.2683530-37，1993)。溶血磷脂生长因子(溶血磷脂酸，LPA)和其它促有丝分裂阴离子位于损伤组织处，并有助于伤口的修复。LPA发挥着许多生物学作用，包括血小板的激活和基质装配的上调。LPA被认为与其它凝血因子协同起作用，并介导伤口的愈合。
已知蛋白质例如Clq和巨噬细胞消除受体的胶原蛋白样结构域可以和酸性磷脂例如LPA结合。zsig37胶原蛋白结构域的一个9mer区域，即SEQ ID NO2的第127-135位氨基酸残基，与Clq和巨噬细胞消除受体上的胶原蛋白结构域具有序列同源性。zsig37多肽、片段、融合物、拮抗剂或激动剂与促有丝分裂阴离子例如LPA的相互作用可以采用本领域已知的分析方法确定，见例如Acton等，同上。本发明多肽和抗体对发炎过程的抑制在防止伤口部位感染方面也是有用的。
对于药物应用，可以将本发明蛋白质与可药用载体根据常规方法配制成制剂用于肠胃外、口服、鼻内、直肠、局部、经皮给药等。优选的给药是在血管损伤处或附近进行。一般地，药物制剂包括zsig37蛋白质以及可药用载体例如盐水、缓冲盐水或5％葡萄糖水溶液等等。制剂可以进一步包括一或多种赋形剂、防腐剂、增溶剂、缓冲剂、防止在药瓶表面上蛋白质损失的白蛋白等。配制方法是本领域所熟知的，并公开于例如Remington制药科学和实践(The Science and Practice of Pharmacy)，Gennaro编，Mack Publishing公司，Easton PA，第19版，1995。治疗剂量一般由临床医师根据公认的标准并考虑待治疗的疾病的性质和严重性、患者的特点等来确定。剂量的确定属于本领域普通技术人员的水平范围内。
本文所用zsig37多肽、片段、融合蛋白、拮抗剂或激动剂的“药物学有效量”是指足以引起期望的生物学结果的量。该结果可以是病征、症状或病因的减轻，或任何其它期望的生物学系统改变。例如，zsig37多肽的有效量将能提供症状的主观缓解或由临床医师或其它有资格的观察者所指出的客观上可以确认的改善。zsig37多肽的这种有效量将提供例如对胶原蛋白所激活的血小板激活和包括Clq的补体途径的抑制、增加患者脉管系统中的局部血流量、和/或降低缺血和再灌注的损伤性作用。zsig37多肽的有效量能够随着待治疗的疾病或症状而有相当大的变化。待施用的该多肽的量和其在药物制剂中的浓度取决于所选择的载体、施用途径、特定多肽的效能、患者的临床状况、负效应和药物制剂中化合物的稳定性。因此，临床医师将根据对于所针对的患者或相似患者的临床经验使用在制剂中含有适合浓度的合适制剂和施用的制剂量。这些量将部分取决于待治疗的具体疾病、患者的年龄、体重和一般健康情况、以及本领域技术人员所明了的其它因素。典型地，剂量范围在0.01-100mg/kg施用对象体重。在例如用球囊导管进行的应用中，典型剂量范围将为0.05-5mg/kg施用对象体重。特定化合物的剂量可以根据体外或离体研究并结合实验动物研究来决定。在体外或离体研究中发现有效的化合物浓度为动物研究提供了指导，在动物研究中对剂量进行计算以在作用位置提供相似浓度。
本发明进一步通过如下非限制性实施例进行阐述。
实施例1EST序列的延伸本发明的编码此新zsig37多肽的多核苷酸最初是通过如下步骤鉴定的从EST数据库中选择一个EST，由此预测蛋白序列，并在已知序列数据库中搜索与基于此EST的预测蛋白质最同源的分泌蛋白。鉴定潜在编码与已知分泌蛋白具有生物学上有意义的同源性的蛋白质的EST用于进一步研究。发现一个EST序列，并预测其与脂肪细胞的特定蛋白质同源。见，例如Scherer等，J.Biol.Chem.270(45)26746-9，1995。为了鉴定相应的cDNA，对认为可能含有完整编码序列的克隆进行测序。使用Invitrogen S.N.A.P.TMMiniprep试剂盒(Invitrogen公司，San Diego，CA)，根据厂商说明书，制备5ml生长在LB＋50μg/ml氨苄青霉素中的过夜培养物。在ABIPRISMTM377型DNA测序仪(Perkin-Elmer Cetus，Norwalk，Ct.)上，使用ABI PRISMTMDye Terminator Cycle SequencingReady Reaction试剂盒，根据厂商说明书对该模板进行测序。使用针对含有该克隆的载体上的SP6和T7启动子的寡核苷酸ZC695(SEQ ID NO5)和ZC694(SEQ ID NO6) 作为测序引物。使用寡核苷酸ZC13210(SEQ ID NO7)、ZC13588(SEQ ID NO8)、ZC13532(SEQ ID NO9)、ZC13641(SEQ ID NO10)、ZC13586(SEQ ID NO11)、ZC13651(SEQ ID NO12)、ZC13622(SEQ ID NO13)、ZC13625(SEQ ID NO14)、ZC13650(SEQ ID NO15)、ZC13589(SEQ ID NO16)、ZC13624(SEQ ID NO17)、ZC13531(SEQ ID NO18)、ZC13587(SEQ ID NO19)、和ZC13623(SEQ ID NO20)完成该克隆的序列测定。测序反应在Hybaid OnmiGene Temperature Cycling系统(National Labnet公司，Woodbridge，NY)中进行。采用SEQUENCHERTM3.0序列分析软件(GeneCodes公司，Ann Arbor，MI)进行数据分析。所获得的2769bp序列公开于SEQ ID NO1中。最初来源的EST序列与SEQ ID NO1所示序列的比较显示，有一个碱基对不确定(一个未知的“N”残基)，没有碱基对插入，导致在该不确定碱基分辩时鉴定为亮氨酸，并且在这两个推导的氨基酸序列之间不存在移码。
实施例2
组织分布使用Clontech(Palo Alto，CA)的人类多组织印迹(Human MultipleTissue Blots)进行Northern分析。使用T4多核苷酸激酶和正向反应缓冲液(GIBCO BRL，Gaithersburg，MD)，根据厂商说明书，用32P放射性标记针对SEQ ID NO1中所示成熟蛋白质的核苷酸序列5’末端的30个碱基DNA探针(ZC12447；SEQ ID NO4)。采用NUCTRAP推进柱(StratageneCloning Systems，La Jolla，CA)纯化该探针。使用EXPTRSSHYB(Clontech，Palo Alto，CA)溶液进行预杂交，并作为Northern印迹的杂交溶液。杂交在50℃过夜进行，然后用2×SSC和0.1％SDS于室温洗涤该印迹，接着用1×SSC和0.1％SDS于68℃(大约低于解链温度5℃)进行洗涤。观察到一个大约2.8kb长度的转录本。信号强度在心脏和胎盘最高，肾、卵巢、肾上腺和骨骼肌中相对较低，而在Nortehn印迹上存在的大多数其他组织中信号更低。
采用Gut Northern组织印迹进行其它Northern印迹分析。该印迹的制备采用了来自人类结肠直肠腺癌细胞系SW480(Clontech，Palo Alto，CA)、人类小肠组织(Clontech)、人类胃组织(Clonteeh)、人类肠平滑肌细胞系(Hism；ATCC号CRL-1692；美国典型培养物保藏中心，12301Parklawn Drive，Rockville，MD)、正常人结肠细胞系(FHC；ATCC号CRL-1831；美国典型培养物保藏中心)和人类正常胎儿小肠细胞系(FHs74Int.；ATCC号CCL241；美国典型培养物保藏中心)的mRNA。
通过酸性胍方法(Cheomczynski等，生物化学分析(Anal. Biochem.)162156-9，1987)，从Hism、FHC和FHs74 Int.分离总RNA。通过在保留polyA+RNA的柱子中洗脱总RNA，选择polyA+RNA(Aviv等，美国国家科学院院刊691408-12，1972)。每个样品的2μg polyA+RNA在1.5％琼脂糖凝胶上于2.2M甲醛和磷酸缓冲液中分离。将这些RNA转移至Nytran膜(Schleicher和Schuell，Keene，NH)上，于20×SSC中过夜。在UVStratalinker 2400(Stratagene，La Jolla，CA)中，以0.12焦耳处理该印迹。然后于80℃干烤该印迹一小时。
通过PCR扩增全长cDNA(显示于SEQ ID NO1中)，并采用Rediprimepellet试剂盒(Amersham，Arlington Heights，IL)以及32P dCTP，根据厂家说明书进行放射性标记。该印迹在EXPRESSHYB(Clontech)中于56℃杂交过夜。室温下在2×SSC和0.1％SDS中洗涤该印迹，然后在2×SSC和0.1％SDS中于65℃进行洗涤，最后在0.1×SSC和0.1％SDS中于65℃进行洗涤。结果显示，zsig37与除了人类肠平滑肌细胞系HISM之外的所有组织均发生杂交。
实施例3zsig37基因的染色体作图采用NIGMS人/鼠体细胞杂交作图2号系列(NIGMS Human/RodentSomatic Cell Hybrid Mapping Pannel No.2)(National Institute ofGeneral Medical Sciences，Coriell Institute of Medical Research)，通过PCR将zsig37作图定位在人第17号染色体17q25.2区。该系列由分离自24个人/鼠体细胞杂种的DNA组成，其中所述的每一个体细胞杂种均保留了一个特定的人类染色体和亲本DNA。对于zsig37基因的作图，在96孔微滴定板(Stratagen，La Jolla，CA)中设定20μl反应，并将其用于“RoboCycler Gradient 96”温度循环仪(Stratagene)中。该27个PCR反应的每一个均由2μl 10×KlenTaq PCR反应缓冲液(Clontech Laboratories，Inc.，Palo Alto，CA)、1.6μl dNTP混合物(每种2.5mM，PERKIN-ELMER，Foster City，CA)、lμl有义引物(SEQ ID NO21)、1μl反义引物(SEQ ID NO22)、2μl RediLoad(Research Genetics，Inc.)、0.4μl 50×Advantage KlenTaq聚合酶混合物(Clontech Laboratories，Inc.)、25ng来自单个杂种克隆或对照的DNA、以及ddH2O，总体积为20μl。该反应物用等量矿物油覆盖并密封。PCR循环仪的条件如下起始一个循环95℃变性5分钟，之后35个循环，每个是95℃变性1分钟、60℃退火1分钟以及72℃延伸1.5分钟，接着最后1个循环72℃延伸7分钟。在3％NuSieve GTG琼脂糖凝胶(FMC Bioproducts，Rockland，ME)上电泳分离该反应产物。
实施例4哺乳动物表达载体zsig37NEE/pZP9和zsig37CEE/pZP9的构建为zsig37多肽制备了两个表达载体，zsig37NEE/pZP9和zsig37CEE/pZP9，其中这些结构被设计来表达具有C-或N-端Glu-Glu标记的zsig37多肽。
zsig37NEE/pZP9采用ZC15040(SEQ ID NO24)和ZC15033(SEQ ID NO；25)作为PCR引物，以及以上实施例1中所述的模板，PCR产生一个800bp的zsig-37DNA片段。该PCR反应为94℃孵育3分钟，然后94℃30秒、30℃ 20秒和72℃ 1分钟进行5个循环，之后94℃30秒、64℃ 20秒和72℃ 1分钟进行25个循环。接着72℃延伸5分钟。然后在0.9％ TBE琼脂糖凝胶上于1×TBE缓冲液中电泳所获得的PCR产物。切下具有预计大小的条带，并用Qiaex II?树脂(Qiagen)根据厂商说明书从该凝胶中纯化此DNA。用限制性酶Bam HI和Xba I消化该DNA，之后进行提取和沉淀。
将所切下的并经限制性消化的zsig37 DNA片段亚克隆至限制性酶BamHI和xba I消化过的质粒NEE/pZP9中。该zsig37NEE/pZP9表达载体整合了TPA前导序列，并在编码zsig37多肽的多核苷酸序列的N-端连有Glu-Glu标记(SEQ ID NO26)。质粒NEE/pZP9(保藏在美国典型培养物保藏中心，12301 Parklawn Drive，Rockville，MD，ATCC 98668)是一个哺乳动物表达载体，其含有一个带有小鼠金属硫蛋白-1启动子、TPA前导肽、之后为一个编码Glu-Glu标记的序列(SEQ ID NO26)、多个用以插入编码序列的限制性位点、以及一个人类生长激素终止子的表达盒。该质粒还含有一个大肠杆菌的复制原点、一个具有SV40启动子、增强子和复制原点、DHFR基因和SV40终止子的哺乳动物选择标记表达单元。
zsig376CEE/pZP9采用ZC15721(SEQ ID NO27)和ZC15035(SEQ ID NO；28)作为PCR引物，根据以上提及的程序，PCR产生一个866bp的zsig-37 DNA片段。用限制性酶EcoR I和Bam HI消化纯化的该PCR片段，之后采用QiaexII树脂按以上所述方法进行凝胶纯化。
将所切下的并经限制性消化的zsig37 DNA片段亚克隆至限制性酶EcoR I和Bam HI消化过的质粒CEE/pZP9中。该zsig37CEE/pZP9表达载体采用了zsig37自身的信号肽，并在C-端连接Glu-Glu表位(SEQ IDNO26)作为纯化的帮助物。质粒CEE/pZP9(保藏在美国典型培养物保藏中心，12301 Parklawn Drive，Rockyille，MD，ATCC 98668)是一个哺乳动物表达载体，其含有一个带有小鼠金属硫蛋白-1启动子、多个用以插入编码序列的限制性位点、一个编码Glu-Glu标记的序列(SEQ IDNO26)、一个终止密码子以及一个人类生长激素终止子的表达盒。该质粒还含有一个大肠杆菌的复制原点、一个具有SV40启动子、增强予和复制原点、DHFR基因和SV40终止子的哺乳动物选择标记表达单元。
对于该N-和C-标记的结构，将大约30ng限制性消化的插入片段和50ng相应的载体于室温连接4个小时。每个连接反应物各取1μl，根据厂商说明书电穿孔独立转化DH10B感受态细胞(GIBCO BRL，Gaithersburg，MD)，之后铺在含有50mg/ml氨苄青霉素的LB平板上，并孵育过夜。
通过上面描述的PCR筛选菌落。对于zsig37NEE/pZP9和zsig37CEE/pZP9的筛选，引物是ZC13006(SEQ ID NO29)和ZC13007(SEQ ID NO20)。该PCR反应在94℃孵育2.5分钟，然后94℃10秒、58℃20秒和72℃1分钟进行25个循环。接着72℃延伸5分钟。通过测序分析验证阳性克隆的插入序列，对于zsig37NEE为1013bp片段，而对于zsig37CEE为一个950bp的片段。大量质粒制备采用QIAGEN?MaxiPrep试剂盒(Qiagen)根据厂商说明书进行。
实施例5zsig37NEE和CEE多肽的转染和表达将BHK 570细胞(ATCC CRL-10316)接种在10cm组织培养皿中，并于37℃，5％CO2条件下在DMEM/FBS培养基(DMEM、Gibco/BRL高葡萄糖(Gibco BRL，Gaithersburg，MD)、5％胎牛血清(Hyclone，Logan，UT)、2μML-谷氨酰胺(JRH Biosciences，Lenexa，KS)、1μM丙酮酸钠(GibcoBRL))中使其过夜生长至大约50-70％汇合。然后采用LipofectamineTM(Gibco BRL)，在无血清(SF)培养基制剂(DMEM、Gibco/BRL高葡萄糖(Gibco BRL，Gaithersburg，MD)、2mM L-谷氨酰胺、2mM丙酮酸钠盐、10μg/ml转铁蛋白、5μg/ml胰岛素、10μg/ml胎球蛋白、和2ng/ml硒)中，用质粒zsig37NEE/pZP9(N-端Glu-Glu标记)或zsig37CEE/pZP9(C-端Glu-Glu标记)转染该细胞。在15ml管中将16μg zsig37NEE/pZP9和16μg zsig37CEE/pZP9分别稀释至最终总体积640μl的SF培养基中。在分开的管中，将35μl LipofectamineTM(Gibco BRL)与605μl SF培养基混合。向该DNA混合物加入LipofectamineTM混合物，并使其在室温孵育大约30分钟。向该DNALipofectamineTM混合物加入5ml SF培养基。用5ml SF培养基洗涤所述细胞一次，吸出，并加入该DNALipofectamineTM混合物。将该细胞在37℃孵育5小时，然后向此平板加入6.4mlDMEM/10％FBS、i％PSN培养基。37℃孵育该平板过夜，次日用新鲜的FBS/DMEM培养基替换掉该DNALipofectamineTM混合物。在转染后的第2天，在150mm平板中以1∶50、1∶100和1∶200的比例将细胞分开培养在选择培养基(含有1μM MTX的ESTRP#1)中。在转染后第5天用新鲜的选择培养基重新饲喂这些平板。筛选集落大约在转染后10-12天，从每个转染中选出一个带有氨甲蝶呤抗性集落的150mm培养皿，吸出培养基，用10ml无血清ESTEP 2培养基(668.7g/50L DMEM(Gibco)、5.5g/50L丙酮酸的96％钠盐(Mallinckrodt)、185.0g/50L NaHCO3(Mallinckrodt)、25ml/50L的5.0mg/ml胰岛素、25ml/50L的10.0mg/ml转铁蛋白)洗涤该平板。吸去洗涤培养基，并更换成5ml无血清ESTEP 2。然后将预先浸泡过无血清ESTEP2的无菌Teflon网(Spectrum Medical Industries，Los Angeles，CA)放置在这些细胞上。然后将预先浸泡过无血清ESTEP 2的无菌硝酸纤维素滤膜放置在该网上。将硝酸纤维素上的定位标记转移到培养皿上。然后将这些平板在37℃，5％CO2孵育器中孵育5-6小时。孵育之后，取出滤膜，吸去培养基，并替换为DMEM/5％FBS、1×PSN(Gibco BRL)培养基。然后将此滤膜放在含有50ml缓冲液(25mM Tris，25mM甘氨酸，5mMβ-巯基乙醇)可密封的袋子中，并于65℃水浴中孵育10分钟。在10％脱脂奶粉/Western A缓冲液(Western A50mM Tris pH7.4，5mM EDTA，0.05％NP-40，150mM NaCl和0.25％明胶)中于室温在摇床上封闭该滤膜15分钟。然后将该滤膜与1∶1000稀释的抗Glu-Glu抗体-HRP结合物在2.5％脱脂奶粉/Western A缓冲液(Western A50mM Tris pH7.4，5mM EDTA，0.05％NP-40，150mM NaCl和0.25％明胶)中4℃在摇床上孵育过夜。然后室温下在加有0.1％Tween 20的PBS中洗涤该滤膜3次，每次5-15分钟。用ECL试剂(Amersham公司，Arlington Heights，IL)根据厂商说明书对该滤膜进行显色，并对胶片(Hyperfilm ECL，Amersham)暴光大约5分钟。
将该胶片与含有集落的平板对齐。使用此胶片作为指导，选出适合的集落。将无菌3mm集落盘(PGC Scientific公司，Frederick，MD)浸泡在胰蛋白酶中，然后放在这些集落上。将每种结构各12个集落转移至96孔平板的200μl选择培养基中。对每个集落进行7次两倍的系列稀释。将这些细胞在37℃生长1周，此时选择目前处于最佳密度的接受了最低稀释度细胞的孔，胰蛋白酶消化，并将细胞转移至含有选择培养基的一个12孔平板中。同时用胰蛋白酶消化上述150mm培养皿，合并剩余的细胞，并用于Western分析和支原体检测。冷冻保存此细胞库。
直接从该12孔平板将这些克隆扩大培养在2个T-75三角瓶中。保留一个三角瓶以继续细胞的生长，将第二个三角瓶生长在无血清ESTEP 2中，收获该瓶的细胞用于Western印迹分析。基于western印迹分析选择每一种表达载体的克隆，将其合并，并转入大规模培养。
实施例7zsig37CEE的大规模哺乳动物表达将从上述表达程序获得的含有表达zsig37CEE的汇合细胞的一个T-162三角瓶，和含有zsig37NEE的一个三角瓶，每个扩大至4个T-162三角瓶。将所获得的4个三角瓶中的一个分装在4个冻存管中冻存，其余3个三角瓶用以产生一个Nunc细胞工厂。
来自zsig37CEE和zsigNEE的三个T-162三角瓶的细胞分别用于接种两个Nunc细胞工厂(10层，可从VWR购买获得)。简单地说，采用胰蛋白酶使来自上述T-162三角瓶的细胞解离，合并后加入预先加热至37℃的1.5升ESTEP1培养基(668.7g/50L DEME(Gibco)、5.5g/50L丙酮酸的96％钠盐(Mallinckrodt)、185.0g/50L NaHCO3(Mallinckrodt)、25ml/50L的5.0mg/ml胰岛素、25ml/50L的10.0mg/ml转铁蛋白(JRHBiosciences)、2.5L/50L(鉴定过的)胎牛血清(Hyclone)、1μMMTX，pH调节至7.05+/-0.05)中。然后将含有这些细胞的培养基通过漏斗倒入该Nunc细胞工厂。将这些细胞工厂置于37℃/5.0％CO2的孵育箱中。
在80-100％汇合时，对这些Nunc细胞工厂的内容物进行可视污染测试(酚红颜色改变)。由于没有观察到污染，将来自这些汇合工厂的上清液倒入一个小的收集容器中，取样后丢弃。然后用400ml PBS洗涤这些附着细胞一次。为了将这些细胞从这些工厂解离下来，每个加入100ml胰蛋白酶，然后除去，并在残余的胰蛋白酶中孵育这些细胞5-10分钟。用200ml ESTEP1培养基洗涤两次后收集这些细胞。向10个含有ESTEP1培养基的瓶子(每个1.5升，37℃)的每一个中加入40ml收集的细胞。然后用一个1.5升的瓶子供应一个Nunc工厂。将每个细胞工厂都置于37℃/5.0％CO2孵育器中。
在80-100％汇合时，对这些Nunc细胞工厂进行可视污染测试(酚红颜色改变)。由于没有观察到污染，将来自这些汇合工厂的上清液倒入一个小的收集容器中，取样后丢弃。然后用400ml PBS洗涤细胞一次。向每个Nunc细胞工厂加入1.5升ESTEP2培养基(668.7g/50L DEME(Gibco)、5.5g/50L丙酮酸的96％钠盐(Mallinckrodt)、185.0g/50LNaHCO3(Mallinckrodt)、25ml/50L的5.0mg/ml胰岛素、25ml/50L的10.0mg/ml转铁蛋白)。将这些细胞工厂孵育在37℃/5.0％ CO2中。
大约48小时后，对这些Nunc细胞工厂进行可视污染测试(酚红颜色改变)。将每个工厂的上清液倒入小的收集容器中。向每个Nunc细胞工厂倒入新鲜的无血清培养基(1.5升)，并在37℃/5.0％ CO2中孵育这些工厂。将每种结构的1ml上清液收集物转移至显微镜载玻片上，并进行污染的显微镜分析。将每种结构的小收集容器中的内容物合并，并立即过滤。然后在48小时后基本上按以上所述进行第二次收集，之后丢弃这些细胞工厂。使用一个无菌组装的过滤系列装置进行收获上清液(条件培养基)的无菌过滤。安装如下将导管用金属丝连接在一个Opti-Cap过滤器(Millipore公司，Bedford，MA)和一个Gelman Supercap 50过滤器(Gelman Sciences，Ann Arbor，MI)上。该Supercap 50过滤器还连有一个位于无菌工作台中的无菌带盖容器；位于该MilliporeOpti-cap过滤器上游的导管被插入一个蠕动泵中；并将该导管的游离末端放在大的收集容器中。该蠕动泵以200-300rpm的速率运行，直到所有的条件培养基都通过该0.22μm的最后一个过滤器进入无菌收集容器中为止。在纯化前将该过滤物置于4℃冷室中。用一个5kDA截断的Millipore浓缩器(Millipore公司，Bedford，MA)，根据厂商说明书将该培养基浓缩10倍，并将其用于Western印迹分析，该分析中采用了抗-FLAG标记的抗体(Kodak)。
zsig37CEE5个T-162三角瓶＝0.12mg/L，38kDa；1个工厂，FBS＝0.12mg/L，38kDa；10个工厂，FBS＝0.12mg/L，38kDa；10个工厂(#1)，SF＝1.2mg/L，38kDa；和10个工厂(#2)，SF＝3.56mg/L，38kDazsig37NEE5个T-162三角瓶＝0.137mg/L，35kDa；1个工厂，FBS＝0.137mg/L，35kDa；10个工厂，FBS＝0.137mg/L，35kDa；10个工厂(#1)，SF＝1.37mg/L，35kDa；和10个工厂(#2)，SF＝4.11mg/L，35kDa。
实施例7
zsig37 NEE和zsig37 CEE的纯化除非另行指出，所有操作均在4℃进行。采用以下程序纯化含有N-端或C-端Glu-Glu(EE)标记的zsig37。来自幼年仓鼠肾(BHK)细胞的总共25升条件培养基顺序通过一个4英寸0.2mM Millipore(Bedford，MA)OptiCap囊形过滤器以及一个0.2mM Gelman(Ann Arbor，MI)Supercap50进行过滤除菌。然后采用配有3000kDa截断的Amicon(Bedford，MA)S10Y3膜的Millipore ProFlux A30切线式流动浓缩器，将该物质浓缩成大约1.3升。再次用上述的Gleman过滤器过滤除菌该浓缩物。向该浓缩的条件培养基加入蛋白酶抑制剂混合物至终浓度为2.5mM乙二胺四乙酸(EDTA，Sigma Chemical公司，St.Louis，MO)、0.001mM亮抑酶肽(Boehringer-Mannheim，Indianapolis，IN)、0.001mM抑胃酶肽(Boehringer-Mannheim)和0.4mM Pefabloc(Boehringer-Mannheim)。向样品中加入按以下所述制备的25.0ml抗-EE Sepharose样品用于批量吸附，然后在Wheaton(Millville，NJ)转管培养装置上于4℃轻柔地搅拌该混合物18.0小时。
然后将该混合物倒入一个5.0×20.0cm Econo柱(Bio-Rad，Laboratories，Hercules，CA)中，然后用30个柱体积的磷酸缓冲盐(PBS)洗涤该凝胶。丢弃未保留的流过成分。一旦洗脱物在280nM的吸光值小于0.05之后，将过柱流速降低至零，并用2.0柱体积的含有0.4mg/ml EE肽(AnaSpec，San Jose，CA)的PBS分批洗涤该抗EESepharose凝胶。所用肽具有序列Glu-Tyr-Met-Pro-Val-Asp(SEQ IDNO31)。4℃一小时后，恢复流动，并收集洗脱的蛋白质。该部分称为肽洗脱物。然后用2.0柱体积的0.1M甘氨酸(pH2.5)洗涤该抗-EESepharose胶，并单独地收集该甘氨酸洗涤物。通过加入小量体积的10×PBS将该甘氨酸洗脱组分的pH调节至7.0，并将其贮存在4℃，以便如果需要可以进行进一步分析。
使用具有15,000分子量截断值的膜浓缩器(Millipore，Bedford，MA)根据厂商说明书将该肽洗脱物浓缩至5.0ml。通过在PBS平衡过的1.5×50cm Sephadex G-50(Pharmacia，Piscataway，NJ)柱上采用BioCadSprint HPLC(PerSeptive BioSystems，Framingham，MA)以1.0ml/min的流速进行层析，将该浓缩的肽洗脱物与游离肽分离开。以2ml作为一个组分，进行收集，并监测280nM处的吸光度。收集在280nM处具有吸收并在柱子的外水体积附近洗脱的第一个峰物质。该组分是纯的zsig37NEE或zsig37CEE。按以上所述方法浓缩该纯物质，通过SDS-PAGE和Western印迹，使用抗-EE的抗体进行分析，并取样进行氨基酸分析和N-端测序。剩余的样品等分后，根据我们的标准程序贮存在-80℃。
在没有还原剂时zsig37 NEE在SDS-PAGE凝胶上的电泳显示为一条主要的考马斯亮蓝染色带，表观分子量为39,000kDa，以及几个分子量在60,000-116,000之间的次要成分。所有条带在Western印迹上均表现出与抗-EE抗体的交叉反应性。在存在还原剂时，仅观察到的条带是该39,000kDa蛋白质，而且其考马斯亮蓝染色强度增加。该条带在Western印迹上也显示出与抗-EE抗体的交叉反应性。
对于zsig37 CEE，在没有还原剂时在SDS-PAGE凝胶上的电泳显示为一条表观分子量为39,000的主要考马斯亮蓝染色带，以及几个分子量在60,000-116,000之间的次要成分。在Western印迹上，仅有表观分子量为150,000、116,000和60,000的条带表现出与抗-EE抗体的交叉反应性。在存在还原剂时，仅观察到39,000kDa的考马斯亮兰染色条带，而且该物质在Western印迹上表现出与抗-EE抗体的交叉反应性。在这些条件下，还观察到在150,000kDa处有小量的交叉反应物质。
抗-EE Sepharose的制备采用500ml Nalgene 0.45微米过滤装置以含有0.02％叠氮化钠的100ml PBS洗涤100ml床体积的G蛋白质-Sepharose(Pharmacia，Piscataway，NJ)3次。用6.0倍体积的200mM三乙醇胺pH8.2(TEA，Sigma，St.Louis，MO)洗涤该凝胶，然后加入等体积含有900mg抗体的EE抗体溶液。4℃孵育过夜后，用5倍体积的200mM前述TEA洗涤该树脂以去除未结合的抗体。将该树脂重悬在2倍体积的TEA中，并将其转移至适合的容器中，之后加入溶解在TEA中的dimethylpimilimidate-2HCl(Pierce，Rockford，IL)至终浓度为每ml胶36mg。室温摇动该凝胶45分钟，然后用上述的过滤装置除去液体。然后用5倍体积的溶解于200mMTEA中的20mM乙醇胺室温孵育该凝胶10分钟，以封闭凝胶上的非特异位点。用5倍体积含有0.02％叠氮化钠洗涤该凝胶，然后在该溶液中于4℃保存该凝胶。
实施例8粘附和增殖分析按如下所述分析zsig37刺激TF-1细胞粘附和铺展的能力。用PBS或ELISA包被缓冲液(0.1 M NaCO3)从C末端Glu-Glu-标记的zsig37制备从10-0.0625μg/ml的系列稀释，并将各种稀释以100μl/孔加至96孔板(Costar，Pleasanton，CA)中。将该板在37℃、5％CO2孵育2小时。然后用RPMI/10％FBS(RPMI 1640，2mML-谷氨酰胺、110μg/ml丙酮酸钠、PSN和10％热失活的胎牛血清)洗涤该板三次，使其封闭15分钟。
将TF-1细胞(获自急性粒细胞白血病细胞)在RPMI/10％ FBS中重悬，并以10,000细胞/孔接种至zsig37CEE包被的96孔板，终体积为每孔120μl。将该板在37℃于5％CO2中孵育2小时。然后用PBS洗涤该板三次，每孔加入200μl生长培养基(RPMI/10％FBS，5ng/ml GM-CSF)，在洗涤之前和之后对细胞进行微生物学检查。
还使用染料掺入实验基于比色分析的变化和荧光信号的增加定量测定粘附细胞的数目。向96孔板加入Alamar BlueTM(AccuMed，Chicago，IL)，并将该细胞于37℃、5％CO2孵育过夜。然后用荧光计扫描培养板，激发光波长544nm，发射波长590nm。zsig37CEE-PBS包被的平板上比zsig37CEE-0.1M NaCO3包被的平板上有更多的粘附细胞。加入可溶性zsig37并不阻断细胞对结合的zsig37的粘附。
第二个分析采用TF-1、DA-1(来源于带有B-细胞淋巴瘤的小鼠淋巴结并通过在IL-3培养基中的过度生长产生的IL-3依赖性细胞系(由Dr.Kenneth Kaushansky，University of Washington，Seattle，WA提供))、前B细胞(p53+/-小鼠骨髓细胞，IL-7依赖性，B220+，低Thy1，Sca-1+)、和A7BaF-3细胞系