一种阳离子化昆布多糖及其制备方法和应用的制作方法[0002]研究发现，人类疾病都与基因直接或间接相关，因此基因治疗已成为针对包括癌症在内的多种疾病的主要治疗方法之一。如何将治疗基因有效传递至目的细胞并发挥其生物学功能是基因治疗中的关键问题，而这一问题的解决主要借助于安全、高效的基因载体。目前，用于基因治疗的载体主要分为病毒载体和非病毒载体(Curr DrugDeliv, 2004，1:165)。病毒载体具有较高的基因传递效率，但是也具有一些自身无法克服的缺点，例如免疫原性较高、目的基因装载量较小，费用较高等等。相对于病毒载体，非病毒载体具有免疫原性低、来源广泛、制备方便等优点。因此，近年来非病毒载体备受关注，已成为基因传递载体的主要研究方向。[0003]聚乙烯亚胺(PEI)是最具代表性的非病毒基因传递载体之一(Journal of GeneMedicine, 2004，7:657)。它通过静电相互作用与核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)形成纳米复合物，然后该复合物通过细胞内吞作用进入细胞，实现高效的基因转染。然后利用“质子海绵效应”释放核酸，最终达到治疗疾病的目的(BMC Biotechnology, 2004, 4:23)。研究发现，PEI的转染效率以及细胞毒性与其分子量密切相关。PEI分子量越高，治疗基因的细胞转染效率越高，但同时细胞毒性也显著提高(Bioconjugate Chem.2006, 17:152)。较高的细胞毒性限制了 PEI在临床研究中的进一步应用，因此研究者希望能够得到具有高转染效率，同时具有较低细胞毒性的新型非病毒基因传递载体。[0004]多糖是自然界中广泛存在的一种生物大分子，通常是由多个单糖通过糖苷键结合而形成的一种高分子碳水化合物。最初研究表明，多糖具有抗氧化、抗病毒、提高细胞免疫力等多种生理学活性(Carbohydrate Polymers, 2012，88:966)。随后的研究发现，多糖不仅可以与DNA形成稳定的纳米粒，表现出良好的细胞转染效率(ActaBiomater, 2012，8:4224)，而且可以通过与细胞上特定受体的相互作用，被特定细胞摄取，实现基因传递过程中的靶向性(Biomaterials，2011，32:7253)。不仅如此，多糖所具有的多羟基结构，为进一步的结构改造和修饰提供了可能(Biomaterials, 2013, 34:5689)。因此，多糖及其衍生物已成为一类具有巨大发展潜力和应用前景的非病毒基因传递载体。[0005]昆布多糖(funcoidan)是存在于海带科植物海带或翅藻科植物昆布中的一种天然多糖，在自然界中来源广泛，价格低廉。昆布多糖是由吡喃葡萄糖以1，3_糖苷键结合而成的多糖，具有免疫调节功能、抗炎、抗凝血、抗肿瘤、抗病毒和抗菌功能等等。例如，昆布多糖可以与乙酰肝素竞争性地与乙酰肝素酶结合，从而避免乙酰肝素酶的降解、保护基底膜的完整，进而阻止肿瘤细胞的浸润和迁移(Int J Cancer, 1999，83:424);昆布多糖还可以促进白细胞介素的分泌，从而促进T/B细胞的增生、分化，增强NK细胞自身活性，达到抗炎目的等等。在昆布多糖的分子结构中含有大量活性基团-0H，因此可以通过对-OH进行化学改性实现其不同的生物学活性，例如对昆布多糖进行不同程度的硫酸酯化，可以显著抑制人胰腺癌细胞BxPC-3的增殖，降低Bcl-2蛋白的表达，同时提高Bax蛋白的表达，抑制肿瘤细胞的促凝活性，从而达到肿瘤治疗的目的(重庆医学，2004，33:417)。因此，昆布多糖及其衍生物具有良好的药物、临床和医疗方面的应用前景。但是至今未见到有关阳离子化昆布多糖及其作为基因传递载体的公开报道。
[0006]针对上述情况，为解决现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种阳离子化昆布多糖及其制备方法和应用，可有效解决阳离子化昆布多糖的制备及实现在制备治疗癌症药物中的应用问题。[0007]本发明解决的技术方案是，该阳离子化昆布多糖是经化学键在昆布多糖上接枝聚乙烯亚胺构成，昆布多糖分子量为10_300kD,聚乙烯亚胺分子量为600-1200D,聚乙烯亚胺与昆布多糖的摩尔比为1:3-10 ;其制备方法是:
将昆布多糖与活化试剂反应，得活化的昆布多糖，再将活化的昆布多糖与聚乙烯亚胺反应，得聚乙烯亚胺修饰的昆布多糖，即阳离子化昆布多糖。
[0008]所述的活化试剂为高碘酸钾、羰基二咪唑、琥珀酸酐和马来酸酐的一种。
[0009]本发明的制备方法简单，操作方便，原料来源广泛，成本低廉，制备得到的阳离子化昆布多糖形态规则，粒径范围50-250 nm,分布均匀，结构稳定,生物相容性好,能够负载核酸类抗肿瘤药物高效转染至肿瘤细胞，实现肿瘤的治疗。

[0011]实施例1
本发明在具体实施中，该阳离子化昆布多糖是，将IOOmg昆布多糖加入到IOmL 二甲亚砜中，加入400mg马来酸酐和10mg4- 二甲胺基吡唆，50°C搅拌24h,然后加入IOmgl-乙基(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和5mgN-羟基琥拍酰亚胺,搅拌4h,最后加入300mg聚乙烯亚胺，室温搅拌48h，经透析，冷冻干燥，得到聚乙烯亚胺修饰的昆布多糖，即阳离子化昆布多糖。
[0012]实施例2
本发明在具体实施中，该阳离子化昆布多糖还可以是，将IOOmg昆布多糖加入到IOmL去离子水中，搅拌条件下加入150mg高碘酸钾，避光搅拌48h，然后将反应液装入透析袋中透析2d，得到氧化昆布多糖；将氧化昆布多糖加入至含有250mg聚乙烯亚胺(PEI)的5mL磷酸盐缓冲液中，Ih内滴加完毕，然后室温搅拌36h，最后加入150mg硼氢化钠，搅拌72h，经透析、冷冻干燥，得到聚乙烯亚胺修饰的昆布多糖，即阳离子化昆布多糖。
[0013]实施例3
本发明在具体实施中，该阳离子化昆布多糖还可以是，将100m g昆布多糖加入到SmL二甲基亚砜中，氮气保护条件下，依次加入100yLHZK，30mg羰基二咪唑，避光剧烈反应4h，然后向反应液中滴加IOOmg聚乙烯亚胺的二甲基亚砜溶液6mL，最后加入50μ L三乙胺，避光反应24h，反应液经透析、冷冻干燥，得到聚乙烯亚胺修饰的昆布多糖，即阳离子化昆布多糖。[0014]实施例4
本发明在具体实施中，该阳离子化昆布多糖还可以是，将IOOmg昆布多糖加入到IOmL 二甲亚砜中，加入400mg琥拍酸酐和10mg4_ 二甲胺基吡唆，50°C搅拌24h,然后加入IOmgl-乙基(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和5mgN-羟基琥拍酰亚胺,搅拌4h,最后加入300mg聚乙烯亚胺，室温搅拌48h，经透析，冷冻干燥，得到聚乙烯亚胺修饰的昆布多糖，即阳离子化昆布多糖。
[0015]本发明制备的阳离子化昆布多糖经多次反复实验，其效果非常好，取得了满意的有益技术效果，有关试验资料如下:
实验一:将不同质量的阳离子化昆布多糖加入到20yL去离子水中，加入2μ g质粒pEGFP-Cl，室温放置30min，进行0.7%琼脂糖凝胶电泳检测，实验结果显示，当加入2 μ g以上阳离子化昆布多糖时，DNA条带完全消失，这说明当阳离子昆布多糖高于或等于质粒DNA时，可以完全负载DNA，实验结果表明阳离子昆布多糖具有良好的核酸负载能力；人宫颈癌细胞Hela在含有10%胎牛血清的DMEM培养基和37°C、5%C02条件下常规培养，转染前16 h按照1.2 X IO4个/孔接种于96孔板，将8 μ g阳离子昆布多糖加入到2 μ g超纯水中，加入
2μ g质粒pEGFP-Cl，室温放置30min后转染细胞，转染48h后，流式细胞仪测定绿色荧光蛋白的表达量，实验结果显示绿色荧光蛋白的表达量为78.2%，实验结果表明阳离子昆布多糖能够将质粒pEGFP-Cl转染进细胞，并高效表达出绿色荧光蛋白。
[0016]实验二:人肝癌细胞SMMC-7721在含有10%胎牛血清的DMEM培养基和37°C、5%C02条件下常规培养，按照1.2 X IO4个/孔接种于96孔板，将不同质量的阳离子昆布多糖加入到培养基中，24h后，四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)测定细胞增殖，实验结果显示，随着阳离子昆布多糖含量的增加，细胞存活率稍有下降，但在0-100 μ g/mL的范围内，阳离子化昆布多糖对细胞生长没有抑制作用，试验结果表明阳离子昆布多糖具有良好的生物相容性。
[0017]实验三:人乳腺癌细胞MCF-7在含有10%胎牛血清的DMEM培养基和371:、5%0)2条件下常规培养，转染前16 h按照1.2 X IO4个/孔接种于96孔板，将阳离子昆布多糖与靶向c-fos的siRNA按照质量比为4/1进行混匀，室温温育30 min后转染细胞，转染48 h后，MTT检测细胞增殖，实验结果显示，细胞生长抑制率为46%，采用Trizol法提取细胞总RNA，用特异性c-fos引物和特异性β -actin引物进行RT-PCR反应，实验结果显示，靶基因表达抑制率为75%，实验结果表明阳离子昆布多糖/siRNA体系可以有效诱导RNA干扰效应，抑制肿瘤生长。
[0018]实验四:将8yg阳离子昆布多糖加入到2yg超纯水中，加入2yg质粒pAIRM-cmv-shT，室温放置30min，将阳离子昆布多糖和pAIRM-cmv-shT复合物的溶液滴在电镜观测所需的铜网上，待溶液晾干后用2%磷钨酸染色2min，待溶液再次晾干后，用投射电镜观察，实验结果显示，阳离子昆布多糖/pAIRM-cmv-shT复合物是一种球形或类球形的致密颗粒，平均粒径198nm ;将人肺腺癌上皮细胞A549在含有10%胎牛血清的DMEM培养基和37°C、5%C02条件下常规培养，收集对数期细胞，以生理盐水调整细胞悬液浓度为
2X IO7个/mL，皮下接种至雄性BALB/c裸鼠(4_6w，18_22g)右前肢上部，待肿瘤体积大于等于60mm3，将上述制备的阳离子昆布多糖/pAIRM-cmv-shT复合物通过尾静脉注射至小鼠体内，每5d给药一次，共给药3次，以注射生理盐水作为空白对照组，实验过程中观察小鼠生活状态，检测小鼠体重及肿瘤体积，实验结果显示，与生理盐水对照组相比，小鼠体重没有明显差异，但是肿瘤体积变化缓慢，肿瘤生长抑制率为64.7%，这说明阳离子昆布多糖/pAIRM-cmv-shT复合物显著抑制了肿瘤的生长。
[0019]在上述实验中，所用到的细胞株，质粒，核酸序列为:
1、细胞株:肝癌细胞SMMC-7721，乳腺癌MCF-7，宫颈癌细胞Hela，肺腺癌上皮细胞A549均购自中国科学院细胞库。
[0020]2、质粒:绿色荧光蛋白表达质粒pEGFP-Cl (GenBank登陆号U55763)购自BD Biosciences Clontech公司；祀向人端粒酶逆转录酶(hTERT)的RNA干扰质粒pAIRM-cmv-shT由本实验室构建，具体操作见Xueling Ren, etal.Plasmid，2011，65:42-50。
[0021]3、核酸序列:
(I)小干扰RNA (siRNA)序列:
靶向细胞原癌基因c-fos的siRNA序列:正义链，5’ -GCGGAGACAGAUCAACUUGTT-3’ ；反义链，5’ -CAAGUUGAUCU⑶CUCCGCTT-3’。
[0022](2)用于逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)的引物
特异性c-fos引物:上游引物，5’ -CCGACTCCTTCTCCAGCAT-3’ ；下游引物5， -TCACCGTGGGGATAAAGTTG-3，。
[0023]特异性肌动蛋白(β- actin )引物:上游引物，5 ’ -CTGGGACGACATGGAGAAAA-3 ’ ；下游引物 5’ -AAGGAAGGCTGG AAG AGTGC-3’。
[0024]但所用细胞株，载体DNA和核酸不是用来限制本发明的范围，而是用于作为实施例来说明本发明的有益技术效果。
[0025]在实验中，所述阳离子化昆布多糖作为基因传递载体在肿瘤治疗中的应用，还包括将抗肿瘤基因治疗药物与阳离子化昆布多糖混合，然后进行抗肿瘤细胞和体内抗肿瘤的生物学评价。
[0026]所述抗肿瘤基因治疗药物为:装载有治疗基因的质粒DNA、装载有治疗基因的病毒载体DNA、反义寡核苷酸、小干扰RNA中的一种或几种。
[0027]所述的肿瘤细胞为人器官表面或内部出现的各种实体瘤细胞，包括乳腺癌细胞、肺癌细胞、肝癌细胞、鼻咽癌细胞、食管癌细胞、卵巢癌细胞、前列腺癌细胞、肾癌细胞、胃癌细胞、阴茎癌细胞、睾丸癌细胞、皮肤癌细胞、白血病细胞、胰腺癌细胞、舌癌细胞、恶性黑色素瘤细胞中的一种。
[0028]所述的肿瘤为人器官表面或内部出现的各种实体瘤，包括乳腺癌、肺癌、肝癌、鼻咽癌、食管癌、卵巢癌、前列腺癌、肾癌、胃癌、阴茎癌、睾丸癌、皮肤癌、白血病、胰腺癌、舌癌、恶性黑色素瘤中的一种。
[0029]由上述表明，本发明阳离子昆布多糖经反复多次试验，均取得了满意的有益的技术效果，充分证明，本发明通过将聚乙烯亚胺连接到昆布多糖，克服了昆布多糖已知的缺点，本发明中的阳离子昆布多糖水溶性好，物理以及化学性质稳定，制备条件容易满足，材料来源丰富，制备成本低，生物相容性好，核酸负载能力强，阳离子化昆布多糖作为一种良好的抗肿瘤基因治疗载体，并将其用于基因治疗领域，有效实现了阳离子化昆布多糖作为基因传递载体在肿瘤治疗药物中的应用，制备方法简单，开辟了肿瘤治疗的药物新途径，具有巨大的经济和社会效益。