一种利用空心电极针电穿孔给药的装置制造方法[0002]二十世纪七十年代曾发现:电场能够在细胞上产生一些细孔，而不造成细胞永久性的损伤。这项发现使分子进入细胞质成为可能。人们知道借助所谓的电穿孔能够将基因和其他的分子，如药物化合物引入活细胞。基因或药物与活细胞在缓冲介质中混合，然后施加强电场的短脉冲。这样，细胞膜瞬时变成多孔的，于是基因或分子进入细胞。在那里它们能够改善细胞的基因组。[0003]利用电场通过电穿孔疗法(EPT)在活体内将药物化合物和基因输送到细胞中，所述的电穿孔疗法亦可称作细胞穿孔疗法(CPT)或电化疗法(ECT)。利用细胞穿孔疗法进行治疗提供了一种避免产生通常与服用抗癌药或细胞毒制剂相伴随的副作用的方法。这种疗法使得人们可以引入这些制剂来选择性地杀伤或杀死所不需要的细胞，同时避免杀伤或杀死周围的健康细胞或组织。[0004]电穿孔的一项治疗应用是用于癌症的治疗。已经利用试验哺乳动物进行了实验，已发表的报告如下:0 kino, Μ., E.Kensuke, “The Effects of a Single High VoltageElectrical Stimulation with an Anticancer Drug on in vivo Growing MalignantTumors”，Jap.Journal of Surgery, vol.20:197-204，1990。Mir, L.M.，S.0rlowski,J.Belehradek Jr.，和 C.Paolett1.“Electrochernotherapy Potentiation of AntitumorEffect of Bleomycin by Local Eletric pulses，，，Eur.J.Cancer, vol.27:68_72，1991。Mir，L M.，M.Belehradek, C.Domengem，S.0rlowski, B.Poddevin 等人已经进行了临床实验并且发表了? 艮告“Electrochemotherapy，a novel anti tumor treatment:first clinicaltrial’’，C.R.Acad.Sc1.Paris.，vol313:613—618，1991。[0005]体内电穿孔一般只局限于应用到靠近生物体的皮肤的组织或细胞上，在这些部位上能够放置电极。因此，用于电穿孔的电极一般不能接近如肿瘤一类的能够以全身性药物输送方式或化疗方式进行治疗的组织。在用化疗方法治疗某些类型的癌症时，需要在不杀死太多的正常细胞的前提下釆用足够大剂量的药物来杀死癌细胞。如果能够将化疗药物直接注入到癌细胞中，则可以达到这一目的。有些抗癌药，如博莱霉素，通常不能有效地穿透某些类型的癌细胞的细胞膜。但是，釆用电穿孔方法就能够将博莱霉素注入到细胞中。[0006]进行治疗的方法通常是，将一种抗癌药直接注射到肿瘤中，然后向处于一对电极之间的肿瘤施加一个电场。必须以适当的精确度对电场强度进行调节，以便能够在不损伤、或者至少是最小程度地损伤正常的或健康的细胞的前提下对肿瘤细胞进行电穿孔。对于体表的肿瘤，通常可以在肿瘤的两侧施加一对电极，使电场产生于这对电极之间，由此很方便地实施电穿孔。在电场是均强电场的情况下，可以先测出电极间的距离，然后按照公式E =V / d (E=电场强度，单位是伏/厘米；V =电压，单位是伏；d=距离，单位是厘米)将大小合适的电压加到电极上。当要治疗大的或身体内部的肿瘤时，就很难合适地放置电极并测量电极间的距离。在前面提到的专利申请中公开了一种用于体内电穿孔的电极系统，其中的电极能够被插入到肿瘤中。[0007]这种治疗方法是直接将抗癌药物渗入肿瘤，并且给位于一对电极之间的肿瘤施加电场。电场强度必须合理地精确调节，以实现对肿瘤细胞的电穿孔，而不损伤任何正常细胞即健康的细胞。这种疗法对于外部的肿瘤通常容易实施，具体作法是将电极置于肿瘤两侦牝以使在电极之间产生电场。然后，测量电极之间的距离山并且按照公式:E = V / d将适当的电压加到电极上。[0008]研究工作业已表明大型核苷酸序列(高达630kb)能够经电打孔导入哺乳动物的细胞，并借此提供一种基因治疗方法。
[0009]在相关的美国专利5，273，525中，用于电打孔注入分子和大分子的注射器是同时起电极作用的注射针，这些针头同时还起着电极的作用。这种结构使电极在皮下的部位起作用。实际需要的是有一个电极装置，该装置具有能够插入肿瘤或接近肿瘤的电极，以致能够在该组织中产生肿瘤细胞电穿孔所需的预定的电场。
[0010]但是由于使用注射器进行电穿孔时，往往难以调整电极产生的电场强度，且电场强度的不均匀导致大量正常细胞损伤，更大的缺陷是，在实际操作过程中带有电极的注射针难度大，对操作人员要求高，但对药物使用的效率却不高，增大了病人治疗过程的痛苦。
[0011]本发明为了克服上述缺陷，主要解决的技术问题是提供一种能够无创伤或微创伤进入人体内，能够实时监控精确定位，精确控制给药量和给药深度，可以精确调节电场强度的电穿孔给药装置。是通用性强、电穿孔效率高、无化学污染、减少了对正常细胞造成损伤、能提高药物使用的效率、缩短治疗时间、减轻了病人治疗时的痛苦的体内电穿孔给药装置。


[0012]本发明克服了上述现 有技术中的不足，本发明的目的之一是提供了一种可实时监控细胞电穿孔的给药装置，其具有施药头、控制台；本发明的另一目的是提供一种提供稳定均匀的电场，并同时将分子药物给药到细胞中的方法。
[0013]为了达到上述的目的，本发明所提供的可实时监控细胞电穿孔的装置的技术方案概述如下:
[0014]一种利用空心电极针电穿孔给药的装置，包括，一个施药头，一个控制台及连接施药头和控制台的导管；其特征在于:
[0015]所述的施药头包括万向节，摄像头，照明灯，药物传输结构，电连接器，格栅，空心电极针阵列，可伸缩的构建；
[0016]所述的空心电极针阵列包括至少两个空心电极针，并彼此保留间隔，所述空心电极针按时间周期分别施加第一极性的电脉冲和第二极性的电脉冲，其中，所述第一极性的电脉冲对应的电极的周围分布的都是第二极性的电脉冲对应的电极；
[0017]所述的至少两个空心电极针用于电穿孔，被安装在万向节和格栅之间，通过一个电连接器将空心电极针与电源相连接，空心电极针同时与分子药物传输结构相连接，分子药物能够通过空心电极针输入组织；
[0018]所述的可伸缩的构建与空心电极针末端紧密连接，用于使与它相连的空心电极针从一个收缩的状态移动到一个伸出的状态，在所述的收缩的状态下，所述的格栅处于关闭状态，而在所述的伸出的状态下，所述的格栅处于打开状态；
[0019]所述的控制台包括一个用于观察摄像头影像的显示器，一个用于控制万向节的摇杆，一个用于控制电压脉冲发生的远距离启动装置；一个用于控制分子药物传输发生的远距离启动装置；一个用于控制格栅开合的启动装置；一个用于控制可伸缩的构建伸缩的启动装置；一个储存分子药物的结构，以及输送分子药物的泵；一个用于控制输送分子药物的泵启动的装置；一个用于产生电压脉冲的电源；
[0020]所述控制台通过导管内铺设的线路与施药头内部的电连接器相连接，所述的启动装置被集成在触摸屏中。
[0021]优选的，所述空心电极针的材料选自不锈钢、钼、金、银、铜、或其他导电材料中的一种或几种。
[0022]优选的,所述空心电极针包括绝缘部分和/或非绝缘部分。
[0023]优选的，所述空心电极针包括直或弯曲的电极，所述弯曲的电极包括弯曲部分或有曲率半径的部分。
[0024]优选的，所述空心电极针的直径为0.01-1.5mm。
[0025]优选的，所述空心电极针阵列限定为正多边形排列或圆柱形排列，包括4、6、8、9、16、18、24、32、64根针，且电极阵列中相邻的两个电极之间的距离相等。
[0026]优选的，所述空心电极针可以从可伸缩的构建上拆卸下来。
[0027]优选的，所述释放的分子药物包括化疗药物、多核苷酸以及多肽中的一种或多种物质。
[0028]优选的，所述释放的化疗药物选自博菜霉素、新制癌菌素、碳钼、苏拉明、阿霉素、丝氨霉素、顺氯氨钼中一种或多种物质。
[0029]优选的，所述的组织包括胰脏、喉部、鼻因部、口咽部、肺、心脏、肾、肌肉、乳腺、结肠、前列腺、胸腺、睾丸、卵巢中的一种。
[0030]优选的，所述空心电极针产生施加给组织的电场，该电场的强度在0.2V / cm至20kv / cm，脉冲数在1-100之间，每次脉冲的持续时间在10-100微秒之间。
[0031]一种向组织传送电场的方法，包括，将本发明的电穿孔给药装置的空心电极阵列定位在目标组织区域内，对所述空心电极阵列施加电流。
[0032]一种使用空心电极针电穿孔给药装置将分子药物导入组织细胞的方法，包括，将本发明的电穿孔给药装置的空心电极阵列定位在目标组织区域内，对所述空心电极阵列施加电流，将分子药物释放到组织中。
[0033]一种利用本发明电穿孔给药的装置将分子药物导入组织的用途。
`[0034]本发明与现有技术相比，有益的效果是:
[0035]本发明的电穿孔装置提供一种能够无创伤或微创伤进入人体内，能够实时监控精确定位，精确控制给药量和给药深度，可以精确调节电场强度的电穿孔给药装置。是通用性强、电穿孔效率高、无化学污染、减少了对正常细胞造成损伤、能提高药物使用的效率、缩短治疗时间、减轻了病人治疗时的痛苦的体内电穿孔给药装置。并且本发明的电穿孔装置操作简单，实用性强，治疗效果好。


[0036]为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图，其中:
图1是给药装置控制台和施药头整体示意图；
图2是栅门处于关闭状态的施药头示意图；
图3是栅门半开，电极阵列收缩状态的施药头示意图；
图4是电极阵列伸出状态的施药头示意图；
图5是电极阵列收缩状态的施药头剖面示意图；
图6是控制台上触摸屏中各启动装置按钮示意图；
其中，1、施药头I ;2、控制线和导管；3、万向节控制摇杆；4、触摸屏；5、药液；6、输液泵；7、摄像头显示屏；8、万向节；9、处于关闭状态的栅门；10、摄像头；11、照明灯；12、空心电极阵列；13、分子药物传输结构；14、电连接器；15、可伸缩的构建。

[0037]下面将对发明实 施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
[0038]实施例:
[0039]下面结合附图和对本发明作进一步详细描述:
[0040]给药装置的控制台
[0041]图1是给药装置控制台和施药台整体示意图。控制台包括一个用于观察摄像头影像的显示器7，一个用于控制万向节的摇杆3，一个用于控制电压脉冲发生的远距离启动装置a 个用于控制分子药物传输发生的远距离启动装置b 个用于控制格栅开合的启动装置c ;一个用于控制可伸缩的构建伸缩的启动装置d ;—个储存分子药物的结构5，以及输送分子药物的泵6 个用于控制输送分子药物的泵启动的装置e ;所述控制台通过导管内铺设的线路2与施药头I内部的电连接器相连接，所述的启动装置被集成在触摸屏4中。脉中持续时间、电压的大小、电极针的寻址或者开关模式都可由触摸屏4中的程序来控制。触摸屏4显示出脉冲电压的给定值。显示器7显示出摄像头中的实时画面，有助于医生调整寻找的区域，以及施用分子药物的时机。交流电源输入以电隔离的方式为整个控制台提供能量。直流电源输入为整个控制台提供合适的能量。高压电源的输入为提供电穿孔所需要的合适的电压。
[0042]给药装置的施药头
[0043]图2是栅门处于关闭状态的施药头示意图。所述的施药头包括万向节8,摄像头10，照明灯11，分子药物传输结构13，电连接器14，格栅9，空心电极针阵列12，可伸缩的构建15。万向节用于调整施药头的旋转方向，操作人员可以通过控制操作台上的控制摇杆控制万向节的寻址。摄像头能够实施监测施药头前方的影像，优选的实施例是摄像头具有广角。照明灯为组织内部的电穿孔提供光源。[0044]图3是栅门半开，电极阵列收缩状态的施药头示意图。所述的可伸缩的构建与空心电极针末端紧密连接，用于使与它相连的空心电极针从一个收缩的状态移动到一个伸展的状态，在所述的收缩的状态下，所述的格栅处于关闭状态，而在所述的展开的状态下，所述的格栅处于打开状态。
[0045]空心电极阵列
[0046]图4是根据本发明的一个实施例的空心电极阵列伸出状态的施药头结构示意图。空心电极针既可以是尖的，也可以是钝的，并且可以具有任何一种需要的长度。空心电极针的材料必须是导电的，但不一定非得是金属的或同一种材料的(即，可以采用复合的或层状的结构，例如可以采用金属镀膜的塑料针或者陶瓷针)。空心电极针阵列包括至少两个空心电极针，并彼此保留间隔，所述空心电极针按时间周期分别施加第一极性的电脉冲和第二极性的电脉冲，其中，所述第一极性的电脉冲对应的电极的周围分布的都是第二极性的电脉冲对应的电极。空心电极针末端与可伸缩的构建紧密连接，用于使与它相连的空心电极针从一个收缩的状态移动到一个伸展的状态。空心电极针被安装在万向节和格栅之间，通过一个电连接器将空心电极针与电源相连接，空心电极针同时与分子药物传输结构相连接，分子药物能够通过空心电极阵列中的一个或多个空心的电极针输入组织。在不同的实施例中，空心电极针可以组成方形、六角形或圆形的阵列。但是，也可以采用其它形状。
[0047]在一个实施例中，本发明提供了一种用于向受试者的组织施行电穿孔治疗以便将分子药物引入到所述组织的细胞内的方法，该方法包括以下步骤:提供一个空心电极阵列，将电极阵列放置在组织周围以便形成均一稳定的电场，向电极施加高幅度的电信号脉冲，以便对组织进行电穿孔，所述的信号幅度与电极间的距离成正比。
[0048]应当理解，对组织的电穿孔可以在体外或者体内或者离体进行。还可以利用单细胞施行电穿孔，例如利用单细胞悬浮液或者体外或离体细胞培养物进行电穿孔。
[0049]优选的，在进行电穿孔治疗的同时给入分子药物，即给入分子药物的时间和进行电穿孔治疗的时间同步进行。可以在任何一个时间段内给入分子药物或治疗药剂，这个时间段取决于这类因素，例如肿瘤的性质，病人的情况，分子药物的大小和化学特性以及分子药物的半衰期。`
[0050]例如，当将药物直接注入到肿瘤中时，最好是以一种“扇型”的方式注射药物。“扇型”的含意是，在注射药物时通过改变针的方向来给药，或者通过在象一个张开的手掌那样的多个方向上多次注射药物，而不是以团块的形式注入药物，来达到使药物在整个肿瘤中分布更广的目的。与本领域中通常采用的量相比，当在肿瘤内给入(例如注射)药物时，最好增加含有药物的溶液的量，以确保药物在整个肿瘤中的适当分布。在实际应用中，最好是围绕着底部以扇型的方式非常缓慢地进行注射。尽管在肿瘤中央的间隙压力非常高，但这个部位常常也是肿瘤坏死区。
[0051]电穿孔给药方法
[0052]利用本发明电穿孔装置可以通过电穿孔的方法使多种不同的高分子化合物进入细胞，包括核酸类(质粒DNA，线性DNA，小干扰RNA，反义核酸)，蛋白类(肽段，抗体)，抗体，多核苷酸包括DNA，cDNA以及RNA序列。优选的质粒是真核表达载体(pEGFP_C3)，本领域技术人员可以自行选择各种真核，原核表达载体使用。
[0053]用于本发明的方法中的药物可以是具有抗肿瘤作用或细胞毒作用的化疗制剂。这些药物或制剂包括博菜霉素，新制癌菌素，苏拉明，阿霉素，碳钼，紫杉酚，丝裂霉素C以及顺氯氨钼。其它化疗制剂是本领域的技术人员公知的(例如，参见The Merck Index)。
[0054]优选的，本电穿孔装置可以电穿的组织包括胰脏、喉部、鼻咽部、口咽部、肺、心脏、肾、肌肉、乳腺、结肠、前列腺、胸腺、睾丸、卵巢中的一种。任何细胞都可以用本发明的方法处理。文中提出的实施例说明本发明方法在处理肿瘤细胞，如胰和肺中的癌细胞中的运用。其它细胞增生机能失调也可以借助本发明的电打孔方法处理。术语“细胞增生机能失调”指的是恶性的以及良性的细胞群体，该群体往往在形态上和遗传基因上不同于周围组织。恶性细胞(即肿瘤或癌)的发展是多个步骤的结果。本发明的方法在处理恶性肿瘤或各种器官系统的机能失调当中是有用的，例如，在处理胰和肺中的细胞时特别有用，也还包括心脏、肾、肌肉、乳腺、结肠、前列腺、胸腺、睾丸以及卵巢中的细胞。优先选择的对象是人的细胞。
[0055]具体实施例一
[0056]利用本发明的装置在小鼠活体内对肿瘤细胞施药治疗。首先在培养基内培养鼠乳癌细胞，通过将细胞从培养基移植到小鼠的腹部形成皮下瘤，当癌细胞生长到直径约Icm或更大时，进行电穿孔治疗。小鼠选择体重在230-250克雌性鼠进行测试，对小鼠上的30个实体乳房瘤进行治疗。采用未进行电穿孔治疗的小鼠中的乳房瘤作为对照。
[0057]—个治疗过程包括以下步骤:(I)使用酒精溶液对施药头整体进行清洗消毒，检查电路是否稳定，格栅是否能够开启，电极阵列是否能够伸缩，测试各个启动装置是否正常，测试万向节控制摇杆是否正常；(2)将施药头伸入体内，通过摄像头显示屏调整伸入的区域，找准要施药的部位；(3)启动格栅控制装置，开启格栅；(4)，启动可伸缩的构建的控制装置，将电极阵列(空心电极针是沿着一个直径为I厘米的圆周放置的，空心电极针阵列的直径为I厘米)伸展出施药头，并控制伸展出的长度；(5)通过控制万向节摇杆控制电极阵列所对的肿瘤细胞；(6)通`过启动控制输送分子药物的泵将博菜霉素(0.15毫升的盐水中含0.5个单位)注射到小鼠肿瘤周围，启动电脉冲，通过施药头内部的电连接器对电极进行切换，施加6个方波电脉冲，以使脉冲场能够最大程度地覆盖肿瘤。电学参数是:中央电场强度为780伏/厘米.6X99微秒的脉冲，间隔为I秒。
[0058]结果显示，在几乎所有小鼠的治疗部位上都出现严重的坏死和浮肿。在被治疗组中的小鼠身上的肿瘤的体积明显减小，而对照组中的小鼠身上的肿瘤的体积明显增大。对肿瘤样本所进行的组织学分析显示，在治疗组中只有坏死的肿瘤细胞的空胞。研究表明，用电穿孔+博菜霉素同时进行治疗取得了鼓舞人心的结果。
[0059]以上所述仅是本发明的优选实施方式，但并不限制本发明，不能认定本发明的实施方式只局限于这些实施例。应当指出，对于本【技术领域】的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理和构思的前提下，还可以做出若干改进或润饰，都应视为本发明的保护范围。