保护免受上呼吸道感染的非复制性益生菌微生物的制作方法[0001]本发明涉及非复制性益生菌微生物及其健康益处。例如，本发明涉及包含非复制性益生菌微生物的组合物，其用于治疗或预防上呼吸道感染和/或其症状。本发明的实施方案提供了帮助父母保护其孩子免受此类上呼吸道感染的方法。[0002]已知产生乳酸作为主要代谢成分的生物很长时间了。这些细菌可分别发现于乳或乳加工厂中，活的或腐烂的植物中，也可发现于人和动物的肠内。在术语“乳酸菌”下概括的这些微生物代表了非常不同类的一组，并包含例如乳球菌属(Lactococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、链球菌属(Streptococcus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、片球菌属(Pediococcus)等。 [0003]由于受益于在乳酸菌的发酵活动过程中产生的发酵产物的低pH及抑制腐败菌的生长的作用，所以乳酸菌已经被用作发酵剂用于食品保藏。此外，乳酸菌也已经被用于从乳制备多种不同的食品，如乳酪、酸奶和其他发酵乳制品。近来，乳酸菌已经引起了很多关注，这是因为已经发现一些菌株在摄取后显示出对人和动物有价值的性质。特别地，已经发现乳杆菌属或双歧杆菌属的特定菌株能够寄居在肠粘膜上，并帮助维持人和动物的安康。[0004]在这方面，EP0768375公开了双歧杆菌属的特定菌株，其能够移植到肠内微生物区系中并可以粘附肠细胞。据报道这些双歧杆菌帮助免疫调节，能够竞争性地排除病原菌粘附肠细胞，从而帮助维持个体的健康。[0005]研究也已经聚焦在乳酸菌作为益生菌剂的潜在用途上。认为益生菌是有生活力的微生物制剂，其通过保护肠内的天然微生物区系而促进个体健康。认为益生菌附着到肠粘膜上，寄居在肠道内并且也防止有害微生物附着其上。它们起作用的至关重要的前提在于它们必须以适当且存活的形式到达肠粘膜并且在胃肠道上段不被破坏，尤其是不被胃中普遍的低pH影响所破坏。[0006]同时，研究工作的部分目标在于提供额外的益生菌菌株，其显示出对人和/或动物，如宠物有益的新性质。[0007]例如，W02008042101提供了用于降低儿童中的呼吸系统疾病的方法，其包括:提供嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)的培养物；提供处于发展成呼吸系统疾病风险的儿童；并且在一定条件下将嗜酸乳杆菌的培养物施用于处于风险的儿童，以使发展成呼吸系统疾病的风险降低。[0008]然而，将活的益生菌加入到产品中，以使它们直到消费时仍保持生活力不是容易的工作。特别是对于具有较长储存时间的产品，这很难实现，并且可能需要额外的技术努力。[0009]因此，期望的是得到这样的组合物，其可以提供益生菌的益处，同时易于制备和储存，而不会丢失活性。
[0010]本发明人旨在提供这样的组合物，其帮助父母保护他们自身及其孩子免受上呼吸道感染。所述组合物应易于制备并且即使产品可能会储存较长时间，所述组合物的活性应当保持在高水平。该组合物应允许安全地治疗或预防上呼吸道感染，而无副作用。应减少上呼吸道感染将持续的时间。还应降低发生上呼吸道感染的风险。[0011]因此，本发明的目标是为本领域提供组合物，所述组合物处理了上文表述的一种或多种需要。
[0012]本发明人惊奇的看到通过独立权利要求的主题能实现该目的。从属权利要求进一步发展了本发明的思想。
[0013]因此，本发明涉及包含非复制性益生菌微生物的组合物，其用于预防或治疗上呼吸道感染。
[0014]本发明还涉及非复制性益生菌微生物在制备这样的组合物中的用途，所述组合物治疗或预防上呼吸道感染。
[0015]本发明组合物可以在秋季和/或冬季期间施用。在此期间，患上呼吸道感染的概率特别高。
[0016]例如，可以在早晨施用组合物，以在这一天中增强身体针对上呼吸道感染的防御系统。
[0017]可以将本发明的组合物施用于人类或宠物。宠物可以是例如狗或猫。
[0018]儿童很可能患上呼吸道感染，因为例如在学校或者在幼儿园，他们与许多其他个体紧密接触。
[0019]因此，可以将本发明组合物施用于儿童，例如施用于婴儿或幼儿。
[0020]对于人而言，儿童至18岁。幼儿至12岁，而婴儿是12个月以下的儿童。
[0021]“非复制性”益生 菌微生物包括已经受到热处理的益生菌。这包括灭活的、死的、无生活力的和/或以碎片如DNA、代谢物、胞质化合物和/或细胞壁物质存在的微生物。
[0022]“非复制性”指的是通过经典的平板接种方法可以检测的无生活力的细胞和/或菌落形成单位。在微生物书中概述了这些经典的平板接种方法:James Monroe Jay, MartinJ.Loessnerj David A.Golden.2005.Modern food microbiology.7th edition, SpringerScience, New York, N.Y.790p。通常地,存活细胞的缺失可以按照以下显示:用不同浓度细菌制备物(“非复制”的样品)接种并且在适合的条件(有氧和/或厌氧空气中持续至少24小时)下培育后，在琼脂平板上没有可见的菌落或者在液体生长培养基中没有增加的浊度。
[0023]为本发明的目的将益生菌定义为“对宿主的健康或者安康有有益作用的微生物细胞制剂或者微生物细胞组分”(Salminen S，Ouwehand A.Benno Y.等人“Probiotics:howshould they be defined” Trends Food Sc1.Technol.1999:10107-10)。
[0024]使用非复制性益生菌微生物的可能性提供了几个好处。在严重的免疫受损的婴儿或幼儿中，在特殊的情况下由于患上菌血症的潜在风险，活的益生菌的使用受到限制。可以没有任何问题地使用非复制性益生菌。
[0025]另外，非复制性益生菌微生物的提供在保留健康益处的同时允许热重构。
[0026]本发明的组合物是任何类型的组合物，其适合于对人或宠物施用。因此，该组合物可以是食品、宠物食品、营养制品、食品补充剂、粉末营养组合物、食品添加剂或饮料。
[0027]上呼吸道感染可以选自鼻炎、鼻窦炎、鼻咽炎、咽炎、会厌炎、喉炎、喉气管炎、气管炎或其组合。
[0028]上呼吸道感染的症状可以选自咳嗽、咽喉痛、流鼻涕、鼻充血、头痛、低热、面部胀感(facial pressure)、打喷嚷及其组合。
[0029]由于上呼吸道感染通常与不适以及行为和注意力丧失相关，因此需要保护儿童免受此类感染。
[0030]本发明人惊奇的看到，例如在免疫增强效应方面和/或在抗炎效应方面，非复制性益生菌微生物比复制性益生菌微生物更有效。
[0031]此外，经热处理的非复制性Lal(NCC533，保藏号CNCM 1-1225)强烈地诱导防卫素表达。防卫素是人体中抗微生物肽的最重要类型中的一种。防卫素由肺、皮肤、口腔、泌尿生殖道、呼吸道和胃肠道的上皮细胞产生。其中，有包括防卫素UhBD1)和防卫素2(hBD2)的防卫素家族。例如，发现经热处理的约氏乳杆菌(Lal，NCC533，保藏号CNCM 1-1225)比它的活的对应物更强的上调hBDl。hBDl展示对广谱细菌包括大肠杆菌和绿脓杆菌、幽门螺杆菌(H.pylori )的抗菌活性(Nuding, S.,等人.,2009, Microbes.1nfect.11:384-393)，同时也展示对酵母如白假丝酵母(0’Neil，D.A.2003，Mol.1mmunol40:445-450)的抗菌活性和对病毒(人免疫缺陷病毒)(Kota, S.Et al.，2008，J.Biol.Chem283:22417-22429)的抗病毒活性。因此，这些抗微生物多肽将增强黏膜屏障并且因此限制细菌的黏附和侵入。
[0032]因此，本发明的组合物可用于保护儿童免于上呼吸道感染。
[0033]特别地，本发明的组合物将允许父母保护他们的孩子免于上呼吸道感染。
[0034]本发明的组合物还可用于增强儿童对抗上呼吸道感染的能力。儿童的活跃的生活方式对其发育非常重要，但也涉及与许多可能的传染源接触。对不想要的感染的强防御机制将支持他们的安康。
[0035]因此，根据本发明的组合物还可用于帮助儿童更少地发生上呼吸道感染。儿童发生上呼吸道感染的概率可以降低至少10%、至少25%、至少30%，或优选至少50%。
[0036]本发明组合物的改善的抗炎性质、改善的免疫增强效应和/或通过本发明组合物上调的防卫素表达将增强防御机 制，导致更少的上呼吸道感染。
[0037]本发明的组合物还可用于减少上呼吸道感染将持续的时间。例如，上呼吸道感染将持续的时间可以减少至少10%、至少25%、至少30%，或优选地至少50%。
[0038]因此，本发明的非复制性益生菌代表了药物的安全且天然的备选。
[0039]本发明的组合物可以进一步地包含益生元。在益生菌成为非复制性细菌之前益生元可以支持益生菌的生长。“益生元”指的是不能消化的食物物质，其促进健康有益的微生物和/或益生菌在肠中的生长。益生元在胃中和/或肠的上段不被分解并且在摄食它们的人的胃肠道中不被吸收，但是它们被胃肠道微生物群和/或益生菌发酵。例如Glenn R.Gibson 和 Marcel B.Roberfroid, Dietary Modulation of the Human ColonicMicrobiota:1ntroducing the Concept of Prebiotics, J.Nutr.1995125:1401-1412 中定义了益生元。
[0040]根据本发明可以使用的益生元没有特别地限制并且包括促进益生菌或健康有益的微生物在肠中生长的所有食物物质。优选地，它们可以选自任选地包含果糖、半乳糖、甘露糖的寡糖；膳食纤维，特别是可溶性纤维、大豆纤维；菊粉或者它们的混合物。优选的益生元是低聚果糖(FOS)、低聚半乳糖(GOS)、低聚异麦芽糖(MO)、低聚木糖(XOS)、低聚阿拉伯-木糖(AXOS)、低聚甘露糖(MOS)、大豆低聚糖、葡萄糖基蔗糖(GS)、乳蔗糖(LS)、乳酮糖(LA)、帕拉金糖(palatinose)低聚糖(PAO)、低聚麦芽糖、树胶和/或其水解产物、果胶和/或其水解产物。例如，该组合物可以包含低聚果糖、菊粉或者它们的组合。
[0041]根据本发明的组合物可以包含任何有效量的非复制性益生菌微生物，例如相应于约IO6至1012cfu/g干重的量的非复制性益生菌微生物。
[0042]本发明的组合物包含足够至少部分产生健康益处的量的非复制性益生菌微生物。将足够实现该目的的量定义为“治疗有效剂量”。用于该目的的有效量将取决于本领域技术人员已知的很多因素如儿童的体重和一般健康状况以及食品基质的影响。
[0043]在预防应用中，根据本发明的组合物以一定量施用给易感染病症或者处在该病症的风险中的人，所述量足够至少部分地降低患上这种病症的风险。这种量被定义为“预防有效剂量”。再次，该精确量取决于很多因素如儿童的健康状况和体重以及食品基质的影响。
[0044]本领域技术人员将能适当地调节治疗有效剂量和/或预防有效剂量。
[0045]一般本发明的组合物含有治疗有效剂量和/或预防有效剂量的非复制性益生菌微生物。
[0046]通常，治疗有效剂量和/或预防有效剂量在每日剂量约0.005mg -1OOOmg非复制性益生菌微生物范围内。
[0047]在数值的量方面，经“短时间高温”处理的非复制性益生菌微生物可以在组合物中以相应于IO4至IO12当量cfu/g干组合物的量存在。显然，非复制微生物不形成菌落，因此，该术语将被理解为从IO4至1012cfu/g复制细菌得到的非复制微生物的量。该非复制微生物包括灭活的、无生活力的、死的或以碎片如DNA或细胞壁或胞质化合物存在的微生物。换句话说，组合物包含的微生物的数量用该数量微生物的菌落形成能力(cfu)表述，就好像全部微生物是存活的，而不考虑事实上它们是非复制的如灭活的或者死的、碎片化的或者这些状态的任一个或者全部的混合。
[0048]优选地，非复制性 益生菌微生物以相当于IO4至109cfu/g干组合物的量，更优选地以相当于IO5至109cfu/g干组合物的量存在。
[0049]益生菌可以通过本领域已知的任何方法成为非复制性的。
[0050]使益生菌菌株成为非复制性益生菌的如今可得到的技术通常是热处理、Y -照射、紫外线或者使用化学试剂(福尔马林、多聚甲醛)。
[0051]优选地使用在食品工业中工业环境下相对容易应用的技术来使益生菌成为非复制性益生菌。
[0052]今天市场上包含益生菌的大部分产品在它们的生产中是经热处理的。因此，方便的是能对益生菌与生产的产品一起进行热处理或者至少以相似的方式处理，同时益生菌保留或者改进它们的有益性质或者甚至获得对于消费者新的有益性质。
[0053]然而，在文献中通过热处理失活益生菌微生物通常与益生菌活性的至少部分损失相关联。
[0054]本发明现在人惊奇的发现，例如通过热处理使益生菌微生物成为非复制性益生菌不会导致益生菌健康益处的损失，而是相反-可以增强现存的健康益处并且甚至产生新的健康益处。
[0055]因此，本发明的一个实施方案是组合物，其中所述非复制性益生菌微生物通过热处理成为非复制性的益生菌。
[0056]这种热处理可以在至少71.5° C进行至少I秒。
[0057]可以使用长期热处理或者短期热处理。
[0058]今天在工业规模上，通常优选的是短期热处理，如UHT样的热处理。该类型的热处理减少了细菌负荷，并且减少了加工时间，因此减少了营养的破坏。
[0059]本发明人第一次证实经高温短时间热处理的益生菌微生物显示抗炎免疫谱而不管它们起始的性质如何。特别地，通过该热处理发展了新的抗炎谱或增强了现存的抗炎谱。
[0060]因此通过使用对应于通常工业可应用的热处理的特定的热处理参数可能产生具有抗炎免疫谱的非复制性益生菌微生物，即使该非复制性益生菌微生物的活的对应物不是抗炎菌株。
[0061]因此，例如热处理可以是在约71.5-150° C下约1_120秒的高温处理。高温处理可以是高温/短时间(HTST)处理或者超高温(UHT)处理。
[0062]益生菌微生物可以在约71.5-150° C下进行约1_120秒的短期高温处理。
[0063]更优选地，微生物可以在约90-140° C，例如90° -120° C下进行约1_30秒的短
期高温处理。
[0064]这种高温处理使微生物至少部分成为非复制性的。
[0065]高温处理可以在正常大气压下进行，但也可以在高压下进行。典型的压力范围是I至50巴，优选I至10巴，更优选2至5巴。显然，如果益生菌在液体或者固体培养基中进行热处理，当加热时，压力是优选的。因此应用的理想压力将取决于提供微生物的组合物的性质和使用的温度。
[0066]高温处理可以在约71.5-150° C，优选地约90-120 ° C，甚至更优选地约120-140° C的温度范围内进行。
[0067]高温处理可以在约1- 120秒，优选地约1-30秒，甚至更优选地约5_15秒的短期内进行。
[0068]该给定的时间范围指的是益生菌微生物在给定的温度下进行的时间。注意取决于提供微生物的组合物的性质和量并且取决于使用的加热设备的结构，热应用的时间可以不同。
[0069]然而，通常用高温短时间(HTST)处理、巴氏瞬间灭菌法或者超高温(UHT)处理处理本发明的组合物和/或微生物。
[0070]UHT处理是超高温处理或者超热处理(都简写为UHT)，所述UHT处理涉及在超过135° C(275° F)的温度下通过短时间约1-10秒的加热使组合物至少部分灭菌，超过135° C的温度是灭活奶中细菌孢子需要的温度。例如，用超过135° C的温度的方式加工奶允许在必要的保持时间(2-5秒)内降低细菌负荷，使得能够连续流动操作。
[0071]有两种主要类型的UHT系统:直接和间接系统。在直接系统中，通过蒸汽注射或者蒸汽注入处理产品，然而在间接系统中，使用板式热交换器、管式热交换器或者刮面式换热器对产品进行热处理。UHT系统的组合可应用于产品制备方法中的任一步骤或者多个步骤。
[0072]HTST处理定义如下(高温/短时间):设计的巴氏消毒法实现了 5个数量级的减少:灭活奶中存活微生物数目的99.9999%。认为该处理足够破坏几乎全部的酵母、霉菌和常见的腐败细菌并且也保证足够破坏常见致病性热抗性生物。在HTST方法中将奶加热到71.7V (161。F)持续 15-20 秒。
[0073]巴氏瞬间灭菌法是易腐饮料如水果和蔬菜汁、啤酒和乳制品的热巴氏消毒法。它在产品装入容器之前进行以杀死腐败微生物从而使产品更安全并且延长它们的货架期。当液体在71.50C (160° F)至74V (165° F)的温度下进行约15至30秒的处理时，液体在可控的持续流中移动。
[0074]对于本发明的目的，术语“短时间高温处理”将包括例如高温短时间(HTST)处理、UHT处理、和巴氏瞬间灭菌法。
[0075]因为这样的热处理提供了具有改进的抗炎谱的非复制性益生菌，本发明的组合物可用于预防或治疗炎症病症。
[0076]如果使用长期热处理使益生菌微生物成为非复制微生物，这种热处理可以在约70-150° C的温度范围进行约3分钟-2小时，优选地在80-140° C的范围进行5分钟-40分钟。
[0077]尽管本领域一般性教导了通过长期热处理成为非复制的细菌在发挥它们的益生菌性质方面一般没有活细胞有效，但是本发明人能证实经热处理的益生菌比它们活的对应物更好地刺激免疫系统。
[0078]本发明也涉及包含益生菌微生物的组合物，所述益生菌微生物通过在至少约70° C下至少约3分钟的热处理成为非复制的益生菌。
[0079]通过体外免疫作图证实非复制性益生菌的免疫增强效果。使用的体外模型使用来自人外周血单核细胞(PBMCs)的细胞因子作图，并且在本领域中被接受为用于免疫调节化合物检测的标准模型(Schultz等人，2003, Journalο f Dairy Research7 O，I 65-1 73;Tay 1r 等人,2006, Clinical andExperimental Allergy, 36, 1227-1235;Kekkonen 等人，2008，World Journal ofGastroenterology, 14, 1192-1203)。
[0080]一些作者/研究团队已经使用了体外的PBMC测定，例如根据它们的免疫谱，即它们的抗-或者促-炎症特征对益生菌分类(Kekkonen等人，2008，World Journal of Gastroenterology, 14，1192-1203)。例如，在肠结肠炎的小鼠模型中已经显示该测定允许候选益生菌抗炎效应的预测(Foligne，B.，等人，2007, World J.Gastroenterol.13:236-243)。此外，在临床试验中该测定通常用作读出并且显示得到与临床结果一致的结果(Schultz等人，2003，Journalof Dairy Research70, 165-173;Taylor 等人,2006, Clinical and ExperimentalAllergy, 36，1227-1235)。
[0081]在过去的几十年中变应性疾病已经逐步增加并且如今被WHO认为是流行病。一般来说，认为免疫系统的Thl和Th2反应之间的不平衡导致对Th2介体产生的强烈的偏向，引起变态反应。因此，可通过恢复免疫系统的Thl和Th2臂之间适当的平衡减轻、下调或者预防变态反应。这暗示了减轻Th2反应或者至少暂时地增强Thl反应的必要性。后者将是免疫增强反应的特征，常伴随着例如IFNY，TNF_a和IL-12的更高水平(Kekkonen等人，2008，World Journal of Gastroenterology, 14, 1192-1203;Viljanen M.等人，2005，Allergy, 60，494-500)。
[0082]因此，本发明的组合物允许治疗或者预防涉及受损的免疫防御的病症。
[0083]本发明描述的组合物允许增强对疫苗特别是口服疫苗的应答。
[0084]非复制微生物的任何量将是有效的。然而，通常优选地，至少90%，优选地至少95%，更优选地至少98%，最优选地至少99%，理想地99.9%，最理想地全部益生菌是非复制的。[0085]在本发明的一个实施方案中，所有微生物是非复制的。
[0086]因此，在本发明的组合物中，至少90%，优选地至少95%，更优选地至少98%，最优选地至少99%，理想地99.9%，最理想地全部益生菌是非复制的。
[0087]所有益生菌微生物可用于本发明的目的。 [0088]例如，益生菌微生物可以选自双歧杆菌属、乳杆菌属、丙酸杆菌属或者它们的组合，例如长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、乳双歧杆菌(Bifidobacteriumlactis)、动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)、短双歧杆菌(Bifidobacteriumbreve)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)、青春双歧杆菌(Bifidobacteriumadolescentis)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilu)、干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)、类干酿乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、唾液乳杆菌(Lactobacillussalivarius)、路氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)、约汉逊氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、乳乳球菌(Lactococcus lactis)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、乳乳球菌(Lactococcus lactis)、二丁酮乳球菌(Lactococcus diacetylactis)、乳脂乳球菌(Lactococcus cremoris)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、大肠杆菌(Escherichia coli)和 / 或它们的混合物。
[0089]根据本发明的组合物可以例如包含非复制的益生菌微生物，所述益生菌微生物选自长双歧杆菌NCC3001、长双歧杆菌NCC2705、短双歧杆菌NCC2950、乳双歧杆菌NCC2818、约汉逊氏乳杆菌LaU类干酪乳杆菌NCC2461、鼠李糖乳杆菌NCC4007、路氏乳杆菌DSM17983、路氏乳杆菌ATCC55730、嗜热链球菌NCC2019、嗜热链球菌NCC2059、干酪乳杆菌NCC4006、嗜酸乳杆菌NCC3009、干酪乳杆菌ACA-DC6002(NCC1825)、大肠杆菌Nissle、保加利亚乳杆菌NCC15、乳乳球菌NCC2287或它们的组合。
[0090]所有这些菌株按照布达佩斯条约保藏和/或可以通过商业途径得到。
[0091]按照布达佩斯条约已经保藏的菌株如下:
[0092]长双歧杆菌NCC3001:ATCC BAA-999
[0093]双歧杆菌NCC2705:CNCM 1-2618
[0094]短双歧杆菌NCC2950:CNCM 1-3865
[0095]乳双歧杆菌NCC2818:CNCM 1-3446
[0096]类干酪乳杆菌NCC2461:CNCM 1-2116
[0097]鼠李糖乳杆菌NCC4007 =CGMCCl.3724
[0098]嗜热链球菌NCC2019:CNCM 1-1422
[0099]嗜热链球菌NCC2059:CNCM 1-4153
[0100]乳乳球菌NCC2287:CNCM 1-4154
[0101]干酪乳杆菌NCC4006:CNCM 1-1518
[0102]干酪乳杆菌NCC1825:ACA-DC6002
[0103]嗜酸乳杆菌NCC3009:ATCC700396
[0104]保加利亚乳杆菌NCC15:CNCM 1-1198
[0105]约汉逊氏乳杆菌Lal:CNCM 1-1225[0106]路氏乳杆菌DSM17983:DSM17983
[0107]路氏乳杆菌ATCC55730:ATCC55730
[0108]大肠杆菌Nisslel917:DSM6601
[0109]命名为ATCC的菌株保藏在ATCC专利保藏中心(ATCC Patent Depository),10801University Blvd., Manassas, VA20110,美国。
[0110]命名为CNCM的菌株保藏在国立微生物保藏中心(COLLECTION NATIONALE DECULTURES DE MICROORGANISMESXCNCM),25rue du Docteur Roux，F_75724PARIS Cedexl5,法国。
[0111]命名为CGMCC的菌株保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心(China GeneralMicrobiological Culture Collection Center),微生物学研究所(Institute ofMicrobiology),中国科学院(Chinese Academy of Sciences),中关村(Zhongguancun)，P.0.Box2714，北京(Beijing) 100080，中国。
[0112]命名为ACA-DC的菌株保藏在希腊协调微生物保藏中心(Greek CoordinatedCollections of Microorganisms), DairyLaboratory, Department of Food Science andTechnology, Agricultural University of Athens,75, Iera odos, Botanikos, Athens,11855，希腊。
[0113]命名为DSM的菌 株保藏在德国微生物菌种保藏中心(DSMZ-Deutsche Sammlungvon Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH),Inhoffenstr.7B,38124Braunschweig,德国。
[0114]本领域的技术人员将理解他们可以自由组合本文描述的本发明的所有特征，而不背离公开的本发明范围。
[0115]本发明其他的优点和特征从以下的实施例和附图中是明显的。
[0116]图1A和B显示用“短时间高温”处理的益生菌的抗炎免疫谱的增强。
[0117]图2显示非抗炎益生菌菌株经过“短时间高温”处理后成为抗炎的益生菌菌株，即在体外展示显著的抗炎免疫谱。
[0118]图3A和B显示通过商业途径可得到的产品中使用的益生菌菌株，其经过“短时间高温”处理后在体外展示增强的或者新的抗炎免疫谱。
[0119]图4A和B显示乳品起始菌株(即Lcl起始菌株)，其经过高温热处理后在体外展示增强的或者新的抗炎免疫谱。
[0120]图5显示非抗炎益生菌菌株，其经过HTST处理后在体外展示抗炎免疫谱。
[0121]图6:PBMC 数据的主要成分分析(IL_12p40，IFN- Y , TNF- a , IL-10)，所述 PBMC 数据由活的和经热处理的(140° C15秒)益生菌和乳品起始菌株产生。每个点代表活的或经热处理的一种菌株，所述菌株通过它的NCC号或者名称鉴定。
[0122]图7显示活的和受热处理的(85° C，20分钟)菌株的IL-12p40/IL_10比例。总的来说，在85° C20分钟的热处理导致IL-12p40/IL-10比例的增加，该结果与本发明的“短时间高温”处理的结果相反(图1、2、3、4和5)。
[0123]图8显示体外细胞因子分泌的增强，该细胞因子分泌来自受热处理的细菌刺激的人 PBMCs。
[0124]图9显示在用盐水攻击的OVA敏化的小鼠(阴性对照)中，在用OVA攻击的OVA敏化的小鼠(阳性对照)以及用OVA攻击并且用进行热处理的或者活的短双歧杆菌NCC2950处理的OVA敏化小鼠中观察的腹泻强度的百分数。结果显示为腹泻强度的百分数(平均值土SEM，从4次独立的实验计算)，100%的腹泻强度相应于阳性对照(敏化并且用变应原攻击的)组中发生的症状。
[0125]图10显示了与其他经热处理的菌株相比，在120 °C下热处理15秒钟的Lal (NCC533,保藏号CNCM 1-1225)在体外强烈地诱导肠上皮细胞中的hBDlmRNA。将T84细胞与经热处理的菌株温育4小时。通过实时PCR分析hBDl的基因表达。条形代表对未刺激的细胞的基本表达归一化的平均值土 sem。
[0126]图11显示了经高温及短时间处理的Lal (NCC533,保藏号CNCM1-1225)倾向于最好地诱导hBDlmRNA的表达。用活的和在120°C下热处理15秒钟或在85°C下热处理20分钟的Lal (NCC533,保藏号CNCM1-1225)刺激T84细胞4小时。通过实时PCR分析hBDl的基因表达。条形代表对未刺激的细胞的基本表达归一化的平均值土sem。
[0127]实施例1:
[0128]方法学
[0129]细菌制备:
[0130]活的益生菌在宿主免疫系统上传递的健康益处一般认为是菌株特异性的。在体外(PBMC测定)诱导高水平IL-10和/或诱导低水平促炎细胞因子的益生菌在体内已经显示是有效的抗炎菌株(Foligne, B.,等人，2007，World J.Gastroenterol.13:236-243)。
[0131]一些益生菌菌株用于研究受热处理的益生菌的抗炎性质。这些益生菌菌株是长双歧杆菌NCC3001、长双歧杆菌NCC2705、短双歧杆菌NCC2950、乳双歧杆菌NCC2818、类干酪乳杆菌NCC2461、鼠李糖乳杆菌NC C4007、干酪乳杆菌NCC4006、嗜酸乳杆菌NCC3009、干酪乳杆菌ACA-DC6002 (NCC1825)以及大肠杆菌Nissle。也测试了一些起始培养菌株，其包括商业上用于生产雀巢LcI发酵产品的一些菌株:嗜热链球菌NCC2019、嗜热链球菌NCC2059、保加利亚乳杆菌NCC15和乳乳球菌NCC2287。
[0132]在5-15L生物反应器中用为每种菌株优化的条件培养细菌细胞。可以使用所有常用的细菌生长培养基。本领域的技术人员已知这些培养基。当PH调节到5.5时，连续地加入30%的碱溶液(NaOH或Ca(OH)2X适当时，通过向顶空充入CO2维持厌氧条件。在标准的厌氧条件下培养大肠杆菌。
[0133]通过离心(5，OOOx g，4° C)收集细菌细胞并在适当体积的磷酸缓冲盐水(PBS)中重悬浮以达到约109-101(lCfU/ml的终浓度。用15%的甘油将制备物的一部分冷冻于-80° C。对细胞的另一部分通过如下条件进行热处理:
[0134]-超高温:通过间接热注射，在140°C持续15秒，
[0135]-高温短时间(HTST):通过间接热注射，在74°C，90° C和120° C分别持续15秒，
[0136]-长时间低温(85°C，20分钟)，在水浴中。
[0137]热处理时，将样品冷冻于-80° C直至使用。
[0138]细菌制备物的体外免疫作图:
[0139]评估活的和受热处理的细菌制备物的免疫谱(即体外诱导来自人血细胞的特定细胞因子分泌的能力)。从血液滤器分离人外周血单核细胞(PBMCs)。用细胞密度梯度分离后，收集单核细胞并且用Hanks平衡盐溶液洗涤两次。然后用补充10%胎牛血清(Bioconcept，巴黎，法国)、1%L-谷氨酰胺(Sigma)、1%青霉素/链霉素(Sigma)以及0.1%庆大霉素(Sigma)的Iscove’s改良的Dulbecco’s培养基(IMDM, Sigma)重悬浮细胞。然后在48孔板中将PBMCs(7xl05细胞/孔)与活的以及经热处理的细菌(相当于7xl06cfU/孔)共同培养36小时。培养36小时后，在细胞因子测量之前将培养板冷冻并保存于-20° C。平行地进行(即对相同批次的PBMCs进行相同的实验)活的细菌和它们受热处理的对应物的细胞因子作图。 [0140]36小时的培育后，按照制造商的说明用ELISA(R&D DuoSet人IL-10，BD OptEIA人IL12p40，BD OptEIA人TNF a，BD OptEIA人IFN- y)测定细胞培养上清液中的细胞因子(IFN- Y , IL-12p40, TNF-α 和 IL-10)水平。IFN- y , IL_12p40 和 TNF-α 是促炎细胞因子，而IL-10是有效的抗炎介体。结果表示成4个个体供体的平均值(pg/ml)+/-SEM,并且代表每次实验用4个供体进行的2次单独实验的结果。计算每种菌株的IL-12p40/IL-10比例作为体内抗炎效应的预测值(Foligne1B.,等人，2007，WorldJ.Gastroenterol.13:236-243)。
[0141]将通过ELISA (见上文)测定的每种菌株的数值细胞因子值传送至BioNumericsv5.10软件(Applied Maths, Sint-Martens-Latem,比利时)。对该组数据进行主要成分分析(PCA，尺寸标注技术)。该分析包括减去这些特征上的均值以及除以这些特征上的方差。
[0142]结果
[0143]通过超高温(UHT)/高温短时间(HTST)样的处理产生的抗炎谱
[0144]对研究的益生菌菌株进行一系列的热处理(超高温(UHT)，高温短时间(HTST)以及85° C下20分钟)并将它们的体外免疫谱与活细胞的免疫谱比较。当与人PBMC温育时，活的微生物(益生菌和/或乳品起始培养物)诱导不同水平的细胞因子产生(图1，2，3，4和5)。这些微生物的热处理以温度依赖的方式改变PBMC产生的细胞因子水平。“短时间高温”处理(120° C或140° C15秒)产生具有抗炎免疫谱的非复制细菌(图1，2，3和4)。实际上，经UHT样处理的菌株(140° C，15秒)诱导更少的促炎细胞因子(TNF- a , IFN-y, IL-12p40)而维持或者诱导额外的IL-10产生(与活的对应物比较)。与活细胞相比，任何经UHT样处理的菌株得到的IL-12p40/IL-10比例更低(图1，2，3和4)。对于经HTST样处理，即进行120° C15秒(图1，2，3和4)，或74。C和90。C15秒(图5)热处理的细菌，该观察结果也是有效的。热处理(UHT样或HTST样处理)对益生菌菌株(图1，2，3和5)和乳品起始培养物(图4)的体外免疫谱具有相似的效应。PBMC数据的主要成分分析揭示活的菌株全部沿着X轴散布，说明所述菌株在体外展示非常不同的免疫谱:促炎细胞因子的从低(左侧)到高(右侧)的诱导物，所述PBMC数据由活的和经热处理(140° C，15秒)的益生菌和乳品起始菌株产生。经热处理的菌株聚集在图的左侧，表明经热处理的菌株诱导较少的促炎细胞因子(图6)。相比，在85° C热处理20分钟的细菌比活细胞诱导更多的促炎细胞因子和更少的IL-10，得到更高的IL-12p40/IL-10比例(图7)。
[0145]UHT样和HTST样处理增强或者产生抗炎谱。
[0146]不管它们各自起始的免疫谱(活细胞)如何，经UHT和HTST处理的菌株展示了抗炎谱。已知体内抗炎和体外展示抗炎谱的益生菌菌株(长双歧杆菌NCC3001、长双歧杆菌NCC2705、短双歧杆菌NCC2950、乳双歧杆菌NCC2818)经“短时间高温”处理后在体外展示增强的抗炎谱。如图1显示，经UHT样处理的双歧杆菌菌株的IL-12P40/IL-10比例比活的对应物的IL-12p40/IL-10比例更低，因此经UHT样处理的样品显示改进的抗炎谱。更显著地，为非抗炎活菌株也证实通过UHT样或HTST样处理产生抗炎谱。活的鼠李糖乳杆菌NCC4007和类干酪乳杆菌NCC2461都在体外展示高的IL-12p40/IL_10比例(图2和5)。显示这两种活的菌株不能提供针对小鼠中TNBS诱导的结肠炎的保护。经“短时间高温”处理后(UHT或HTST)，鼠李糖乳杆菌NCC4007和类干酪乳杆菌NCC2461诱导的IL-12p40/IL_10比例显著地降低，达到低至用双歧杆菌菌株得到的水平。这些低的IL-12p40/IL-10比例是由于IL-12p40产生的低水平以及IL-1O分泌没有改变(鼠李糖乳杆菌NCC4007)或者受到显著诱导(类干酪乳杆菌NCC2461)(图2)。
[0147]因此:
[0148]-通过UHT样和HTST样的热处理可以增强活的微生物的抗炎谱(例如长双歧杆菌NCC2705、长双歧杆菌NCC3001、短双歧杆菌NCC2950、乳双歧杆菌NCC2818)。
[0149]-通过UHT样和HTST样的热处理可以从非抗炎的活的微生物(例如，鼠李糖乳杆菌NCC4007、类干酪乳杆菌NCC2461、乳品起始株嗜热链球菌NCC2019)产生抗炎谱。
[0150]-证实从商业途径可得到的产品中分离的菌株(图3A&B)也具有抗炎谱，所述菌株包括益生菌大肠杆菌菌株。
[0151]对于所有测试的益生菌和乳品起始菌株，例如乳杆菌、双岐杆菌和链球菌，UHT样/HTST处理的影响是相似的。
[0152]将UHT样/HTS T处理应用于体外展示不同的免疫谱的一些乳杆菌、双岐杆菌和链球菌。所有这些菌株经过UHT样/HTST处理后比它们活的对应物(图1，2，3，4、5和6)诱导更少的促炎细胞因子，表明UHT样/HTST处理对得到的非复制细菌的免疫性质的影响可以推广至所有益生菌，特别是乳杆菌和双岐杆菌以及特定的大肠杆菌菌株，并且推广至所有乳品起始培养物，特别是链球菌、乳球菌和乳杆菌。
[0153]实施例2:
[0154]方法学
[0155]细菌制备:
[0156]用五种益生菌菌株研究非复制性益生菌的免疫增强性质:3种双岐杆菌(长双歧杆菌NCC3001、乳双歧杆菌NCC2818、短双歧杆菌NCC2950)和2种乳杆菌(类干酪乳杆菌NCC2461、鼠李糖乳杆菌NCC4007)。
[0157]细菌细胞在MRS上以批次发酵的形式在37°C生长16-18小时，不控制pH。离心细菌细胞(5，OOOx g，4°C C)并且在用盐水稀释之前用磷酸缓冲盐水重悬浮细菌细胞以达到约10E10Cfu/ml的终浓度。长双歧杆菌NCC3001、乳双歧杆菌NCC2818、类干酪乳杆菌NCC2461、鼠李糖乳杆菌NCC4007在水浴中85° C下热处理20分钟。短双歧杆菌NCC2950在水浴中90° C下热处理30分钟。等分经热处理的细菌悬浮液，并且在使用之前将细菌悬浮液冷冻保存于-80° C。活的细菌在使用之前在15%PBS-甘油中-80° C贮存。
[0158]细菌制备物的体外免疫作图:
[0159]评估活的和受热处理的细菌制备物的免疫谱(即体外诱导来自人血细胞的特异细胞因子分泌的能力)。从血滤器中分离人外周血单核细胞(PBMCs)。用细胞密度梯度分离后，收集单核细胞并且用Hanks平衡盐溶液洗涤两次。用补充10%胎牛血清(Bioconc印t，巴黎，法国)、1%L-谷氨酰胺(Sigma)、1%青霉素/链霉素(Sigma)以及0.1%庆大霉素(Sigma)的Iscove’ s改良的Dulbecco’ s培养基(MDM, Sigma)重悬细胞。然后在48孔板中将PBMCs(7xl05细胞/孔)与活的以及经热处理的细菌(相当于7xl06cfu/孔)共同培养36小时。检测活的和受热处理的细菌对PBMCs的效应，该PBMCs来自分入2次单独实验中的8个个体供体。培养36小时后，在细胞因子测量之前将培养板冷冻并保持在-20° C。平行进行(即相同的实验中在相同批次的PBMCs上)活的细菌和它们受热处理的对应物的细胞因子作图。
[0160]按照制造商的说明，用ELISA(R&D DuoSet 人 IL-10, BD OptEIA 人 IL12p40, BDOptEIA人TNF α，BD OptEIA人IFN- Y )测定培养36小时后细胞培养上清液中的细胞因子(IFN- Y，IL-12p40, TNF- α 和 IL-10)水平。IFN- y，IL_12p40 和 TNF- α 是促炎细胞因子，而IL-1O是重要的抗炎介体。结果表示成4个个体供体的平均值(pg/ml)+/-SEM，并且结果代表2次单独实验(每次实验用4个供体进行)。
[0161]活的和经热处理的短双歧杆菌NCC2950在变应性腹泻的预防中的体内效应
[0162]用变应性腹泻的小鼠模型检测短双歧杆菌NCC2950的Thl促进效应(Brandt E.B等人，JCI2003; 112(11):1666-1667)。雄性Balb/c小鼠在致敏(以14天的间隔经腹膜内注射两次卵白蛋白(OVA)和硫酸铝钾；第O天和第14天)后受到6次OVA的经口攻击(第27天、29天、32天、34天、36天、39天)，导致暂时的临床症状(腹泻)和免疫参数的改变(总的IgE的血浆浓度，OVA特异的IgE，小鼠肥大细胞蛋白酶1，即MMCP-1)。在OVA致敏之前4天(第-3天、-2天、-1天、O天以及第11天、12天、13天和14天)以及在攻击时期中(第23天至39天)通过管饲法施用活的或者在90° C热处理30分钟的短双歧杆菌NCC2950。使用约IO9菌落形成单位(cfu)或者当量cfu/小鼠的每日细菌剂量。
[0163]益果
[0164]经过热处理后诱导‘促 炎’细胞因子的分泌
[0165]体外评估了经热处理的细菌菌株刺激人外周血单核细胞(PBMCs)的细胞因子分泌的能力。将经热处理的细菌刺激PBMCs时基于四种细胞因子的免疫谱与在相同的体外测定中活的细菌细胞诱导的免疫谱比较。
[0166]平板接种经热处理的制备物并且用于评估任何活菌计数的缺失。经热处理的细菌制备物在平板接种后没有产生任何菌落。
[0167]当用PBMCs温育时，活的益生菌诱导不同的和菌株依赖性的细胞因子产生水平(图8)。与益生菌活的对应物比较，益生菌的热处理改变了 PBMCs产生的细胞因子水平。经热处理的细菌比它们活的对应物诱导更多的促炎细胞因子(TNF-α，IFN-Y，IL-12p40)。相t匕，与活细胞比较，经热处理的细菌诱导相似或者更低量的IL-10 (图8)。这些数据表明经热处理的细菌比它们活的对应物更能刺激免疫系统，并且因此更能加强弱化的免疫防御。换句话说，体外数据说明受热处理后细菌菌株的增强的免疫增强效应。
[0168]为了说明经热处理的短双歧杆菌NCC2950 (与活细胞相比)对免疫系统的增强效应，在变应性腹泻的动物模型中测试了活的和经热处理的短双歧杆菌NCC2950 (菌株A)。
[0169]与阳性对照组比较，用经热处理的短双歧杆菌NCC2950处理后，腹泻强度明显地持续降低(41.1%±4.8)，然而用活的短双歧杆菌NCC2950处理后，腹泻强度只降低20±28.3%。这些结果表明经热处理的短双歧杆菌NCC2950比它的活的对应物展示针对变应性腹泻增强的保护效应(图9)。
[0170]因此，显示经过热处理后益生菌增强免疫防御的能力得到提高。
[0171]实施例3:
[0172]实验方案: [0173]使用传代30-40代的T84细胞并且在包含5%的胎牛血清(FCS) (AminedBioConcept)和2mM谷氨酰胺的Dulbecco改良的必需培养基/F_12 (Sigma D6421)中培养该T84细胞。以2xl06细胞/每孔的浓度将细胞接种于6孔培养板，并且在5%C02 - 95%空气37° C下该细胞生长成单细胞层。汇集后生长I周的细胞用血清和无抗生素的培养基培养至少12小时。该步骤对于消除血清诱导的防卫素的表达以及防止抗生素对益生菌和细胞免疫反应的任何影响是必需的。细胞进一步地与益生菌或者热处理的菌株培养4小时。在培养时间结束时，用PBS洗涤并且按照供应商的方案用TriPure?分离试剂收获细胞。在如此处理的细胞中人hBDl和hBD2的基因表达用定量PCR评估。
[0174]在该实验中使用的细菌菌株是长双歧杆菌(B.longum) (NCC2705,保藏号CNCM 1-2618)，乳双歧杆菌(B.lactis) (NCC2818,保藏号 CNCM 1-3446)，约氏乳杆菌(Lai, NCC533,保藏号 CNCM 1-1225)，类干酪乳杆菌(L.paracasei) (ST11, NCC2461,保藏号CNCM 1-2116)。这些菌株经检测是活的或者在120° C - 15秒或者85° C - 20分钟下进行热处理。
[0175]结果:
[0176]与其他检测的热处理菌株比较，在120° C- 15秒热处理的Lal (NCC533,保藏号CNCM 1-1225)在培养4小时后诱导了强烈的hBDlmRNA的表达(图10)。这些数据是独特的，因为hBDl的表达(组成型表达的)被如今科学界认为几乎不能被微生物、微生物产物或者炎
症调节O
[0177]活的和经热处理的Lal (NCC533,保藏号CNCM 1-1225)都强烈地诱导hBDlmRNA的表达，然而经热处理的Lal (高温和短时间处理)引发hBDl最高的诱导(图11)。
[0178]打印输出(原始的是电子表格)
[0179](该页不作为国际申请的一部分并且不认为是国际申请页)
[0180]