专利名称：热稳定性肌醇六磷酸酶变体的制作方法肌醇六磷酸酶是公知的酶，将其添加至动物包括人类的食料中的优点也是公知的。已从多种来源，包括多种真菌和细菌菌株分离出肌醇六磷酸酶。本发明的一个目的是提供具有肌醇六磷酸酶活性的替代性多肽(肌醇六磷酸酶)和编码所述多肽的多核苷酸。本发明的肌醇六磷酸酶变体与亲本肌醇六磷酸酶相比呈现修饰的或改变的，优选改善的性质。此类性质的非限定性实例为稳定性(如酸稳定性，热稳定性，蒸汽稳定性，造粒稳定性和/或蛋白酶稳定性，特别是胃蛋白酶稳定性)，温度概貌(profile)，pH概貌，比活性，底物特异性，在动物饲料中的性能(如改善的植酸(盐)释放和/或降解)，对糖化作用(glycation)的易感性,和/或糖基化样式。如本文中所述，采用编码肌醇六磷酸酶的亲本多核苷酸的诱变以制备编码相对于由亲本多核苷酸编码的肌醇六磷酸酶具有改善的性质的肌醇六磷酸酶的变体(合成)DNA。已知多种组氨酸磷酸(HAP)类型的肌醇六磷酸酶的三维结构(例如Lim等Nature struct, biol. 7，108-113 (2000))。由此发现，其均具有位于位置对77/108133/407178/187381/390(根据本文中使用的编号)的四个二硫桥联。通常这些桥联占用了分子中存在的所有半胱氨酸。布丘氏菌属(Buttiauxiella)WO 2006/043178 公开了一种来自布丘氏菌属 Pl_29 (Buttiauxella P1-29)(作为NCIMB 41248保藏)的具有WO 2006/043178中SEQ ID NO:3的氨基酸序列的肌醇六磷酸酶，及其某些变体。布丘氏菌属野生型肌醇六磷酸酶的序列及其多种变体已经提交至GENESEQP数据库，具有以下登录号AEH25051、AEH25056、AEH25057、AEH25058、AEH25059、AEH25060、AEH25061、AEH25062、AEH25063、AEH25064、AEH25065、AEH25066、AEH25067、AEH25068、AEH25069、AEH25070、AEH25071、AEH25072、AEH25073、AEH25074、AEH25075 和 AEH25076。这些肌醇六磷酸酶均与SEQ ID N0:2、4和6中的任何一个具有70%以上的同一性百分比。来自变形肥杆菌(Obesumbacterium proteus)的肌醇六磷酸酶的序列已经提交至UNIPR0T 数据库，登录号为 Q6U677。这种也由 Zinin 等在 FEMS Microbiology Letters, 236卷，283-290页，2004中进行了描述的肌醇六磷酸酶，与SEQ ID N0:2、4和6具有超过70%的同一性百分比。WO 2008/192901 公开了来自 Buttiauxella gaviniae DSM18930，乡间布丘氏菌(Buttiauxella agrestis)DSM18931,和乡间布丘氏菌DSM18932的肌醇六磷酸酶，及其多种变体。这些肌醇六磷酸酶提供于本文中的SEQ ID NO:2, SEQ ID N0:4和SEQ ID N0:6。W02008097619亦公开了来源于布丘氏菌属菌种菌株P 1_29的肌醇六磷酸酶变体，特别是命名为BP-Il的变体，及其一些变体。WO 20091100183进一步公开了来源于布丘氏菌属菌种P1-29肌醇六磷酸酶或BP-Il变体的变体。附图和序列表简述图I显示SEQ ID NO:2, SEQ ID N0:4和SEQ ID N0:6的预期的成熟部分连同具有以下 GENESEQP 登录号的序列的多重比对AEH25051、AEH25056、AEH25057、AEH25058、AEH25059、AEH25060、AEH25061、AEH25062、AEH25063、AEH25064、AEH25065、AEH25066、AEH25067、AEH25068、AEH25069、AEH25070、AEH25071、AEH25072、AEH25073、AEH25074、AEH25075 和 AEH25076。比对是使用 Clustal 方法(Higgins, 1989，CABIOS 5:151-153)，使用 LASERGENE MEGALIGN 软件(DNASTAR, Inc.，Madison, WI)，用同一性表和以下多重比对参数进行的缺口罚分为10,并且缺口长度罚分(gap length penalty)为10。配对比对参数是 K 元组(Ktuple)=I,缺口罚分=3,窗口(windows) =5,和对角线(diagonals) =5。图2显示UNIPR0T登录号Q6U677与SEQ ID NO: 2的氨基酸1-413的比对。比对是使用Needle程序，使用矩阵BL0SUM62、10. O的缺口产生罚分和0. 5的缺口延伸罚分进行的。序列表中序列如下所示 SEQ ID NO: I Buttiauxella gaviniae DSM18930 SEQ ID NO:2 Buttiauxella gaviniae DSM18930 SEQ ID NO:3 乡间布丘氏菌DSM18931 SEQ ID NO:4 乡间布丘氏菌DSM18931 SEQ ID NO :5 乡间布丘氏菌DSM18932 SEQ ID NO :6 乡间布丘氏菌DSM18932实施例概述在本说明书中提供了下述实施例实施例I :变体的制备和活性的确定实施例2 比活性实施例3 :通过DSC测量热稳定性实施例4 :温度概貌实施例5 :在体外模型中在动物饲料中的性能实施例6 :在猪体内试验中的性能
本发明涉及从亲本肌醇六磷酸酶产生变体肌醇六磷酸酶的方法，所述变体肌醇六磷酸酶a)当使用Needle程序用BL0SUM62取代矩阵，10. O的缺口开放罚分和O. 5的缺口·延伸罚分与相应的氨基酸序列进行比对时，与SEQ ID NO:2的氨基酸1-413，SEQ ID NO:4的氨基酸1-413，和/或SEQ ID NO:6的氨基酸1-413具有至少70%同一性；和b)与SEQ ID N0:2相比，包含至少一个二硫桥联的建立，其中所述二硫桥联不属于在位置79/110，135/410，180/189和384/393的四个天然存在的二硫桥联。同一性百分比如段落“肌醇六磷酸酶多肽，同一性百分比”中所述确定。位置编号指SEQ ID NO:2中的位置编号，如段落“位置编号”中所述。在其它肌醇六磷酸酶中，对应于这些SEQ ID N0:2位置编号的位置是通过如段落“鉴定相应的位置编号”中所述确定的。所述至少一个二硫桥联建立于一个或多个选自下组位置对的位置A) 143C/201C,B)33C/179C, C)54C/101C, D)93C/48C, E)33C/178C, F)61C/102C，和 G) 164C/251C。根据本发明，第一二硫桥联优选建立于位置143和201的残基之间的位置对A，而第二二硫桥联建立于位置33和179的残基之间的位置对B。在某些实施方案中，建立的二硫桥联的数量是2，3，4，5，6和/或7。当建立的二硫桥联的数量是二时，可构建下述位置对的组合A+B，A+C, A+D, A+E,A+F, A+G, B+C, B+D, B+E, B+F, B+G, C+D, C+E, C+F, C+G, D+E, D+F, D+G, E+F, E+G,和 F+G。当建立的二硫桥联的数量是三时，可构建下述位置对的组合A+B+C, A+B+D, A+B+E, A+B+F, A+B+G, A+C+D, A+C+E, A+C+F, A+C+G, A+D+E, A+D+F,A+D+G, A+E+F, A+E+G, A+F+G, B+C+D, B+C+E, B+C+F, B+C+G, B+D+E, B+D+F, B+D+G, B+E+F,B+E+G, B+F+G, C+D+E, C+D+F, C+D+G, C+E+F, C+E+G, C+F+G, D+E+F, D+E+G, D+F+G,和 E+F+G。当建立的二硫桥联的数量是四时，可构建下述位置对的组合A+B+C+D，A+B+C+E,A+B+C+F, A+B+C+G, A+B+D+E, A+B+D+F, A+B+D+G, A+B+E+F, A+B+E+G, A+B+F+G, A+C+D+E,A+C+D+F, A+C+D+G, A+C+E+F, A+C+E+G, A+C+E+H, A+C+F+G, A+D+E+F, A+D+E+G, A+D+F+G,A+E+F+G, B+C+D+E, B+C+D+F, B+C+D+G, B+C+E+F, B+C+E+G, B+C+F+G, B+D+E+F, B+D+E+G,B+D+F+G, B+E+F+G, C+D+E+F, C+D+E+G, C+D+F+G, C+E+F+G, C+E+F+H,和 D+E+F+G。当建立的二硫桥联的数量是五时，可构建下述位置对的组合A+B+C+D+E，A+B+C+D+F, A+B+C+D+G, A+B+C+E+F, A+B+C+E+G, A+B+C+F+G, A+B+D+E+F, A+B+D+E+G,A+B+D+F+G, A+B+E+F+G, A+B+F+G+H, A+C+D+E+F, A+C+D+E+G, A+C+D+F+G, A+C+E+F+G,A+D+E+F+G, B+C+D+E+F, B+C+D+E+G, B+C+D+F+G, B+C+E+F+G, B+D+E+F+G,和 C+D+E+F+G。当建立的二硫桥联的数量是六时，可构建下述位置对的组合A+B+C+D+E+F，A+B+C+D+E+G, A+B+C+D+F+G, A+B+C+E+F+G, A+B+D+E+F+G, A+C+D+E+F+G,和 B+C+D+E+F+G。当建立的二硫桥联的数量是七时，可构建下述位置对的组合A+B+C+D+E+F+G。在所有上述组合中，A意指143C/201C，B意指33C/179C，C意指54C/101C，D意指93C/48C, E 意指 33C/178C, F 意指 61C/102C,而 G 意指 164C/251C根据本发明的方法，所述肌醇六磷酸酶变体可进一步在至少一个选自下组的位置包含至少一个修饰1,9,10，18，22，25，26，37，38，66，71，81，89，92，94，109，111，119，120，121，131，134，141，142，144，152，155，160，164，171，176，178，188，190，192，193,206,207，209，211，214，215，219，222，239，235，243，245，248，253，255，256，257，260，261，268，270，277，283，285，287，288，293，296，303，306，307，308，314，318，328，337，345，350，364，371，372，396，399，406 和 / 或 413。本发明进一步规定，上述修饰具体选自下述修饰1S，9I，10I，R18，R22，T25，26E， 37Y，38S，66E，71K，81A，89T，92E，R94,109Q,111G,119N,120L, 121E, K131,1341，134V,141R,142L, T144,152M,155E,160R,164F,1711，176K,178P,188N,190E,192G,193Q, N206，207E，207T，209S，211C，214V， G215, T219, E222,239K,235V, E243,245D,248E,248L,248S, H253,255A,255T,256H,256Y, F257, M260,261E,268A,268T,270K,277T,283E,283D,285K,287D,288V,288A,293G,296S,303L,303F, H306, D307, T308,314A,314S,318D, D328，3371，345A，3501，364A，371K,372E,396P,399K,406E 和 / 或 413P。在本发明的具体实施方案，其它二硫桥联选自下组Q143C/I201C，D33C/W179C，E54C/A101C, Q93C/Y48C, D33C/A178C, G61C/F102C，和 F164C/K251C。在本发明的方法的进一步的具体实施方案中，进一步的具体修饰是N1S，SIN,I9V, V9I, V10I, K26E, N37Y, T38S, S38T, E66Q, Q66E, K71Q, Q71K, T81A, A81T, A89T, D92E,E109Q, H111G, D119N, I120L, K121E, T134I, T134V, R141Q, Q141R, V142L, L142V, T144I,T152M, M152T, E155D, D155E, H160R, S164F, F164S, T171I, T176K, A178P, S188N, D190E,A192G, G192A, L193Q, K207E, K207T, A209S, D211C, I214V, V214I, A235V, K239N, N239K,E245D, D245E, E248S, E248L, S248L, S248E, A255T, T255A, V255A, V255T, Q256H, Q256Y,A261E, R268A, R268T, A268R, A268T, T268A, T268R, N270K, A277T, T277A, D283N, D283E,E283N, E283D, N283D, N283E, N285K, K285N, D287T, T287D, A288E, A288V, V288E, V288A,E288A, E288V, D293G, P296S, S296P, I303L, I303F, L303F, F303L, L303I, S314A, A314S,N318D, I337V, V337I, S345A, A345S, V350I, I350V, A364S, A364S, S364A, K371N, N371K,E372Q, E372Q, Q372E, P396S, S396P, T399K, K399T, E406V, V406E, P413Q 和 / 或 Q413P 和/ 或来自下述组合D92E/H160R，A261E/N270K, T134I/K207T, D190E/K207E/N318D, T134I/K207T/A261E/N270K, T134I/K207E/A209S/A261E/N270K,A89T/T134I/F164S/T176K/A178P/K207E/A261E/N270K,A89T/T134I/F164S/T176K/A178P/K207E/A209S/S248L/Q256Y/A261E/N270K,A89T/D92E/H160R/F164S/T176K/A178P/S188N/G192A/K207E/A261E/N270K,D92E/T134I/H160R/F164S/T170I/T176K/A188P/K207E/A235V/Q256H/A261E/N270K, A89T/T134I/H160R/F164S/T170I/T176K/A188P/K207E/A235V/Q256H/A261E/N270K/I303F，和 / 或N37Y/D92E/T134I/H160R/F164S/T171I/T176K/A188P/K207E/A235V/Q256H/A261E/N270K。本发明的方法可用于构建任何野生型或变体肌醇六磷酸酶的变体。在具体实施方案中，所述方法产生SEQ ID N0:2, SEQ ID N0:4或SEQ ID NO:6的肌醇六磷酸酶的成熟部分的变体，或任何用作供产生肌醇六磷酸酶变体的亲本/骨架的下述GENESEQP序列的任一个的成熟部分的变体AEH25051，AEH25056, AEH25057, AEH25058, AEH25059, AEH25060,AEH25061, AEH25062, AEH25063, AEH25064, AEH25065, AEH25066, AEH25067, AEH25068,AEH25069, AEH25070, AEH25071, AEH25072, AEH25073, AEH25074, AEH25075，或 AEH25076。本发明的方法可提供具有改善性质的肌醇六磷酸酶变体，所述性质如热稳定性(thermostability),热活性稳定性(heat_stability),蒸汽稳定性,温度概貌,造粒稳定性，酸稳定性，PH概貌，和/或蛋白酶稳定性，特别是胃蛋白酶稳定性，比活性，底物特异性，在动物饲料中的性能(如改善的植酸(盐)释放和/或降解)，对糖化作用的易感性，和/或糖基化样式。由本发明提供的变体呈现特别改善的热性质，如热稳定性、热活性稳定性、蒸汽稳定性、温度概貌、造粒稳定性或在动物饲料中的改善的性能。
本发明的方法因此涉及具有改善的热性质的肌醇六磷酸酶变体，所述热性质如热稳定性，热活性稳定性，蒸汽稳定性，温度概貌，和/或造粒稳定性。本发明的方法因此涉及具有改善的热稳定性的肌醇六磷酸酶变体。本发明的方法因此涉及具有改善的热活性稳定性的肌醇六磷酸酶变体。本发明的方法因此涉及具有改善的蒸汽稳定性的肌醇六磷酸酶变体。本发明的方法因此涉及具有改善的温度概貌的肌醇六磷酸酶变体。本发明的方法因此涉及具有改善的造粒稳定性的肌醇六磷酸酶变体。本发明的方法因此涉及具有改善的酸稳定性的肌醇六磷酸酶变体。本发明的方法因此涉及具有改善的pH概貌的肌醇六磷酸酶变体。本发明的方法因此涉及具有改善的蛋白酶稳定性，特别是胃蛋白酶稳定性的肌醇六磷酸酶变体。本发明的方法因此涉及具有改善的比活性的肌醇六磷酸酶变体。本发明的方法因此涉及具有改善的底物稳定性的肌醇六磷酸酶变体。本发明的方法因此涉及具有改善的在动物饲料中的性能(如改善的植酸(盐)释放和/或降解)的肌醇六磷酸酶变体。本发明的方法因此涉及具有改善的对糖化作用的易感性的肌醇六磷酸酶变体。本发明的方法因此涉及具有改善的糖基化样式的肌醇六磷酸酶变体。本发明进一步涉及包含编码由本方法产生的肌醇六磷酸酶变体的核苷酸序列的多核苷酸，包含所述多核苷酸可操作地连接于一个或多个指导所述多肽在表达宿主中产生的调控序列的核酸构建体,包含此种核酸构建体的重组表达载体,和包含核酸构建体和/或表达载体的重组宿主细胞。本发明进一步涉及产生如所提供的肌醇六磷酸酶变体的方法，包括(a)培养宿主细胞以产生包含所述肌醇六磷酸酶的上清；和(b)回收所述肌醇六磷酸酶。本发明进一步涉及能够表达所述肌醇六磷酸酶变体的转基因植物或植物部分，涉及包含至少一种肌醇六磷酸酶变体和如下的组合物(a)至少一种脂溶性维生素；(b)至少一种水溶性维生素；和/或(C)至少一种痕量矿物质。此类组合物可进一步包含至少一种选自下组酶的酶淀粉酶，肌醇六磷酸酶，磷酸酶，木聚糖酶，半乳聚糖酶，α -半乳糖苷酶，蛋白酶，磷脂酶，和/或葡聚糖酶。所述组合物可为动物饲料添加剂，其可具有50至800g/kg的粗蛋白含量，并包含本发明的肌醇六磷酸酶变体。本发明进一步涉及通过将本发明的肌醇六磷酸酶变体添加至饲料而改善动物饲料的营养价值的方法，通过用有效量的饲料饲养动物而减少动物粪便(animal manure)中植酸(盐)水平的工艺，处理植物蛋白的方法，其包括下述步骤将肌醇六磷酸酶变体添加至至少一种植物蛋白，并涉及本发明的组合物的肌醇六磷酸酶变体的用途。本发明亦提供了产生发酵产物如例如乙醇、啤酒、葡萄酒的方法，其包括在植酸变体的存在下发酵糖类材料，提供了产生乙醇的方法，其包括在肌醇六磷酸酶变体的存在下发酵糖类材料并产生乙醇。肌醇六磷酸酶多肽，同一性百分比
在本文中，肌醇六磷酸酶是具有肌醇六磷酸酶活性的多肽，即催化植酸盐(肌醇六磷酸盐)水解成(I)肌醇和/或(2)它的单、二、三、四和/或五磷酸盐和(3)无机磷酸盐的酶。在本文中，术语肌醇六磷酸酶底物包括，但不限于，植酸和任何植酸盐(植酸的盐)，以及上文⑵中所列的磷酸盐。因特网上的ENZYME 站点(http://www. expasy. ch/enzyme/)是与酶的命名法相关的信息的储藏库。其主要基于国际生物化学与分子生物学联合会命名委员会(Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry andMolecular Biology) (IUB-MB)的建议，并描述了各种类型的表征的酶，并为这些酶提供了EC (Enzyme Commission (酶学委员会))号(Bairoch A. The ENZYME 数据库，2000，NucleicAcids Res 28:304-305)。同样参见 NC-IUBMB, 1992 的酶命名手册(handbook EnzymeNomenclature)。根据ENZYME网站，已知三种不同类型的肌醇六磷酸酶所谓的3_肌醇六磷酸酶(或称I-肌醇六磷酸酶；肌醇六磷酸3-磷酸水解酶(myo-inositol hexaphosphate3-phosphohydrolase)),所谓的4_肌醇六磷酸酶(或称6_肌醇六磷酸酶,基于IL编号系统而非ID编号命名，EC 3. I. 3. 26)，和所谓的5-肌醇六磷酸酶(EC 3. I. 3. 72)。就本发明而言，全部三种类型均包括在肌醇六磷酸酶的定义中。在一个具体的实施方案中，本发明的肌醇六磷酸酶属于酸性组氨酸磷酸酶家族，该家族包括大肠杆菌(Escherichia coli)pH 2. 5酸性磷酸酶(基因appA)以及真菌肌醇六磷酸酶例如泡盛曲霉(Aspergillus awamorii)肌醇六磷酸酶A和B (EC: 3. I. 3. 8)(基因PhyA和phyB)。多种组氨酸酸性磷酸酶共享两个具有序列相似性的区域，每个均以保守的组氨酸残基为中心围绕在其周围。这两个组氨酸似乎涉及酶的催化机制。第一组氨酸位于N-末端部分，并且形成磷-组氨酸中间物，而第二个位于C末端部分，并且可能充当质子供体。在另一个具体实施方案中，本发明的肌醇六磷酸酶具有保守的活性部位基序，SPR-H-G-X-R-X-P，其中X表示任何氨基酸(参见SEQ ID NO: 2、3、4和6的氨基酸16至22和SEQ ID NO:9的氨基酸38-44)。在一个优选实施方案中，所述保守的活性部位基序为R-H-G-V-R-A-P，即氨基酸 16-22(参照 SEQ ID NO:2)是 RHGVRAP。就本发明而言，肌醇六磷酸酶活性是以FYT单位测定的，一个FYT是在以下条件下每分钟释放I微摩尔无机正磷酸根的酶量pH5. 5 ;温度37°C;底物浓度为O. 0050mol/l的肌醇六磷酸钠(C6H6O24P6Na12)。合适的肌醇六磷酸酶测定法是WO 00/20569的实施例I中描述的FYT和FTU测定法。FTU用于测定饲料和预混物(premix)中的肌醇六磷酸酶活性。肌醇六磷酸酶活性亦使用实施例I中的测定法来确定(“磷酸酶活性的确定”或“肌醇六磷酸酶活性的确定”)。在一个具体的实施方案中，本发明的肌醇六磷酸酶是分离的。术语“分离的”如用于本文是指这样的多肽，如通过SDS-PAGE测定，所述多肽是至少20%纯的，优选至少40%纯的，更优选至少60%纯的，甚至更优选至少80%纯的，最优选至少90%纯的，并且甚至最优选至少95%纯的。具体而言,优选多肽是“基本上纯的形式(essentially pure form)”，SP，所述多肽制备物基本上不含(essentially free of)其它与该多肽制备物天然结合的(natively associated)多肽物质。例如,这可以通过以公知的重组方法或通过经典纯化方法制备多肽来实现。 两个氨基酸序列之间的相关性用参数“同一性”来描述。就本发明而言，两个氨基酸序列的比对是通过使用来自EMBOSS软件包(http://emboss.org)的Needle程序版本 2. 8. O 确定的。Needle 程序执行在 Needleman, S. B.和 Wunsch, C. D. (1970) J. Mol.Biol. 48，443-453中描述的全局比对算法(global alignment algorithm)。所用的取代矩阵是BL0SUM62，缺口开放罚分是10，并且缺口延伸罚分是O. 5。本发明的氨基酸序列(“发明序列”)和权利要求中涉及的氨基酸序列(例如SEQID NO:2)之间的同一性程度，是通过两个序列比对中精确匹配的数目，除以“发明序列”的长度或SEQ ID NO:2的长度中最短的一个来计算。结果以百分比同一性表示。当“发明序列”和SEQ ID NO:2在重叠的相同位置具有相同的氨基酸残基时发生精确匹配(在下文的比对实例中用“ I ”代表这种情况)。序列的长度是序列中的氨基酸残基数(例如SEQ ID NO:2的氨基酸1-411的长度是411)。在以下的纯假设性比对实例中，重叠是序列I的氨基酸序列“HTWGER-NL”或序列2的氨基酸序列“HGWGEDANL”。在该实例中，缺口用表示。假设性比对实例序列I :ACMSHTWGER_NLI I I I I序列2 =HGffGEDANLAMNPS在一个具体的实施方案中，多肽的氨基酸序列与或者相对于例如SEQ IDN0:2的同一性百分比是通过如下来确定的i)使用Needle程序，用BL0SUM62取代矩阵、10的缺口开放罚分和0. 5的缺口延伸罚分来比对所述两个氨基酸序列；ii)计数比对中精确匹配数；iii)用精确匹配数除以两个氨基酸序列中最短的序列的长度，iv)将iii)除得的结果转换成百分比。在上文的假设性实例中，精确匹配数是6，两个氨基酸序列中最短的序列的长度是12 ;因此同一性百分比是50%。在本发明的肌醇六磷酸酶的具体实施方案中，与SEQ ID NO:2, SEQ IDN0:4和/或 SEQ ID NO: 6 的同一性程度为至少 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%,81%,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%, 97%, 98%,或至少99%。在仍进一步的具体实施方案中，同一性程度为至少98. 0%,98. 2%,98. 4%,98. 6%，98. 8%,99. 0%,99. 1%，99. 2%,99. 3%,99. 4%,99. 5%,99. 6%,99. 7%,99. 8%,或至少 99. 9%。在其
它实施方案中，同一性程度为至少70%，71%，72%，或至少73%。在仍进一步的具体实施方案中，本发明的肌醇六磷酸酶具有与SEQ IDNO:2, SEQID N0:4和/或SEQ ID NO:6或任何其它亲本肌醇六磷酸酶相比，不多于2，3，4，5，6，7，8，9，或不多于10个修饰;与SEQ ID N0:2相比不多于11，12，13，14，15，16，17，18，19，或不多于20个修饰;与SEQ ID N0:2相比不多于21，22，23，24，25，26，27，28，29，或不多于30个修饰；与SEQ ID NO: 2, SEQ ID N0:4和/或SEQ ID NO:6或任何其它亲本肌醇六磷酸酶相比，不多于 31，32，33，34，35，36，37，38，39，或不多于 40 个修饰；与 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4和/或SEQ ID N0:6或任何其它亲本肌醇六磷酸酶相比，不多于41，42，43，44，45，46，47，48，49，或不多于50个修饰；与SEQ ID NO: 2, SEQ ID N0:4和/或SEQ ID NO:6或任何其它亲本肌醇六磷酸酶相比，不多于51，52，53，54，55，56，57，58，59，或不多于60个修饰；与SEQ ID NO:2，SEQ ID N0:4和/或SEQ IDNO:6或任何其它亲本肌醇六磷酸酶相比，不多于61，62，63，64，65，66，67，68，69，或不多于 70 个修饰；与 SEQ ID NO: 2，SEQ ID N0:4 和 / 或 SEQID NO: 6或任何其它亲本肌醇六磷酸酶相比，不多于71，72，73，74，75，76，77，78，79，或不多于80个修饰；与SEQ ID NO: 2, SEQ ID N0:4和/或SEQ ID NO:6或任何其它亲本肌醇六磷酸酶相比，不多于81，82，83，84，85，86，87，88，89，或不多于90个修饰;与SEQ ID NO: 2, SEQID N0:4和/或SEQ ID NO:6或任何其它亲本肌醇六磷酸酶相比，不多于91，92，93，94，95，96，97，98，99，或不多于 100 个修饰；与 SEQ ID NO: 2, SEQ ID N0:4 和 / 或 SEQ ID NO:6 或任何其它亲本肌醇六磷酸酶相比，不多于101，102，103，104，105，106，107，108，109，或不多于110个修饰；与SEQ IDNO:2, SEQ ID N0:4和/或SEQ ID NO:6或任何其它亲本肌醇六磷酸酶相比，不多于111，112，113，114，115，116，117，118，119，或不多于120个修饰；或与SEQ ID N0:2, SEQ ID N0:4和/或SEQ ID NO:6或任何其它亲本肌醇六磷酸酶相比，不多于 121，122，123，或 124 个修饰。位置编号本文使用的用于限定氨基酸位置的命名法基于Buttiauxella gaviniaeDSM18930的成熟肌醇六磷酸酶的氨基酸序列，其作为SEQ ID NO: 2在序列表中给出(SEQ IDNO:2的氨基酸1-413)。因此，在本上下文中，用于位置编号的基础是SEQ ID N0:2，始于NI并且止于Q413。(SEQ ID NO:2)作为位置编号的标准，并因此作为命名的基准。当用于本文中时，术语“成熟”部分(或序列)是指由细胞分泌的多肽的部分，所述细胞含有编码该多肽的多核苷酸作为其遗传部件(genetic equipment)的部分。换言之，成熟多肽部分指多肽在切割去信号肽部分以及前肽部分(如存在)之后残余的部分。信号肽部分可通过本领域已知的程序预测(例如SignalP)。一般而言，酶的成熟多肽的第一个氨基酸可通过纯化的酶的N端测序来确定。则信号肽部分和成熟部分之间的任何差异必然是由于前肽的存在。修饰，如取代、缺失、插入肌醇六磷酸酶变体，可以相对于模板(即参照或比较性氨基酸序列例如SEQ IDNO:2)包含多种类型的修饰可以将一个氨基酸用另一个氨基酸取代；可以缺失氨基酸；可以插入氨基酸；以及任何数目的这些修饰的任意组合。在本上下文中，术语“插入”意欲还包括N末端和/或C末端延伸。本文用于单修饰的通用命名法如下XDcY，其中〃X〃和〃Y〃独立地表示单字母氨基酸代码，或〃*"(一个氨基酸缺失)，〃D〃表示一个数字，且〃c〃表示按字母顺序计数(a、b、c等等)，其仅在插入中出现。参考下文表1，其中描述了将这种命名法应用于多种类型的修饰的纯假设性实例。表I


本发明涉及产生肌醇六磷酸酶变体的方法，所述肌醇六磷酸酶变体与来源于布丘氏菌属的肌醇六磷酸酶具有至少70%同一性并与该肌醇六磷酸酶相比包含至少一个其它的二硫键。这些肌醇六磷酸酶变体具有修饰的，优选改善的性质，如热稳定性、温度概貌、pH概貌、比活性、在动物饲料中的性能、减少的蛋白酶敏感性和/或修饰的糖基化样式。本发明亦涉及产生的变体，编码这些肌醇六磷酸酶的DNA，其产生方法，及其例如在动物饲料和动物饲料添加剂中的用途。