专利名称：稳定碱性磷酸酶的方法 已知碱性磷酸酶(ALP)是一种存在于植物、动物、微生物等中的酶。例如，它们的动物来源广泛，如牛、猪、兔和狗的小肠以及牛和猪的肾、人的胎盘，其微生物来源包括源自大肠杆菌(E.coli)的酶。所有这些酶均市售可得。这些酶的功能相同，但彼此间的性质如专一性、热稳定性和反应性存在差异。在临床诊断中，对可反映多种病态的人血清中的酶活性进行了测定。血清中所含有的酶的来源广泛，如肝、肾、骨、小肠和胎盘。通常，酶活性用相对数值表示，该数值随条件如pH和测定温度而改变。因此，即便使用相同的样品，活性值还是随所使用的试剂而不同。试剂变质和样品本身变质等因素对活性值具有重大的影响。因此，为准确测量酶活性，每次进行测量时必须使用稳定不变的标准物质以将其测量结果和样品测量结果相比较，或者必须使用标准测量方法。在临床检验领域，市售可得的通用名为对照血清、校准物或标准物质的产品，根据其用途被用作测量酶活性的标准物质。其中，对照血清用于内部质量对照，即某个测量设备的日常对照，校准物和标准物质不仅可用作质量对照，而且在考虑测量值的精确性时可用作设备间的对照物质。然而，人血清中ALP的酶活性易于改变，并且在新鲜血液中的活性于96小时后的改变率根据保存条件可为-4％至10％。已报道当将冷冻的混合血清溶解并保存于室温时，其活性上升6.4％(Clin.Chem.，18(4)，1972)。已知热稳定性随同工酶类型的不同而不同(Akio Genba，Isoenzyme，Igaku-Shoin Ltd.，10-16页，1978)。同时，冷冻干燥是一项有用的技术，且通常用于对热不稳定和以水溶液形式放置时容易变性的物质如蛋白质的长期保存。通常将酶冷冻干燥以长期保持它们的活性。但是，有许多酶随类型和纯度的不同而在冻干过程中容易变性和失活。因此，可向目标物质加入蛋白质如白蛋白和糖类如蔗糖或海藻糖作为其稳定剂以解决该问题。例如，JP-A 56-148291公开了酶稳定剂，其包括蔗糖和牛或人的血清白蛋白。然而，还没有对所有类型的蛋白均有效的稳定剂，对每种蛋白都有效的稳定剂的研究正在进行之中。为了质量对照和其它目的，已对ALP的冷冻干燥进行了各种报道。例如，关于可影响冷冻干燥的将糖类加入ALP的作用而言，对海藻糖、甘露糖醇和乳糖进行了比较(J.Pharm.Pharmacol.，45(10)，86-93页，1993)。根据该报道，海藻糖相比乳糖具有较强的稳定作用，乳糖相比甘露糖醇具有较强的稳定作用。其中仅仅使用了初步纯化的源自牛小肠粘膜的酶，而没有对人源酶进行研究。据J.Pharm，Pharmcol.，45(10)，900-906页，1993中所述当使用纯化的源自牛小肠粘膜的酶并以糖化的人血清白蛋白作为添加剂进行冷冻干燥时，产生了负性效应。由于糖化的白蛋白是通过将还原糖和白蛋白相组合而得，所以不优选使用这种组合作为添加剂。据报道当使用15％的海藻糖作为唯一的添加剂时，ALP可在冻干过程中丧失活性，并且按照比较实施例所述进行干燥后，仅获得约40％的剩余活性。如上所述，标准物质在通常为1年或更长时间的保证期内必须是稳定的并且在使用时可显示一定的性能。到目前为止，已指明当将市售可得的冻干对照血清重构时，ALP的活性显示逐渐增加(Clin.Chem.18(4)，366-377页，1972)。
不能认为重构后使用是优选的。在ALP和肌酸激酶(CK)的情况下，对通过冷冻人血清和通过冷冻干燥人血清所得的质量对照物质进行比较，据报道以冷冻产品作为对照血清的效果更好(Clin.Biochem.，29(2)，183-185页，1996)。这些对照血清大多数是通过在固有的人源ALP之外还向血清中加入动物来源的酶而制得(Cli.Chem.，35(3)，510页，1989)。
尽管本应该使用人源酶，但实际上从伦理、感染和易得性的观点而言，经常使用的是各种彼此间性质不同的动物来源的酶(Clin.Chem.，33(11)，1971-1977页，1987)。
近年来，已经可以容易地从已建立的动物细胞和用遗传工程而非使用生物材料得到的重组细胞提取酶，并且现在可以得到包含人源酶的商品。例如，含有包括得自人羊膜细胞的ALP在内的多种冻干酶的对照血清在重构后显示活性增加(Analysis of Bio.Specimens，14(2)，81-89页，1991Clinical examination/equipment/reagent，15(4)，615-623页，1992)。
目前，包含人源ALP的质量对照物质的开发正加速进行。然而，包含人源ALP、在水中重构后不显示活性增加且长期保存稳定的冷冻干燥产品尚未见报道。
本发明的目的是提供含有人源ALP、在水中重构后不显示活性增加且长期稳定的冷冻干燥制剂，还涉及稳定制剂中人源ALP的方法。


为解决以上问题，本发明的发明人已进行了深入的研究，并已发现在对人源ALP进行冷冻干燥时加入选自半乳糖、乳糖和果糖的糖以及白蛋白或葡聚糖，可以出人意料地得到在冻干前后活性变化小且长期稳定的组合物。本发明基于该发现而完成。也就是说，本发明通过在选自半乳糖、乳糖和果糖的糖和白蛋白或葡聚糖存在下对人源ALP进行冷冻干燥，提供了人源ALP稳定化制剂，其可以长期保存、在实际使用时高度稳定且在使用时即重构时不显示活性变化如活性升高。
以下将详细描述本发明。可用于本发明的冷冻干燥制剂中的糖优选选自半乳糖、乳糖和果糖，且糖的浓度优选为0.5至20(w/v)％，更优选为1至10(w/v)％。这些糖可以单独使用或者作为两种或三种糖的混合物使用。
白蛋白可以是哺乳动物白蛋白如人或牛血清白蛋白(BSA)，或者鸟类白蛋白如鸡血清白蛋白，且白蛋白的浓度优选为0.3至7(w/v)％，更优选为1至5(w/v)％。此外，也可以使用通过培养具有编码每种白蛋白氨基酸的基因的重组细胞并进行纯化所得到的产物。白蛋白是作为赋形剂使用的。其它可显示与白蛋白相同效果的蛋白质和多糖如葡聚糖可以单独使用或者组合使用。使用时葡聚糖的量优选为0.3至7(w/v)％，更优选为1至5(w/v)％。
可用于本发明的碱性磷酸酶优选为人源酶。已知肝、肾、骨、小肠和胎盘是人源ALP的来源，可以从这些生物材料获取酶。胎盘来源的酶市售可得，但从伦理和感染的观点而言，从这些生物材料获取酶不是优选的。从细胞系如HeLa细胞系和羊膜细胞系的培养产物可以获得所述的酶。此外，由遗传工程技术最近的进展可知编码人源ALP蛋白的基因，从含有那些基因的转化细胞中可获得所述的酶。例如，肝脏型ALP可由转化的动物细胞得到并进行纯化，例如由Asahi Kasei Co.，Ltd出售的肝脏型ALP(见Asahi Kasei Co.，Ltd的诊断酶目录)。
这里，人肝脏型ALP基因与所谓的人器官非特异性ALP基因是相同的。既然如此，也可以使用转化细胞，这些细胞不仅可以是人体细胞，还可以是不同于人体细胞的动物细胞如源自中国仓鼠的CHO细胞，以及微生物细胞如大肠杆菌、酵母和霉菌。也可以使用通过缺失或替代ALP的部分氨基酸序列且加入其它氨基酸残基或氨基酸序列而得到的编码ALP衍生物的转化基因。除市售可得之外的那些所制备的酶，在通过结合公知纯化方法如柱色谱法将它们的纯度提高到实用水平后，也可用于本发明的目的。
本发明的冷冻干燥制剂中ALP的加入量没有特别的限制，但优选9至6500U/L，更优选45至1300U/L。
冷冻干燥前水溶液的pH约为中性，特别地为约6.5至8.5。由于希望冻干产品于其中重构的溶液的pH处于相同的范围内，所以可使用浓度为5至200mM、特别是10至100mM的适宜的缓冲液，例如Good缓冲液如PIPES、HEPES或BES、磷酸盐缓冲液或Tris缓冲液。也可以适当地使用用来改善冻干制剂形态的各种添加剂如葡聚糖、葡聚糖硫酸酯以及糖醇如甘露糖醇。
由于已知ALP分子含有锌，所以例如可加入氯化锌，或者可适当地加入已知作为活化剂的氯化镁。可适当地加入已知对酶具有稳定作用的氨基酸如缬氨酸。
实施本发明的最佳方式基于实施例将对本发明进行描述。
实施例1向含有5％的乳糖、0.5mM的氯化镁、10μM的氯化锌和400U/L的人肝脏来源的ALP(T-73号，由Asahi Kasei Co.，Ltd.生产)的20mMPOPSO-NaOH缓冲液(pH7.5)中(1)不加BSA、(2)加入1(w/v)％的BSA和(3)加入3(w/v)％的BSA，取每种所得的溶液2ml注射入小瓶中并进行冷冻干燥。在以上各种条件下，于37℃下对每种冻干产品进行温度加速试验，然后于每周测量时用2ml蒸馏水重构以测量ALP活性，试验持续达4周。每个样品的剩余活性的变化显示于表1。与无BSA的系统相比，在加入BSA的系统中观察到显著的稳定化作用。
表1剩余活性(％)

实施例2将3％的蔗糖、3％的半乳糖和3％的乳糖各自加入到含有3％的BSA、0.1mM的氯化锌、30mM的缬氨酸和400U/L的人肝脏来源的ALP的20mM BES-NaOH缓冲液(pH7.5)中，取每种所得的溶液3ml注射入两个小瓶中并进行冷冻干燥。向每个冻干产品加入3ml蒸馏水将其重构以测量ALP活性。将剩余的一个小瓶置于37℃的培养箱中并放置1周。此后，用同样的方式测量ALP的活性。如表2所示，本发明的加入半乳糖和乳糖的产品较加入蔗糖的系统显示出更高的剩余活性。
表2剩余活性(％)

实施例3将5(w/v)％的半乳糖、5(w/v)％的果糖和5(w/v)％的乳糖各自加入到含有3％的BSA、0.5mM的氯化镁、10μM的氯化锌和400U/L的人肝脏来源的ALP(T-73号，由Asahi Kasei Co，Ltd.生产)的40mM PIPES-NaOH缓冲液中，取每种所得的溶液2ml注射入小瓶中并进行冷冻干燥。冻干条件是在-50℃的冷冻温度下抽真空后，于-10℃下进行12小时的主干燥，于20℃下进行24小时的再干燥，并且进行真空封盖。向每个冻干产品中加入2ml蒸馏水将其溶解以测量每种加糖产品的ALP活性。将剩余的小瓶置于37℃的培养箱中，每周用2ml蒸馏水溶解一份产品以测量ALP活性，持续达3周。剩余活性见表3所示，冻干刚结束时酶的活性为100％。与不加糖时相比，分别加入半乳糖、果糖和乳糖时的ALP剩余活性显著地提高。
表3剩余活性(％)

实施例4向含有3％的BSA、0.5mM的氯化镁、10μM的氯化锌和400U/L的人肝脏来源的ALP(T-73号，由Asahi Kasei Co，Ltd.生产)的40mMBES-NaOH缓冲液中(1)不加糖、(2)加入1(w/v)％的半乳糖，和(3)加入3(w/v)％的半乳糖、(4)加入5(w/v)％的半乳糖和(5)加入3(w/v)％的甘露糖，取每种所得的溶液2ml注射入小瓶中并进行冷冻干燥。在以上各种条件下，于37℃下对每个冻干产品进行温度加速试验，然后于每周测量时用2ml蒸馏水溶解以测量ALP活性，试验持续达4周。每个样品的剩余活性的变化如表4所示。由该表可确定，尽管加入半乳糖产生了效果，但加入甘露糖的产品在3周后显示活性突然下降。
表4剩余活性(％)

实施例5将5(w/v)％的半乳糖或5％(w/v)的3-乳糖加入到含有1％的BSA、3％的葡聚糖60K、0.5mM的氯化镁、10μM的氯化锌和400U/L的人肝脏来源的ALP(T-73号，由Asahi Kasei Co.，Ltd.生产)的40mM BES-NaOH缓冲液中，取每种所得的溶液2ml注射入小瓶中并进行冷冻干燥。在将冻干产品溶解并对其初始活性进行测量后，在25℃、37℃和45℃的培养箱中分别置入4个小瓶，进行加速降解试验。结果如表5所示。然后，基于这些结果，用阿仑尼乌斯方程式(J.Biol.Stand.，12，195-224页，1984)计算每个样品在保存于4℃和-10℃时其剩余活性变为98％时所需的时间，如表6所示。计算结果表明当将半乳糖溶液和乳糖溶液保存于4℃时，其将稳定1年或更长时间，当保存于-10℃时，将稳定约15年。
表5剩余活性(％)

表6

实施例6将5(w/v)％的半乳糖或5(w/v)％的乳糖、或作为比较实施例的海藻糖加入到含有3％的BSA、0.5mM的氯化镁、10μM的氯化锌和400 U/L的人肝脏来源的ALP(T-73号，由Asahi Kasei Co.，Ltd.生产)的40mMBES-NaOH缓冲液中，将2ml所得溶液注射入小瓶中并进行冷冻干燥。于冷藏(5℃)6个月期间检测活性的变化。其结果如表7所示。加入海藻糖的冻干制剂的活性在4个月内降低了8.6％，而本发明制剂没有显示活性降低。
表7剩余活性(％)

实施例7将5(w/v)％的半乳糖、5(w/v)％的乳糖和5(w/v)％的果糖各自加入到含有3％的BSA、0.5mM的氯化镁、10μM的氯化锌和400U/L的人肝脏来源的ALP(T-73号，由Asahi Kasei Co.，Ltd.生产)的40mM BES-NaOH缓冲液中，取每种所得的溶液2ml注射入小瓶中并进行冷冻干燥。将冻干产品溶于2ml蒸馏水中，然后于25℃静置。在溶有产品的溶液中的ALP活性的变化以剩余活性的形式显示于表8。在加入各种糖的情况下，活性都没有增加，并且稳定状况持续达48小时。
表8剩余活性(％)


实施例8将3％的葡聚糖(分子量60000-9000Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)或3％的BSA加入到含有5％的半乳糖、0.01mM的氯化锌、0.5mM的氯化镁和400U/L人肝脏来源的ALP的20mM POPSO-NaOH缓冲液(pH7.5)中，取每种所得的产品2ml注射入小瓶中并在与实施例3相同的冷冻干燥条件下进行冻干。在以上各种条件下，于37℃下对每个冻干产品进行负载试验，然后于每周测量时将其溶解于2ml蒸馏水中以测量ALP活性，试验持续达4周。每个样品的剩余活性的变化如表9所示。对于葡聚糖，也可以确定其具有稳定化作用，但较BSA稍差。应该注意的是其中既没有加入葡聚糖也没有加入BSA的产品被用作对照品，其试验结果是该产品不能被充分冻干。
表9剩余活性(％)

工业适用性本发明提供了用于临床检验的、冷冻干燥的含有碱性磷酸酶的制剂，具体而言提供了一种冷冻干燥制剂，其中的人源碱性磷酸酶是稳定的，该制剂在水中重构后不显示活性增加并且可以长期保存。


本发明提供了冷冻干燥的人源碱性磷酸酶制剂，其是通过向含有人源碱性磷酸酶的溶液中加入选自半乳糖、乳糖和果糖的糖和白蛋白或葡聚糖并对混合物进行冷冻干燥而得到。该制剂在水中重新溶解后不显示活性增加并可长期保存。本发明还提供了稳定该制剂的方法。