专利名称：一种提高轮叶党参抗癌活性的方法轮叶党参(CodonopsisLanceolata Benth. et Hook. F.)又名羊乳、四叶参、山胡 萝卜、山海螺及白蟒肉等，是桔梗科党参属植物羊乳的根，多分布于中国东北、华南、西南地 区及朝鲜、日本、俄罗斯等国家，在民间常将它作为山野菜食用。传统上其根入药，味甘、性 平，是常用的补中益气药，有排脓消肿、清热解毒、补虚通乳、养阴润肺及祛痰之功效。主要 用于病后体虚、乳少、肺阴虚、肿痈、乳痈、疮疡肿毒等症。现代药理研究表明轮叶党参具有 镇静镇痛、提高学习记忆、抗氧化和增强免役等作用。文献报道轮叶党参中含有多糖、齐墩 果酸、皂苷类、黄酮类、挥发油类等成分。而有研究表明多糖，齐墩果酸有较好的预防肿瘤的 作用。然而，用一定浓度的乙醇水溶液浸泡轮叶党参生药材24小时后，得到的提取物对小 鼠肿瘤生长没有明显的抑制作用。
本发明的目的是提供一种提高轮叶党参抗癌活性的方法，具体是提供一种生物发 酵方法，以显著提高轮叶党参抗癌有效成分含量。本发明的技术方案为一种提高轮叶党参抗癌活性的方法，首先 将鲜轮叶党参切片或勻浆， 或者将干轮叶党参粉碎， 或者将干燥的轮叶党参粉末，然后用水浸泡，高压灭菌，在温度降至30°C以下时在无菌条件下加入活性酵母0. 5 9Γ5. O %，葡萄糖1% 8%，在2(T37°C条件下发酵广10天，发酵结束后，加入极性溶剂，在 O0C 100°C优选70°C 100°C下提取5分钟 24小时，过滤，回收溶剂，减压浓缩或冷冻干燥。所述的极性溶剂为乙醇或水。所述经减压浓缩或冷冻干燥后所得到的轮叶党参提取物，用液液分配技术和色谱 技术进行精制，得到轮叶党参皂苷，用于制备抗癌药物或食品，也可在肿瘤化学预防制剂中 的应用。将发酵的轮叶党参分别用蒸馏水、30%乙醇、50%乙醇及70%乙醇加热回流提取5 分钟 24小时，过滤或离心，除去不溶性物质后，减压浓缩，用659Γ80%乙醇醇沉，去掉蛋白 质和多糖，回收乙醇，真空干燥或冷冻干燥，得到轮叶党参提取物，通过柱层析方法进行精 制，得到轮叶党参皂苷，用于肝癌抑制实验和二乙基亚硝胺(DEN)诱发肝癌的预防实验。本发明人用轮叶党参乙醇提取物进行动物酒精性肝损伤保护作用研究，证明其具 有明显抑制乙醇对肝脏的损伤作用，还证明了轮叶党参总皂苷具有明显的抗突变作用。本发明人对轮叶党参乙醇提取物的抗突变成分进行过系统分离鉴定，发现其中的齐墩果酸、 蒲公英赛醇、α -菠留醇等成分具有较强的抗突变作用，其中齐墩果酸的抗突变作用最强。本发明人发现，轮叶党参用活性酵母发酵后得到的乙醇水溶液提取物，抑制小鼠 体内Η22肝癌生长作用明显优于未发酵的轮叶党参乙醇水溶液，其抑制率达到51% ；明显抑 制致癌物二乙基亚硝胺诱发大鼠肝癌癌前病变及肝毒性。用体外细胞培养方法证明发酵 轮叶党参抗癌有效成分主要为轮叶党参皂苷。因此，采用适宜生物发酵技术，提高轮叶党参 中的抗癌活性成分有利于将轮叶党参利用于肿瘤的预防和治疗。研究发现，在干燥的轮叶 党参中加入一定浓度的活性酵母、葡萄糖，在适宜的温度下进行发酵，然后用乙醇水溶液提 取，所得到的提取物，明显抑制小鼠体内Η22肿瘤的生长。经有机溶剂萃取后，在体外明显 抑制Η22和HepG2癌细胞的增殖，且正丁醇萃取部位的活性最强。用活性酵母发酵轮叶党 参之后，皂苷含量明显增高。本发明得到的发酵轮叶党参乙醇提取物还可以显著预防二乙 基亚硝胺的肝脏毒性，可以预防肝癌的癌前病变。有效成分以轮叶党参苷、丁香苷为代表。本发明得到的提取物发酵轮叶党参总皂苷对小鼠H22肿瘤的抑制作用及对DEN肝 脏毒性的预防作用实验如下1材料与方法 1.1试验药物轮叶党参为本地区野生轮叶党参，洗净，切片，晒干。二乙基亚硝胺(DEN)为日本半井化学药品株式会社产品，注射用环磷酰胺为江苏 恒瑞医药股份有限公司产品，批号01102521。MDA、GSTs、TNF-a试剂盒均购自南京建成生 物工程研究所。SUNRISE酶标仪为瑞士 Tecan公司产品。未发酵轮叶党参总皂苷制备取干燥的轮叶党参生药材2kg，粉碎，用50%的乙醇 回流提取，回收乙醇，用609Γ80%乙醇醇沉，除去蛋白质和多糖后，回收乙醇，减压干燥，用 DlOl大孔吸附树脂分离其中的轮叶党参粗皂苷。发酵轮叶党参总皂苷制备取干燥的轮叶党参生药材2kg，粉碎，用水浸泡，高压 灭菌，在无菌条件下加入活性酵母0.5 9Γ5.0 %，葡萄糖1% 8%，在2(T37°C发酵时间为广10 天，发酵结束后用50%的乙醇回流提取，在70°C 10(TC下提取5分钟 24小时，回收乙醇， 用609Γ80%乙醇醇沉，除去蛋白质和多糖后，回收乙醇，减压干燥，用DlOl大孔吸附树脂分 离其中的轮叶党参皂苷。1.2 实验动物昆明种小鼠，雌雄各半，体重20 22g，每组10只，由延边大学医学部实验动物科提供。1.5肿瘤抑制试验
在无菌条件下取生长7天的小鼠移植性H22肿瘤腹水，用8倍体积生理盐水稀释，于小 鼠前肢腋窝皮下接种0. 2ml/只。以上瘤株接种前，均用0. 2%台盼蓝染色，计活细胞数为 95% 98%。动物于接种次日随机分组，每组10只，同样条件正常饲养。抑瘤实验设阴性对 照组(每日灌胃蒸馏水10ml/kg)、环磷酰胺对照组(每日腹腔注射环磷酰胺25mg/kg)、发酵 轮叶党参总皂苷高剂量组(每日灌胃220mg/kg)、中剂量组(每日灌胃110mg/kg)、低剂量组 (每日灌胃55mg/kg)。接种次日起每天给药一次，连用10天。10天后采用脱颈椎法处死， 剥取瘤块后称量肿瘤的重量。1.6预防二乙基亚硝胺肝脏毒性试验昆明种小鼠50只，雌、雄各半，体重20 22g，由延边大学医学部实验动物科提供，试 验前先在本实验室内适应性喂养3天。实验动物随机分为阴性对照组、单纯DEN组、轮叶党 参总皂苷低剂量组、中剂量组、高剂量组，每组10只动物。阴性对照组每日灌胃蒸馏水10 ml / kg bw;单纯DEN组和轮叶党参总皂苷三个剂量组隔日腹腔注射DEN 20 mg/kg bw， 连续5周；同时，轮叶党参总皂苷低、中、高三个剂量组分别灌胃轮叶党参总皂苷55mg/kg、 110mg/kg、220mg/kg。每天记录各组小鼠的体重变化情况。停药后禁食12h，称量各组小鼠体重，采用脱颈椎法处死小鼠，每只小鼠在同一个 部位取一块肝组织，通过HE染色法观察肝脏组织学变化，每只小鼠肝组织标本观察50个高 倍视野，计数每组核分裂相及枯否细胞(HE染色X40)。每只小鼠取100 mg肝组织，加0.9 ml生理盐水用冰浴勻浆，1 500 Xg离心30 min后取上清液，采用酶动力学法测定上清液中 GSTs、MDA含量；采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测肝组织勻浆上清液中TNF-α含量；采用 考马斯亮蓝法测定勻浆液中的蛋白含量。结果
2. 1轮叶党参总皂苷抑制小鼠Η22肝癌生长作用


本发明涉及一种提高轮叶党参抗癌活性的方法，将鲜轮叶党参切片或匀浆，或者将干轮叶党参粉碎，或者将干燥的轮叶党参粉末，然后用水浸泡，高压灭菌，在温度降至30℃以下时在无菌条件下加入活性酵母0.5%~5.0%，葡萄糖1%~8%，在20~37℃条件下发酵1~10天，发酵结束后，加入极性溶剂，在0℃~100℃下提取5分钟~24小时，过滤，回收溶剂，减压浓缩或冷冻干燥。用本发明可以提高轮叶党参对肿瘤生长抑制作用。