专利名称：高效激发小麦抗黄花叶病毒病的复制酶基因片段及应用的制作方法小麦是世界第一大粮食作物。同其它作一祥，小麦也经常受到病虫的侵染，导致减产和品质下降。其中由禾谷多黏菌传播的土传花叶类病毒病分布最广、种类最多、危害最严重。在我国，土传花叶类病毒病自20世纪70年代发现以来，一直是我国河南、江苏、安徽、山东等冬小麦种植区常发的重要病害之一，已成为影响我国小麦高产优质的重要制约因素之一。估计，毎年土传病毒病发病面积超过3000万亩，减产150万吨以上。病害为害严重，防治困难的原因，其ー是因为土传病毒是由土壌中的禾谷多黏菌传播，而禾谷多黏菌产生的休眠孢子具有极强的抗逆性，难以用化学方法防治。轮作、推迟栽培等农事操作防治效果并不理想。目前防治该病害的主要措施是种植抗病品种。其ニ是引起小麦黄花叶病害的病原物种类很多。针对不同地区的病毒株系，品种的抗病性表现差异很大，缺乏广谱抗病品种， 并且部分重病区抗病品种资源严重缺乏。其三是不断出现新的病毒和致病株系导致抗病品种的抗性丧失。
本发明要解决上述现有技术的缺点，提供ー种高效激发小麦抗黄花叶病毒病的复制酶基因片段及应用，是一段激发小麦抗黄花叶病毒病的复制酶基因片段的核苷酸序列， 从根本上解决生产中的小麦黄花叶病毒病的危害，利用本发明提供的这段特异的核苷酸序列片段，可以高效的激发不同小麦品种的抗病能力，即表达本序列片段的小麦植株可有效的抵抗病毒的侵染。本发明采用了以下的技术方案这种高效激发小麦抗黄花叶病毒病的复制酶基因片段，具有SEQ ID NO: I所述的核苷酸序列。利用上述的高效激发小麦抗黄花叶病毒病的复制酶基因片段，将上述核苷酸序列连接到真核表达启动子下游后进行常规的外源基因在小麦体内表达，表达本序列片段的小麦植株在有效抵抗病毒侵染方面的应用。本发明有益的效果是利用一段来源于小麦黄花叶病毒保守序列的核苷酸片段， 激发小麦的抗病性。由于此段序列是病毒复制所必须的复制酶基因片段，具有高度保守性及进化稳定性，因而，利用此片段激发的小麦抗病性具有广谱抗病性和长期稳定性。图I载体pUib_35S示意图。下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明本发明提供了一段反义小麦黄花叶病毒复制酶基因片段，此片段在小麦细胞内表达后可引起持续、高效的抗小麦黄花叶病毒病的特性。本发明包括此段反义小麦黄花叶病毒复制酶基因的核苷酸序列，此段核苷酸链的同源性分析以及此段反义RNA序列的DNA克隆和表达载体构建。其中，所采用的病毒来源是江苏省扬州市里下河研究所感染小麦黄花叶病毒的小麦叶片，提取感病叶片总RNA后，利用此片段相应正义RNA链上特定序列扩增获得cDNA片段，利用相应的酶切位点将正义RNA链上部分复制酶基因反向插入表达载体中， 使得表达后可产生反义RNA片段，此片段经验证可激发小麦高抗黄花叶病毒病的特性。此基因片段可推广应用到其它抗小麦黄花叶病毒病的种质创建。一、序列的获得取自感染小麦黄花叶病毒扬州分离物的小麦叶片约O. I克，利用Trizol从样品组织中提取总RNA(参照Invitrogen公司说明)，以此总RNA中小麦黄花叶病毒(WYMV)基因组RNA为模板，进行逆转录及聚合酶链式反应。具体方法如下根据本实验之前报道的 WYMV扬州分离物RNAl基因组全序列(AJ131981)设计引物FcWYV B5，(nts5284_5302) 5’-CGGATCCATGATCAGAATGTTG GAAG-3’和FcWYV B3’(nts 6495-6475) :5’_CGGATCCTTAGAGC TCAATGCTGCTATC-3’，并利用下游引物，FcWYV B3及所获得的总RNA在42°C恒温下进行逆转录反应，逆转录酶为Promega公司的SuperScriptII,反应体系如下5XRT Buffer 2 μ L,
2.5mmol/L dNTP 2μ L,0. lmol/L DTT I μ L，RNA酶抑制剂 0. 2 μ L，逆转录酶 0. 5 μ L，反应总体积为10 μ L。以逆转录所获得的单链DNA片段为模板，FcWYV B5和FcWYV B3伟引物进行 PCR反应。反应体系如下IOx卩0 反应缓冲液5 4 1^，(1见13(2_01/1)5 4 1^ 0^￥ B5 I μ L， FcffYV Β3 I μ L，合成的cDNA 2 μ L, KOD (Τ0Υ0ΒΑ公司)酶I μ L，无菌水补足至50 μ L。反应条件为94°C预变性5分钟，94°C变性30秒，55°C退火30秒，68 °C延伸2分钟，30个循环， 68°C延伸10分钟。目的PCR产物大小约I. 2Kb，PCR产物茎Qiagen凝胶纯化试剂盒纯化后，利用TOYOBA T-Blunt载体进行PCR片段的克隆，反应条件如下，IOX ligation Buffer 2 μ L，T-Blunt I μ L, PCR 回收片段 10 μ L, PromegaT4_Ligase I μ L,无菌水补足至 20 μ L, 混匀后4V反应16小时。反应完毕后，取10 μ L反应液加入含有100 μ L大肠杆菌感受态的离心管中，轻轻混勻冰上放置25分钟,42°C热激90秒,立即放置冰上2-3分钟，向离心管中加入LB培养基800 μ L，37°C孵育I小时后，取300 μ L培养液涂布于含有lOOmmol/L氨苄青霉素，lmmol/L IPTGjP 10mg/L的固体LB培养基上，37°C倒置培养16小时。之后选择白色菌落送上海Invitrogen公司测序。含有插入序列的克隆命名为T_Nibl。二、序列的应用方法利用分子生物学实验技术将获得核苷酸片段反向连接到Ubi或35S启动子下游， 进行常规的植物表达载体构建后进行外源基因在小麦体内的表达，表达的反向核苷酸序列即可高效激发小麦的抗WYMV特性。浙江省农业科学院病毒学与生物技术所根据已报道的小麦黄花叶病毒中国扬州分离物RNAl基因组全序列(AJ131981)设计引物FcffYV B5，(nts5284_5302) 5’ -CGGATCCATGATCAGAATGTTG GAAG-3’ 和 FcffYV B3’ (nts 6495-6475) :5’ -CGGATCCTTA GAGCTCAATGCTGCTATC-3’，该对引物特异性的扩增WYMV复制酶(NIb)基因3’ -端2/3全长序列，扩增的目的序列长1212个核苷酸。载体pUib-35S (图I载体pUib-35S示意图(BamH I为唯一的克隆位点)及反向插入Nib8基因的核苷酸序列)用BamH I酶切后平端化，连接平端化的PCR扩增产物，获得插入有WYMV部分复制酶基因序列的克隆。根据载体pUib-35S的BamHI单克隆位点上游的Ubi-I intron序列设计测序引物Ubi-I 5， 5’ -CGCTATTTATTTGCTTGGTACGG-3’，通过序列测定确定外源基因的插入方向，最终获得反向插入WYMV部分复制酶基因序列的克隆WYMV-Nib8，采用组成型启动子Ubiquitin构建了用于小麦转化的高效表达载体PUbiNib8.之后利用基因枪共转化法将pUbiNib8载体导入受体品种扬麦158 (高度感病品种)，转基因植物田间接种实验表明，转入此序列的扬麦158可 100%提高抗WYMV的抗性田间抗病性分析也证实此免疫此序列可有效激发小麦品种的抗 WYMV特性。SEQ ID NO IATGATCAGAA TGTTGGAAGA CGCCGGCCTA ACTCAAGGCG ACGTGAGGAC ACCCCAACAG GTTGTTTCAG ACATGCAGTGGAACACTTCC GCCGGACCAA GCTACCAGGG CAAGAAAAGA GACGTTTGCG CACATCTCAG CGAGCAGGAA GTTCTACACCTTGCAGAAAC GTCGCGACAG CAGTTTCTAG CCTGCAATTC CATCGGCATT TGGAACGGAT CGCTCAAAGC AGAGCTTAGGACGATTGAGA AAGTGGAAGC TGAGAAAACC AGAGTTTTCA CGGCTTCGCC AATCACGAGT CTATTCGCCA TGAAGTTCTACGTTGACGAT TTCAACAAGA AGTTCTATGC GACAAACCTG AAAGCCCCAC ACACGGTAGG AATTAACAAA TTTAGCAGAGGCTGGGAAAT GCTCCACGAC AAGCTCAACC GCCCAGGTTG GCTTCACGGC AGTGGCGATG GGTCACGATT TGATAGTTCAATTGACCCTT TCTTCTTCGA CATAATCAAG GAGATTCGAA AGCACTTTCT ACCAGTTGAG CACCATCGCG CAATCGACCTAATATACGAC GAGATTCTCA ACACCAACAT TTGTTTGGCA AATGGCATGG TGATTCGAAA GAACGTTGGG AATAACAGCGGGCAGCCAAG CACGGTCGTA GACAACACAC TTGTTCTCAT GGTCTCTTTT CTCTACGCTT ACATTCATAA AACCGGAGACCATATGCTCA AGAAACTCAA CGACAGATTT GTTTTCGTCT GCAATGGTGA CGACAACAAA TTTGCCATTT CCCCAGAATTCGACGCCGAG TTCGGTCACG ACTTTTCACC GGAGCTCACA GAGCTAGGTT TGACGTACGA GTTTGACGAC ATAACAGATGACATGTGTGC AAACCCCTAC ATGTCCCTGA CCATGGTCCG CACTCCCTTT GGAATTGGGT TCTCTTTGCC CGTGGAACGCATTGTAGCAA TAATGCAGTG GGCTAAGAAG GGCGGCGTTC TGCACTCTTA CTTGGCAGGA ATCTCAGCCA TTTACGAAAGCTTCAACACA CCAAAGTTGT TCAAATCAGT CTATGCGTAT TTGTTATGGC TGACAGAGGA ACACGGCTCT GACATCCTAGCTGCAATGAC CGGAACAGAG ACAGCTCTCC CAATTCCTTC CATGCTCGAT GTGTACCGCCTCCACTATGG TGATAGCAGCATTGAGCTCC AA除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。


本发明涉及一种高效激发小麦抗黄花叶病毒病的复制酶基因片段及应用，是一段激发小麦抗黄花叶病毒病的复制酶基因片段的核苷酸序列，这种高效激发小麦抗黄花叶病毒病的复制酶基因片段，具有SEQ ID NO1所述的核苷酸序列。利用上述的高效激发小麦抗黄花叶病毒病的复制酶基因片段，将上述核苷酸序列连接到真核表达启动子下游后进行常规的外源基因在小麦体内表达，表达本序列片段的小麦植株在有效抵抗病毒侵染方面的应用。本发明有益的效果利用来源于小麦黄花叶病毒保守序列的核苷酸片段，激发小麦的抗病性。由于是病毒复制所必须的复制酶基因片段，有高度保守性及稳定性，利用此片段激发的小麦抗病性具有广谱抗病性和长期稳定性。