专利名称：非复制性微生物及其免疫强化效应的制作方法非复制性微生物及其免疫强化效应本发明一般涉及微生物领域，特别是食品级细菌。本发明的一个实施方案涉及属于乳杆菌属、双歧杆菌属或其组合的非复制性益生菌，例如副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)、乳酸双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)、短双歧杆菌(Bifidobacteriumbreve)或其组合，以及这些细菌的应用。本发明的一个实施方案涉及非复制性益生菌及其在制备用于治疗或预防涉及受损(compromised)免疫防御的疾病的组合物中的用途。益生菌可定义为“当以足量施用时，对宿主产生健康益处的活的微生物”(FA0/WHO(2001)Health and Nutritional Properties of Probiotics in Food includingPowder Milk with Live Lactic Acid Bacteria. Report of a Joint FAO/WHO ExpertConsultation on Evaluation of Health and Nutritional Properties of Probioticsin Food Including Powder Milk with Live Lactic Acid Bacteria)。因此，绝大多数公开的文献都涉及活的益生菌。然而，一些研究探讨了由非复制性细菌产生的健康益处，但得出的结论是热失活益生菌一般导致丧失其声称的健康益处(Rachmilewitz, D. , K.等人，2004, Gastroenterology 126 :520-528 ;Castagliuolo, I.等人，2005, FEMS Immunol. Med.Microbiol. 43 :197-204 ；Gill, H. S.和 K. J. Rutherfurd. 2001，Br. J. Nutr· 86 :285-289 ；Kaila, M.等 A, 1995, Arch. Dis. Child 72 :51-53 ；ffagner, R. D.等人，2000，J. FoodProt. 63 :638-644)。然而，一些研究显示杀死的益生菌可能保留了一些健康效应。这可能取决于例如用于失活它们的方法(Rachmi lewitz, D. ,K.等人，2004, Gastroenterology 126:520-528;Gill,H. S.和 K. J. Rutherfurd. 2001，Br. J. Nutr. 86 :285-289)。文献中用于杀死益生菌菌株的技术大部分是热处理、Y-辐射、UV处理或化学剂(福尔马林、低聚甲醛)。一般而言，在如今的食品工业中，添加益生菌的食品一般在低温运输系统(coldchain)中储藏较长时间和/或经处理降低了细菌负载。然而，降低产品中的细菌负载、长的储藏时间以及任何种类的加工如喷雾干燥等，降低了产品中的可复制性(viable)益生菌的量。而降低产品中的可复制性益生菌的量在本领域中通常等同于降低或者甚至丧失所声称的益生菌的上述健康效应。一些包含特定的被杀死的益生菌的制品可能保留了一部分健康效应，该发现是令人鼓舞的，一般认为活的益生菌具有比失活的益生菌更好的或者至少相同的效应。然而，理想的是获得在失活后具有改善的或新的健康效应的可获得的微生物细胞制品。受损的免疫防御对对象的健康状态可能具有许多负面的影响。例如可以导致更大的感染风险和/或增加的感染严重程度。还可以促进或加强免疫缺陷相关性疾病，或导致过敏。因此，对于所有年龄段的所有对象，加强免疫防御对保护身体是重要的。特别的是，对这样的对象而言是重要的，所述对象的免疫系统处于受损的或暂时受抑制，例如新生儿、老年人、经受高压力条件的对象，服用免疫抑制剂的患者，处于放疗或化疗的患者或出、现过敏性疾病的对象。其中，抗感染和免疫缺陷相关性疾病的天然防御暗示宿主能够发起有效且快速的先天性免疫防御，包括激活例如巨噬细胞和天然杀伤细胞。此外，有效的免疫防御还暗示宿主能够下调免疫系统的过度反应，例如过敏中发生的。巨噬细胞响应病原体的吞噬作用的杀伤活性通常伴随有暂时加强的促炎性细胞因子，例如 TNF-a、IL-6、IL-1 和 IL-12 (Shoda, L.等人，2000, Infection and Immunity68 :5139-5145)。由抗原呈递细胞(包括巨噬细胞)生产的IL-12激活天然杀伤细胞生产IFN- Y，并通过分化生产IFN- Y的T辅助细胞而促进获得性免疫应答的出现。此外，TNF-α和IFN-Y在自分泌环路中的作用刺激吞噬细胞的杀伤活性(Soehnlein，O.等人，2008, Journal of Clinical Investigation 118:3491-3502)。相反，许多免疫细胞类型生产的IL-10抑制由巨噬细胞和树突状细胞生产的促炎性细胞因子的生产，如IL-l、IL-6、IL-12和TNF-α (Mosser,D.和Zhang,X. ,2008,Immunological Reviews 226 :205-218)。已知特定的活益生菌菌株在体外刺激促炎性细胞因子，例如IL-12和TNF-α，所述促炎性细 胞因子与大鼠腹膜巨噬细胞增强的吞噬作用活性相关联(Ishida-Fujii，K. ,2007, Biosc.Biotechnol. Biochem 71 :866-873)。在人中(健康的成人和老年人)，已报道消耗活的益生菌或含益生菌的食品增强了巨噬细胞的吞噬活性和/或天然杀伤细胞的杀伤活性，提示一些活的益生菌菌株的免疫增强效应(Sheih,Y-H.等人,2001, J Ameriacn College Nutrition 20 :149-156 ;Chiang,B.等人，2000, European J Clinical Nutrition 54 :849-855 ；Parra, M.等人，2004,J Physiol Biochem 60 :85-92 ;Nagao, F.等人，2000, Biosc Biotechnol Biochem 64:2706-2708)。然而。本领域仍然需要包含对宿主的免疫系统具有有益效应的益生菌的微生物细胞制品，其中所述细胞制品仅在处理后表现出它们的有益效应或处理后表现特别好，其中所述处理条件不允许所述微生物细胞复制和/或保留可复制性。因此，本发明的一个目标是进一步改善本领域的现状，提供对一些条件下的宿主的免疫系统表现出新的或改善的有益效应的微生物细胞制品，其中处理所述微生物细胞的方式不允许它们复制和/或保留可复制性。独立权利要求的主题解决了该目标。从属权利要求进一步发展了本发明。现有技术一般教导了热处理益生菌导致部分或完全丧失它们的健康有益特性。仅在例外情况下维持了一些测试到的健康益处(Verdu等人,2004, Gastroenterology, 127,第 826 页，Rousseaux, 2007, Nature Medicine, 13,第 35 页；Kamiya 等人，2006, Gut, 55,第191 页)。现在，本发明人令人惊讶的发现，热处理后可以增强益生菌菌株刺激例如人细胞生产促炎性细胞因子的能力。已在若干乳杆菌和双歧杆菌中观察到该效应。非复制性益生微生物具有远比其活的相应微生物更易于处理的优势。此外，它们的储藏更加稳定并需要较不严格的包装条件。非复制性益生微生物可允许开发大量的功能食品，这些功能食品在没有额外的保护措施的条件下，本质上不允许添加活的益生菌。这在例如提供压块干粮、果汁、UHT饮料、耐贮存饮料等中发挥了作用。此外，例如在免疫受损的消费者中，由于出现菌血症的潜在风险，因此使用活的益生菌可能受限制。在此，本发明人展示了产生具有体外免疫增强谱(profile)的不能复制的细菌的方法，而不论所述细菌初始的免疫谱。可复制时没有免疫增强谱的细菌可以提供免疫增强谱；而可复制时具有免疫增强谱的细菌可以提供提高的免疫增强谱。额外的，提供非复制性益生微生物允许热冲调，例如粉末状的营养组合物。因此，现在能够产生比其活的相应微生物更有效地提高免疫防御的非复制性益生微生物。现有技术一般教导由热处理导致非复制性的细菌通常在展现其益生特性时比活细胞的效率低，本发明人能够证实热处理的益生菌相比其活的相应微生物更好地刺激免疫系统。因此，本发明涉及包含益生菌的组合物，所述益生菌通过在至少约70°C下热处理 至少约3分钟致使其不复制。还涉及包含益生菌的组合物，其用于治疗或预防涉及受损免疫防御的疾病，所述益生菌通过在至少约70°C下热处理至少约3分钟致使其不复制。本发明涉及益生菌的用途，用于制备治疗或预防涉及受损免疫防御的疾病的组合物，所述益生菌通过在至少约70°C下热处理至少约3分钟致使其不复制。因此，本发明的非复制性益生菌可用于制备增强免疫防御的组合物。“非复制性”意指通过经典的涂板方法不能检测到可复制的细胞和/或集落形成单位。此类经典的涂板方法概括在微生物学书籍中James Monroe Jay,Martin J. Loessner,David A. Golden. 2005. Modern food microbiology,第 7版，Springer Science, New York,N. Y.第790页。典型的，缺少可复制细胞可表现如下在用不同浓度的细菌制品(“非复制性”样品)接种并在恰当的条件(好氧和/或厌氧气氛下至少24小时)下孵育后，在琼脂平板上没有可见的集落，或在液体生长培养基中没有增加的浑浊度。例如，可以通过热处理致使双歧杆菌(例如长双歧杆菌、乳酸双歧杆菌和短双歧杆菌)或乳杆菌(例如副干酪乳杆菌或鼠李糖乳杆菌)非复制，特别是低温/长时间热处理的情况下。至少95%重量，优选至少97. 5%重量，更优选至少99%重量的益生菌生物量是非复制性的，最优选的是所有的益生菌都是非复制性的。通过热处理致使益生菌非复制。该热处理可以在约70_150°C的温度范围内进行约3分钟-2小时，优选在80-140°C的范围内进行5分钟-40分钟。对本领域技术人员显而易见的是，热处理越久和/或温度越高，破坏和/或释放的细菌细胞或细菌化合物越多。益生菌可选自乳杆菌属、双歧杆菌属或其组合，例如副干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、长双歧杆菌、乳酸双歧杆菌、短双歧杆菌或其组合，例如菌株副干酪乳杆菌NCC2461、鼠李糖乳杆菌NCC4007、长双歧杆菌NCC3001、乳酸双歧杆菌NCC2818、短双歧杆菌NCC2950或其组合。长双歧杆菌NCC3001根据布达佩斯条约以ATCC BAA-999保藏，可获得自例如日本的 Morinaga Milk Industry Co. Ltd.,商标为 BB536。乳酸双歧杆菌NCC2818根据布达佩斯条约以CNCM 1-3446保藏。鼠李糖乳杆菌NCC4007根据布达佩斯条约以CGMCC I. 3724保藏。副干酪乳杆菌NCC2461根据布达佩斯条约以CNCM 1-2116保藏。短双歧杆菌NCC2950 (菌株A)根据布达佩斯条约以CNCM 1-3865保藏。通过体外免疫分型(immunoprofiling)验证非复制性益生菌的免疫增强效应。所使用的体外模型使用人外周血单核细胞(PBMC)的细胞因子谱，是本领域普遍接受作为测试免疫调节性化合物的标准模型(Schultz等人,2003, Journal of Dairy Research70,165-173 ;Taylor 等人，2006, Clinical and Experimental Allergy,36,1227-1235 ；Kekkonen 等人，2008, World Journal of Gastroenterology, 14,1192-1203)。已有一些作者/研究小组使用体外PBMC测定例如根据益生菌的免疫谱分类益生菌，S卩，它的抗炎性或促炎性特征(Kekkonen等人，2008, World Journal ofGastroenterology, 14,1192-1203)。例如，该测定表现出允许在肠道结肠炎的小鼠模型中预测益生菌候选物的抗炎性效应(Foligne, B.等人,2007, World J. Gastroenterol. 13 ·236-243)。此外，该测定常规上用作临床试验的读出结果，并表现出获得与临床结论符合的结果(Schultz 等人，2003, Journal of Dairy Research 70,165-173 ;Taylor 等人，2006,Clinical and Experimental Allergy,36,1227-1235)。在过去数十年间，过敏性疾病稳步增加，目前已被WHO认为是流行病。一般而言，过敏被认为是免疫系统的Thl和Th2应答失衡的结果，导致强烈的偏向于生产Th2介质。因此，通过重建免疫系统的Thl和Th2臂(arm)之间恰当的平衡，可以减轻、下调或预防过敏。这暗示必须降低Th2应答或增强，至少暂时的增强Thl应答。后者是免疫增强应答的特征，通常伴随着例如较高水平的IFN Y、TNF- α和IL-12 (Kekkonen等人，2008，World Journalof Gastroenterology, 14,1192-1203 ；Vil janen M.等人，2005, Allergy, 60,494-500)。本发明允许治疗或预防涉及受损免疫防御的疾病。因此，可以被使用本发明制备的组合物治疗或预防的与受损免疫防御相关联的疾病没有特别的限制。例如，可以选自感染，特别是细菌、病毒、真菌和/或寄生虫感染；吞噬细胞缺陷；低至严重的免疫抑制水平例如由压力或免疫抑制药物、化学疗法或放射疗法诱导的；自然状态下较低免疫活性的免疫系统例如新生儿或老年人的；过敏；及其组合。本发明描述的组合物还允许增强对象对疫苗的应答，特别是对口服疫苗的应答。同样的，使用本发明制备的组合物的种类没有特别的限制。例如，可以是药物组合物、营养食品、食物添加剂、宠物食物、食品或饮料。本发明的组合物可以是任何种类的组合物。组合物可以例如是口服、肠道、不经肠道(皮下或肌肉内)、局部或眼部施用的。例如，可以是选自食物组合物、食品包括宠物食物、饮料、营养配方、饲料配方、营养食品、食物添加剂、药物组合物、化妆品组合物和药物。食物添加剂或药物可以是例如片剂、胶囊、锭剂或液体的形式。这些组合物可以进一步包含保护性的水状胶体(例如树胶、蛋白质、改性淀粉)、粘合剂、成膜剂、封装剂/材料、壁/壳材料、基质化合物、包衣、乳化剂、表面活性剂、增溶剂(油、脂、蜡、卵磷脂等)、吸附剂、载体、填充剂、辅助化合物、分散剂、湿润剂、加工助剂(溶剂)、助流剂、口味遮蔽剂、增重剂、成凝胶剂、凝胶形成剂、抗氧化剂和抗菌剂。还可以含有常规的药物添加剂和佐剂、赋形剂和稀释剂，包括但不限于水、任何起源的明胶、植物性树胶、木质素磺酸盐(Iigninsulfonate)、滑石、糖、淀粉、阿拉伯胶、植物油、聚亚烧基二醇、芳香剂、防腐剂、稳定剂、乳化剂、缓冲液、润滑剂、着色剂、湿润剂、填充剂等。此外，组合物可以含有适合口服、舌下、局部、眼部、肠道或不经肠道(例如皮下或肌肉内)施用的有机或无机载体材料，以及维生素、痕量矿物质和根据政府机构如USRDA推荐的其他微量营养素。根据组合物的计划用途，本发明的组合物可以进一步包含其他试剂。例如可以帮助最小化由涉及免疫防御减弱的疾病导致的不舒适感的疼痛或发热缓解剂。 可以添加稳定剂来稳定组合物及其构件。可以添加芳香剂和/或着色剂来调节香味和赋予组合物颜色，使其易于鉴别和/或愉快的接受。 可以添加益生元。益生元可以在益生菌被导致不复制之前帮助其生长，或者在摄入的情况下，刺激肠道中的有益微生物生长。益生元还可以与组合物中存在的和/或添加的活的益生细菌协同作用。“益生元”意指促进肠道中的健康的、有益的微生物和/或益生菌生长的不可消化的食物物质。在摄入的个体中，它们在胃和/或肠道上段不被降解，在胃肠道中不被吸附，但却被胃肠道微生物丛和/或益生菌发酵。益生兀是例如Glenn R. Gibson和MarcelB. Roberfroid, Dietary Modulation of the Human Colonic Microbiota !Introducingthe Concept of Prebiotics, J. Nutr. 1995 125 :1401-1412 定义的。根据本发明使用的益生元没有特别的限制，包括促进肠道中的益生菌和/或健康的有益细菌生长的所有食物物质。优选的，可以选自寡糖，任选的含有果糖、半乳糖、甘露糖；膳食纤维，特别是可溶性纤维、大豆纤维；菊粉；或其混合物。优选的益生元是果糖寡糖(FOS)、半乳糖寡糖(GOS)、异麦芽糖寡糖(IMO)、木糖寡糖(XOS)、阿拉伯-木糖寡糖(AXOS)、甘露糖寡糖(MOS)、大豆的寡糖、葡萄糖基蔗糖(GS)、乳糖基蔗糖(LS)、半乳糖苷果糖(LA)、帕拉金糖(palatinose)寡糖(PAO)、麦芽寡糖、树胶和/或其水解产物、果胶、淀粉，和/或其水解产物。所有益生性微生物都可以与本发明描述的非复制性益生菌组合使用。优选例如添加的益生菌可以选自双歧杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属(Lactococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、链球菌属(Streptococcus)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、足球菌属(Pediococcus)、大肠杆菌(Escherichia coli)、德巴利酵母属(Debaryomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、酵母属(Saccharoymces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、接合酵母属(Zygosaccharomyces)、耶氏酵母属(Yarrowia)、假丝酵母属(Candida)，特别是选自长双歧杆菌、乳酸双歧杆菌、动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)、短双歧杆菌、婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)、两歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、副干酪乳杆菌、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、植物乳杆菌(Lactobacillus pi ant arum)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)、路氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、戈氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、鼠李糖乳杆菌、乳球菌物种例如乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、乳脂乳球菌(Lactococcuscremoris)、Lactococcus diacetylactis、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、幾肠球菌(Enterococcus faecalis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、布拉氏酵母(Saccharomyces boulardii)、栗酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、Yarrowia Iypolitica或其混合物，优选选自约氏乳杆菌(NCC533 ；CNCM 1-1225)、长双歧杆菌(NCC490 ；CNCM 1-2170)、长双歧杆菌(NCC2705 ；CNCM 1-2618)、长双歧杆菌(NCC3001 ；ATCC BAA-999)、乳酸双歧杆菌(NCC2818 ；CNCM 1-3446)、短双歧杆菌(NCC2950)、副干酪乳杆菌(NCC2461 ；CNCM 1-2116)、鼠李糖乳杆菌GG (ATCC53103)、鼠李糖乳杆菌LPR(NCC4007 ；CGMCC I. 3724)、屎肠球菌SF68(NCMB10415)，及其混合物。所有这些益生菌都可以添加复制性的或非复制性的形式。使用本发明制备的组合物可预计用于任何哺乳动物，优选预计用于人或宠物。例如，可计划用于免疫系统减弱的或暂时被抑制的对象，例如新生儿、老年人、经 受高压力条件的对象、服用免疫抑制药物的患者、处于放疗或化疗的患者。本发明的组合物还可以与疫苗共同施用，来增强疫苗的效率。共同施用包括在疫苗接种方案的3个月前、过程中，至2个月后，通过相同或不同的途径施用。本发明组合物施用的量足以至少部分的治疗免疫缺陷相关性疾病、感染及其病理性效应。足以实现此的量被定义为“治疗有效剂量”。对该目的有效的量取决于本领域技术人员已知的多种因子，例如疾病的本质和严重程度、患者的体重和一般状态，和使用的具体益生菌菌株。在预防性应用中，向易感或者有风险患免疫疾病或感染的患者施用根据本发明的组合物，施用的量足以至少部分的降低出现免疫疾病的风险。所述量定义为“预防有效量”。此外，精确的量取决于多种疾病和患者的具体因素，例如患者的健康状态和体重和所使用的细菌菌株的种类。本领域技术人员能够恰当的调节治疗有效量和/或预防有效量。一般而言，本发明的组合物含有治疗有效量和/或预防有效量的非复制性益生菌。典型的，治疗有效量和/或预防有效量是对应于约IO4至IO12Cfu/每日剂量的细菌质量。因此，治疗有效和/或预防有效剂量可以是在约O. 005mg-1000mg非复制性益生菌/每日剂量的范围内。就数量而言，组合物中存在的非复制性益生菌可以是对应于IO2至1012CfU/g干燥组合物的量。明显的是，非复制性细菌不形成集落；因此，该术语理解为从IO2至IO12Cfu/g复制性细菌获得的非复制性细菌的量。包括失活的或死亡的或以片段存在的细菌，例如DNA、细胞质内容物或细胞壁材料。换言之，组合物所含的细菌的量以所述量的细菌的集落形成能力来表述，如同所述细菌都是活的，而不论它们是否实际上是非复制的，例如失活的或死亡的、片段化的或任何或所有这些状态的混合物。优选的，益生菌存在的量等价于IO4至10lclcfu/g干燥组合物之间，更优选的存在的量等价于IO5至109cfu/g干燥组合物之间。组合物还可以含有营养上显著量的在日常膳食中被认为是必需的所有维生素和矿物质。已建立了某些维生素和矿物质的最低需求。任选的存在于组合物中的矿物质、维生素和其他营养物的实例包括维生素A、维生素BI、维生素B2、维生素B6、维生素B12、维生素E、维生素K、维生素C、维生素D、叶酸、肌醇、烟酸、生物素、泛酸、胆碱、钙、磷、碘、铁、镁、铜、锌、锰、氯、钾、钠、硒、铬、钥、牛磺酸和L-肉毒碱。矿物质通常以盐的形式添加。具体矿物质和其他维生素的存在和量将根据预计的消费者而改变。本发明的组合物可含有至少一种蛋白质源、至少一种碳水化合物源和至少一种脂类源。可以使用任何合适的膳食蛋白，例如动物蛋白(例如奶蛋白、肉蛋白和蛋蛋白)；植物蛋白(例如大豆蛋白、小麦蛋白、稻蛋白和豌豆蛋白)；这些蛋白质的部分或完全的水解产物，游离氨基酸的混合物；或其组合。如果需要水解的蛋白质，则可以根据需要和本领域已知的进行水解过程。奶蛋白和大豆蛋白是特别优选的，例如酪蛋白和乳清。关于乳清蛋白，蛋白质源可以基于酸乳清或甜乳清或其混合物，可以包括以任何需要的比例的α乳清蛋白和β乳球蛋白。然而优选的，特别是如果组合物是婴儿喂养配方，则蛋白质源是基于修饰的甜乳清。如果本发明的组合物含有蛋白质源，则组合物中的蛋白质或蛋白质等价物的量典型的在I. 6-7. 5g/100kcal组合物的范围内。特别是对营养配方而言，蛋白质源应该提供满足必需氨基酸含量的最低需求。如果组合物含有碳水化合物源，则使用的碳水化合物的种类没有特别的限制。可以使用任何合适的碳水化合物，例如蔗糖、乳糖、葡萄糖、果糖、玉米糖浆固形物、麦芽糊精、淀粉及其混合物。可以使用不同的碳水化合物源的组合。碳水化合物可优选的提供30%至80%的组合物能量。例如，组合物可包括9-18g/100kcal组合物的量的碳水化合物源。如果组合物含有脂类源，则使用的脂类的种类没有特别的限制。如果组合物包括脂类源，则脂类源可提供5%至70%的组合物能量。可以添加长链n-3和/或n-6多不饱和脂肪酸，例如DHA、ARA和/或EPA。可以使用芥花籽油、玉米油、高油酸向日葵油和中链甘油三酯油的掺合物获得合适的脂肪谱。组合物可以包含I. 5-7g/100kcal组合物的量的脂类源。还可以添加膳食纤维。可以是可溶的或不可溶的，一般优选是两种类型的掺合物。合适的膳食纤维源包括大豆、豌豆、燕麦、果胶、瓜尔胶、阿拉伯胶、果糖寡糖、半乳糖寡糖、唾液酰-乳糖和源自动物奶的寡糖。优选的纤维掺合物是菊粉与短链果糖寡糖的混合物。根据本发明的食品包括饮料，特别是基于奶或酸奶的饮料；奶产品例如酸奶、冰激凌或基于奶酪的产品；果汁和软饮料；营养配方，例如完全营养的，如用于婴儿、儿童、青少年、成人、老年人或垂危对象的；谷粒和压块干粮；基于奶的粉末，将溶解在水或基于奶的液体中的粉末、咖啡乳膏(coffee creamer)、汤、调味粉(spreading)。本发明的组合物包括非复制性益生菌。非复制性益生菌可选自乳杆菌属、双歧杆菌属或其组合，例如副干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、长双歧杆菌、乳酸双歧杆菌、短双歧杆菌或其组合，例如副干酪乳杆菌NCC2461、鼠李糖乳杆菌NCC4007、长双歧杆菌NCC3001、乳酸双歧杆菌NCC2818、短双歧杆菌NCC2950或其组合。可以通过热处理致使益生菌不复制，例如在约70_150°C的温度范围内约3分钟_2小时，优选在80-140°C的范围内5分钟-40分钟。可以以本领域已知的任何方式制备此类组合物。例如，如果所述组合物是营养配方，例如婴儿喂养配方，则可以通过以恰当的比例掺合蛋白质源、碳水化合物源和脂肪源来制备。使用时，掺合物中可包括乳化剂。此时可以添加维生素和矿物质，但通常是随后添加以避免热降解。任何亲脂性维生素、乳化剂等可以在掺合前溶解在脂肪源中。然后混入水，优选经过逆向透析的水，形成液体混合物。然后，可以热处理所述液体混合物，降低细菌负载。例如，可以快速加热液体混合物至约70-150°C的温度范围内约3分钟-2小时，优选在80-140°C的范围5分钟-40分钟。可以通过蒸汽注射或热交换器进行，例如平板式热交换器。然后，可以冷却液体混合物至约60°C至85°C ;例如通过闪蒸冷却(flashcooling)。然后，可以进一步冷却均质化的混合物，添加任何热敏感的组分；例如维生素和矿物质。此时，将均质的混合物的pH和固体含量进行常规的标准化。将均质的混合物转移至适当干燥的装置中，例如喷雾干燥器、冷冻干燥器或滚筒干燥器，并转化为粉末。粉末应该具有按重量计少于约5%的水含量。 可以根据本领域技术人员已知的任何合适的方法培养益生菌，并通过例如冷冻干燥或喷雾干燥制备成用于向营养组合物中添加的。然后，在热处理组合物以降低细菌负载之前，可以向组合物中添加益生菌。这将自动导致益生菌不复制。一般而言，使用非复制性益生菌具有这样的优点，即所述细菌可以在热处理步骤(例如灭菌步骤)前方便的加入到任何组合物中。此类灭菌可以通过长时间的温和热处理实现。以该方式，可以避免必须在加热步骤后向产物中添加细菌组合物，使得——与此同时——节省了一个生产步骤，并降低了在加热步骤后的细菌污染的风险。当然可选的，也可以单独热处理益生菌，然后作为非复制性益生菌添加到组合物中。添加产生健康益处的非复制性益生菌还允许热冲调粉末状的食物组合物。如果除所述组合物外还添加任何益生菌，则可以根据任何合适的方法培养选定的益生菌，并通过例如冷冻干燥或喷雾干燥制备成用于添加到组合物中的。可选的，细菌制品可以购自专业供应商已经制备成适合向食品中添加的合适形式。发明人在本文中首次描述了增加益生菌治疗或预防免疫缺陷相关疾病的效率的方法。方法涉及通过热处理致使至少一部分益生菌不复制。因此，本发明的一个实施方案是增加益生菌在施用后治疗或预防涉及受损免疫防御的疾病的效率的方法，所述益生菌选自例如乳杆菌属、双歧杆菌属或其组合，例如副干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、长双歧杆菌、乳酸双歧杆菌、短双歧杆菌或其组合，例如副干酪乳杆菌NCC2461、鼠李糖乳杆菌NCC4007、长双歧杆菌NCC3001、乳酸双歧杆菌NCC2818、短双歧杆菌NCC2950或其组合，包括步骤使益生菌经历致使至少一部分益生菌(例如双歧杆菌或乳杆菌)不复制的处理。该处理可以是热处理，例如在施用前，在约70_150°C的温度范围内约3分钟_2小时，优选在80-140°C的范围5分钟-40分钟。所述的益生菌处理，例如热处理，可以导致致使至少95%，优选至少97. 5%，更优选至少99%，最优选所有的益生菌不复制。本发明的方法可用于增加益生菌治疗或预防涉及受损免疫防御的疾病的效率。为了细菌制品改善的稳定性和改善的口感，可以在摄入组合物前将非复制性益生菌添加到预计消耗的组合物中。可以以该方式摄入包含非复制性益生菌的组合物，组合物的其他构件可用于使组合物适用于它的预计目的。可选的，方法可涉及向组合物中添加可复制的益生菌的步骤，然后在施用前使含益生菌的组合物经历致使至少一部分益生菌不复制的处理。本领域技术人员可理解，在不脱离所公开的本发明的范围内，他们可以自由的组合本文所述的本发明的所有特征。特别的是，描述用于本发明用途的特征可用于本发明的组合物和方法，反之亦然。根据下列实施例和附图，本发明的其他优点和特征是显而易见的。 图I显示了用热处理的细菌刺激的人PBMC在体外细胞因子分泌的增强。图2显示了在用生理盐水(阴性对照)刺激的OVA敏化小鼠、用0VA(阳性对照)刺激的OVA敏化小鼠、用OVA刺激并用热处理的或活的短双歧杆菌NCC2950处理的OVA敏化小鼠中观察到的腹泻强度的百分比。结果展示为腹泻强度的百分比(根据4次独立实验计算的均值土SEM)，阳性对照(用过敏原敏化和刺激的)组中出现的症状为100%腹泻强度。
实施例方法学细菌制品使用五种益生菌菌株探讨非复制性益生菌的免疫增强特性3种双歧杆菌(长双歧杆菌NCC3001、乳酸双歧杆菌NCC2818、短双歧杆菌NCC2950)和2种乳杆菌(副干酪乳杆菌NCC2461、鼠李糖乳杆菌NCC4007)。细菌细胞生长在MRS上，37°C分批发酵16-18h，不控制pH。为了达到约IOElOcfu/ml的终浓度，离心细菌细胞(5，000xg，4°C )，并在生理盐水中稀释前，重悬在磷酸盐缓冲的生理盐水中。长双歧杆菌NCC3001、乳酸双歧杆菌NCC2818、副干酪乳杆菌NCC2461、鼠李糖乳杆菌NCC4007在85°C水浴中热处理20分钟。短双歧杆菌NCC2950在90°C水浴中热处理30分钟。等分热处理的细菌悬浮液，并保持冷冻在_80°C下直到使用。活细菌储藏在PBS-甘油15%在-80°C下直到使用。细菌制品的体外免疫谱评估活的和热处理的细菌制品的免疫谱(即，在体外诱导人血细胞分泌特定细胞因子的能力)。从血液滤器中分离人外周血单核细胞(PBMC)。在通过细胞密度梯度分离后，收集单核细胞，并用Hank氏平衡盐溶液洗涤两次。然后将细胞重悬在补充了 10%胎牛血清(Bioconcept, Paris, france)、I % L-谷氨酰胺(Sigma)、I %青霉素 / 链霉素(Sigma)和
O.I %庆大霉素(Sigma)的Iscove修饰的Dulbecco培养基(IMDM,Sigma)中。然后，在48孔板中，用活的和热处理的细菌(等价于7xl06cfu/孔)孵育PBMS(7xl05细胞/孔)36h。在分为2个独立组、来自8个单独供体的PBMS中，测试活的和热处理的细菌的效应。在孵育36h后，冷冻培养板，保持在_20°C下直到测量细胞因子。对活细菌及其相应的热处理细菌，平行的(即，在相同批次的PBMC的相同实验中)实施细胞因子分型。根据生产商的说明，通过ELISA(R&D DuoSet 人 IL-10，BD OptEIA 人 IL12p40，BD OptEIA人TNF，BD OptEIA人IFN- y )确定孵育36h后的细胞培养上清液中的细胞因子(IFN-Y、IL-12p40、TNF-a 和 IL-10)的水平。IFN-Y、IL_12p40 和 TNF-a 是促炎性细胞因子，而IL-10是潜在的抗炎性介质。结果表示为4个供体的均值(pg/ml)+/-SEM，代表分别用4个供体实施的2组独立实验。活的和热处理的短双歧杆菌NCC2950在预防过敏性腹泻中的体内效应使用过敏性腹泻的小鼠模型测试短双歧杆菌NCC2950的Thl促进效应(BrandtE.B等人，JCI 2003 ；112(11) :1666-1667)。在敏化(以14天的间隔2次腹膜内注射卵清蛋白(OVA)和硫酸铝钾；第O和14天)后，雄性Balb/c小鼠用OVA 口服刺激6次(第27、29、32、34、36、39天)，导致暂时的临床症状(腹泻)和免疫参数改变(总IgE、OVA特异性IgE、小鼠肥大细胞蛋白酶I即MMCP-I的血浆浓度)。在OV A敏化前4天(第_3、-2、_1、0天和第11、12、13和14天)和刺激阶段的过程中(第23至39天)，管饲活的或90°C热处理30min的短双歧杆菌NCC2950。使用日常细菌剂量为约IO9集落形成单位(cfu)或等价的cfu/小鼠。结果在热处理后诱导“促炎性”细胞因子分泌在体外评估热处理的细菌菌株刺激人外周血单核细胞(PBMC)分泌细胞因子的能力。在相同的体外测定中，比较基于由热处理细菌刺激PBMC的四种细胞因子的免疫谱与由活细菌细胞诱导的免疫谱。将热处理的制品涂板，评估缺少任何可复制细菌的计数。在涂板后，热处理的细菌制品没有广生集落。当与人PBMC孵育时，活的益生菌诱导不同的和菌株依赖性的细胞因子生产水平(图I)。相比相应的活菌，热处理的益生菌修饰了 PBMC生产的细胞因子的水平。热处理的细菌比相应的活菌诱导了更多的促炎性细胞因子(TNF-α、IFN-Y、IL-12p40)。相反，热处理的细菌比活细胞诱导了相似或更低量的IL-10 (图I)。这些数据显示热处理的细菌比相应的活菌更能够刺激免疫系统，因此更能够增强减弱的免疫防御。换言之，体外数据示例了热处理后的细菌菌株的提高的免疫增强效应。为了示例热处理的短双歧杆菌NCC2950 (相比活细胞)对免疫系统提高的效应，在过敏性腹泻的动物模型中同时测试了活的和热处理的短双歧杆菌NCC2950。相比阳性对照组，用热处理的短双歧杆菌NCC2950治疗后，腹泻强度显著且持续的减少(41.1% ±4.8)，而用活的短双歧杆菌NCC2950治疗后，腹泻强度仅降低了20±28. 3%。这些结果证实，热处理的短双歧杆菌NCC2950表现出比其相应的活菌提高的抗过敏性腹泻的保护效应(图2)。结果显示，在热处理后改善了益生菌提高免疫防御的能力。打印输出(原始电子表格)(该页不作为国际申请的一部分并且不认为是国际申请页)


本发明一般涉及益生菌领域。特别的是，本发明涉及非复制性益生菌，例如乳杆菌属(Lactobacillus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)或其组合，例如副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、乳酸双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)或其组合，以及这类细菌的应用。本发明的一个实施方案涉及非复制性益生菌及其用于制备治疗或预防涉及受损免疫防御的疾病的组合物的用途。描述了增加益生菌治疗或预防免疫疾病的方法。